一種高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明以短小芽孢桿菌的漆酶基因cotA，構(gòu)建分泌表達(dá)載體pMA0911-CotA并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株WB600中，通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，在3L發(fā)酵罐中實現(xiàn)了高效分泌表達(dá)。該短小芽孢桿菌漆酶已被證明具有耐堿性環(huán)境和耐高溫的優(yōu)點，在工業(yè)印染廢水處理中具有重要應(yīng)用價值。
【專利說明】一種高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶（laccase，E. C. 1. 10. 3. 2)是一種含銅多酚氧化酶，能催化酚類物質(zhì)的氧化 還原反應(yīng)，在木質(zhì)素及其前體類似物的生物降解中發(fā)揮重要作用。漆酶的氧化底物極為廣 泛，包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶應(yīng)用潛力巨 大。在木材加工領(lǐng)域，漆酶能代替化學(xué)膠合劑，不但能提高產(chǎn)品質(zhì)量，而且能減輕對人體健 康的傷害及對環(huán)境的污染；在造紙工業(yè)中，漆酶用于紙張生物漂白和制漿，可減少制漿造紙 廠的污染，有助于造紙業(yè)最終實現(xiàn)清潔生產(chǎn)；在食品加工領(lǐng)域，漆酶可用于除去果汁中酚類 化合物引起的混濁，從而提高果汁的質(zhì)量。此外，漆酶還可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒 性，減少以氯酚類為工業(yè)原料生產(chǎn)染料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑等化工產(chǎn)品而造成的環(huán)境 污染。
[0003] 漆酶按來源不同可分為三大類：植物漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶。植物漆酶主要由 漆樹漆液分離而得。真菌漆酶來源更為廣泛（存在于多種擔(dān)子菌中），具單電子氧化還原電 位高、催化活性強(qiáng)等優(yōu)點，既能催化底物的氧化聚合又能對木質(zhì)素進(jìn)行催化降解，是一直以 來人們重點研究的漆酶種類。細(xì)菌漆酶則發(fā)現(xiàn)相對較晚，最初是1993年由Givaudan等人 首先在一種生脂固氮螺菌中鑒定出來的。隨后，科研人員又陸續(xù)在交替單胞菌、大腸桿菌、 假單胞菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、球形芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、極端耐堿芽孢桿菌、灰色鏈霉菌等 細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了不同種類的具漆酶活性的功能蛋白，如枯草/地衣/短小芽孢桿菌的CotA蛋 白、海單胞菌的PpoA蛋白、大腸桿菌的CueO蛋白、灰色鏈霉菌的EpoA蛋白等，這些細(xì)菌漆 酶與真菌漆酶蛋白結(jié)構(gòu)相似，都具有4個銅離子結(jié)合位點。
[0004] 由于真菌來源漆酶在工作環(huán)境pH偏堿性時活性非常低或幾乎沒有，熱穩(wěn)定性也 較差，且絲狀真菌生長周期長，培養(yǎng)基要求高，菌絲在發(fā)酵罐中易受到高剪切力的損傷，這 大大限制了真菌漆酶在工業(yè)上的應(yīng)用。研究揭示，細(xì)菌來源漆酶雖氧化活性普遍略低于真 菌來源漆酶，然而它們往往具有一些自身獨特的優(yōu)點：如無需糖基化修飾、熱穩(wěn)定性好、酶 活性的最適PH范圍廣等，這些性質(zhì)正是目前漆酶工業(yè)應(yīng)用所急需的。
[0005] 據(jù)最新資料統(tǒng)計，我國每年印染廢水排放量占總工業(yè)廢水排放量的35%，己成為 危害最大的重要污染源，大部分合成染料都難以被微生物降解。這些染料化合物通常被 用于紡織、食品、塑膠和生物醫(yī)學(xué)的著色劑，每年全世界商用染料使用達(dá)7X IO5噸，種類達(dá) IX IO4種，其中5?10%的染料都以工業(yè)污水形式排放出來。有色污水直接釋放到環(huán)境中， 許多染料在厭氧環(huán)境下可能轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)或致癌物質(zhì)，眾多國家相繼都頒布了嚴(yán)厲的法 規(guī)來限制工業(yè)染料污水的排放。由于染料自身特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用物理或化學(xué)法（凝結(jié)、 臭氧、活性炭）處理往往效果不佳，且還易造成二次污染。研究表明，生物法（使用漆酶、錳 過氧化物酶等）具有脫色率高、運行成本低、綠色環(huán)保的優(yōu)勢，是處理印染廢水的潛在有效 手段，是當(dāng)前印染廢水脫色研究的熱點。絕大多數(shù)排放的工業(yè)印染污水往往溫度很高且pH 值偏堿。在各類來源的漆酶中，真菌漆酶由于只在pH偏酸環(huán)境下具有較好的脫色效果，在 偏堿性條件下難以發(fā)揮作用，且耐熱溫度低于細(xì)菌漆酶，所以細(xì)菌漆酶憑借其獨特優(yōu)勢在 工業(yè)印染廢水處理中更具應(yīng)用潛力，是處理印染廢水的潛在生物利器。
[0006] 由于短小芽孢桿菌漆酶（cotA基因編碼）自身產(chǎn)量非常低，而大腸桿菌重組表 達(dá)系統(tǒng)只能在胞內(nèi)異源生產(chǎn)漆酶，兩者均達(dá)不到工業(yè)化應(yīng)用要求，因此采用枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)重組表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的基因工程菌 株，同時建立高產(chǎn)量發(fā)酵方法，具有重要應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的基因工 程菌，是將短小芽孢桿菌漆酶基因 cotA以pMA0911為表達(dá)載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構(gòu) 建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢桿菌是B. subtilis WB400、WB600或WB800中的一種。
