一種高產(chǎn)n-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用方法
【專利摘要】一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用方法，屬于遺傳工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明是通過對大腸桿菌中已有的代謝途徑進(jìn)行修飾和改造，阻斷 N -乙酰氨基葡萄糖及其副產(chǎn)物分解和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，同時(shí)引入外源的