[0008] 所述漆酶基因 cotA的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌是B. subtilis WB600。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的在于提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法，成功分泌表達(dá)了短 小芽孢桿菌漆酶蛋白，主要包括以下步驟= (I)PCR擴(kuò)增或化學(xué)合成cotA基因序列，（2) 將cotA基因與表達(dá)質(zhì)粒pMA0911(wapA)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA0911-CotA;(3)隨后將 pMA0911-CotA轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株WB600，篩選驗證獲得陽性轉(zhuǎn)化子。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，表達(dá)質(zhì)粒PMA0911自身信號肽替換為wapA信號肽。
[0012] 本發(fā)明的第三個目的在于提供應(yīng)用上述基因工程菌分泌生產(chǎn)漆酶的方法，主要包 括以下步驟：將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以5-8%接種量菌液轉(zhuǎn)入裝液量50% -60%的 發(fā)酵罐中，通氣量0. 8-1. Ovvm，攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng) 基成分為玉米淀粉12_24g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸銅0. ImM。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以5%接種量菌液轉(zhuǎn) 入裝液量I. 6L的3L發(fā)酵罐中，通氣量I. Ovvm，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)； 發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉18g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物12g/L，硫酸銅0. ImM。
[0014] 本發(fā)明還提供一種高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的方法，以重組表達(dá)了短小芽 孢桿菌來源的漆酶基因的枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)漆酶。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將cotA基因與表達(dá)質(zhì)粒pMA0911 (wapA)連接，構(gòu)建 重組質(zhì)粒pMA〇911-CotA，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株WB600,獲得重組菌；發(fā)酵培養(yǎng)基 成分為玉米淀粉12_24g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸銅0. ImM ;于37°C通 風(fēng)發(fā)酵。
[0016] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果：本發(fā)明首次以枯草芽孢桿菌為表達(dá)宿主，實現(xiàn) 了細(xì)菌漆酶的高效分泌表達(dá)，重組漆酶的表達(dá)量約占上清液總蛋白量的70%，酶活力約 380U/mL。是國際上已有報道的最高表達(dá)水平。目前利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)異源分泌表達(dá) 地衣芽孢桿菌漆酶，實現(xiàn)最大表達(dá)量為227. 9U/mL，僅為本發(fā)明的60%?？紤]細(xì)菌漆酶的附 加值，本發(fā)明表達(dá)水平已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMA0911-CotA圖譜。
[0018] 圖2為B. subtilis WB600基因工程菌分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的SDS-PAGE圖 譜。泳道1為對照組，轉(zhuǎn)化PMA0911空質(zhì)粒的發(fā)酵上清液總蛋白電泳圖；泳道2為實驗組， 轉(zhuǎn)化pMA0911-CotA重組質(zhì)粒的發(fā)酵上清液總蛋白電泳圖；泳道3為實驗組上清液經(jīng)過離子 交換層析純化之后的短小芽孢桿菌漆酶蛋白電泳圖；泳道M表示蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭 所指示的條帶為短小芽孢桿菌漆酶蛋白。
[0019] 圖3為B. subtilis WB600基因工程菌分泌表達(dá)產(chǎn)短小芽孢桿菌漆酶的發(fā)酵培養(yǎng) 基條件優(yōu)化實驗。（a):玉米淀粉濃度的優(yōu)化實驗顯示18g/L時漆酶產(chǎn)量最高；(b):蛋白胨 濃度的優(yōu)化實驗顯示l〇g/L時漆酶產(chǎn)量最高；（c):酵母抽提物濃度的優(yōu)化實驗顯示12g/L 時漆酶產(chǎn)量最高；(d):發(fā)酵溫度的優(yōu)化實驗顯示37°C時漆酶產(chǎn)量最高。
[0020] 圖4為利用上述摸索出的最優(yōu)發(fā)酵條件在3L發(fā)酵罐中（裝液量I. 6L)進(jìn)行發(fā)酵 生產(chǎn)短小芽孢桿菌漆酶。實驗顯示36h后結(jié)束發(fā)酵，漆酶產(chǎn)量最高。

【具體實施方式】
[0021] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。
[0022] 下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0024] 實施例1重組質(zhì)粒pMA0911_CotA的構(gòu)建
[0025] 短小芽孢桿菌cotA基因的序列如SEQ ID NO. 1所示，設(shè)計引物Gpll : (5' -TCAG GAGAATTCATGAACCTAGAAAAATTTGT-3，）和 Gp22 : (5，-ACTGAGGGATCCTTACTGGATGATATCCATC G-3')，利用PCR將漆酶基因 cotA的DNA編碼框5'和3'兩側(cè)分別引入EcoR I和BamH I II限制性酶切位點（下劃線表示）；通過雙酶切、分子連接等基因操作將漆酶基因插入到 表達(dá)質(zhì)粒pMA〇911 (wapA)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA0911_CotA(如圖1所示）。
[0026] 實施例2 SDS-PAGE分析B. subtilis WB600基因工程菌分泌表達(dá)的短小芽孢桿菌 漆酶蛋白。
[0027] 在卡那霉素濃度為50μ g/mL的LB培養(yǎng)基中接種基因菌單克隆，37°C、100r/min 培養(yǎng)過夜。隨后將100 μ L過夜培養(yǎng)的菌液接種于IOOmL(含50 μ g/mL卡那霉素與0. ImM 硫酸銅）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、200r/min搖床培養(yǎng)24h，隨后取出發(fā)酵液，8000r/min離心 IOmin得到上清液，即為粗酶液。進(jìn)一步利用離子交換層析法對粗酶液進(jìn)行分離純化。取粗 酶液和純化后的酶液進(jìn)行12 %的SDS-PAGE蛋白電泳（如圖2所示）。上述相關(guān)方法均采 用常規(guī)操作步驟。
[0028] 實施例3發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。
[0029] 對發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米淀粉、蛋白胨及酵母抽提物濃度進(jìn)行優(yōu)化實驗，并對發(fā)酵 最佳溫度進(jìn)行研究，如圖3所示，玉米淀粉濃度為18g/L時漆酶產(chǎn)量最高，達(dá)到280U/mL ;蛋 白胨濃度為l〇g/L、酵母抽提物濃度為12g/L、發(fā)酵溫度37°C時，漆酶產(chǎn)量可進(jìn)一步提高到 340U/mL 左右。
[0030] 實施例4利用摸索出的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行3L發(fā)酵罐規(guī)模的短小芽孢桿菌漆酶發(fā) 酵生產(chǎn)。
[0031] 重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，菌液轉(zhuǎn)入（5%接種量）3L發(fā)酵罐，裝液量I. 6L，發(fā) 酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉18g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物12g/L，硫酸銅0. ImM。通氣量 I. Ovvm，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)36h后發(fā)酵結(jié)束，此時發(fā)酵液中漆酶產(chǎn) 量最高，如圖4所示，約380U/mL。SDS-PAGE分析發(fā)酵上清液總蛋白顯示明顯特異表達(dá)條帶， 條帶分子量與預(yù)期大小分子量?65kD -致。在此條件下，重組漆酶的表達(dá)量約占上清液總 蛋白量的70%，全為可溶性活性狀態(tài)。
[0032] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的基因工程菌，其特征在于，是將短小芽孢桿 菌漆酶基因cotA以pMA0911為表達(dá)載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構(gòu)建得到的基因工程菌， 所述枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌WB400、WB600或WB800中的一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述漆酶基因cotA的序列如SEQ IDN0. 1 所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌是 B.subtilisffB600〇
4. 一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步 驟：（1)PCR擴(kuò)增或化學(xué)合成cotA基因序列，（2)將cotA基因與表達(dá)質(zhì)粒pMA0911連接，構(gòu) 建重組質(zhì)粒pMA〇911-CotA ; (3)將pMA0911-CotA轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，篩選驗證獲得陽性轉(zhuǎn) 化子。
5. 權(quán)利要求1-3任一所述基因工程菌在分泌生產(chǎn)漆酶中的應(yīng)用方法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，主要包括以下步驟：將重組菌用種子培養(yǎng) 基活化后，以5-8%接種量菌液轉(zhuǎn)入裝液量50% -60%的發(fā)酵罐中，通氣量0.8-1. Ovvm，攪 拌轉(zhuǎn)速300-400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉12-24g/L，蛋白 胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸銅0. ImM。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以5 %接 種量菌液轉(zhuǎn)入裝液量1. 6L的3L發(fā)酵罐中，通氣量1. Ovvm，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，pH不作控 制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉18g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物12g/L，硫酸銅 0? ImM。
8. -種高效分泌表達(dá)短小芽孢桿菌漆酶的方法，其特征在于，以重組表達(dá)了短小芽孢 桿菌來源的漆酶基因的枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)漆酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將cotA基因與表達(dá)質(zhì)粒pMA0911連接，構(gòu) 建重組質(zhì)粒pMA〇911-CotA，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株WB600,獲得重組菌；發(fā)酵培養(yǎng) 基成分為玉米淀粉12_24g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸銅0. ImM ;于37°C 通風(fēng)發(fā)酵。
【文檔編號】C12N1/21GK104388370SQ201410712849
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】管政兵, 廖祥儒, 蔡宇杰, 水燕, 宋晨萌 申請人:江南大學(xué)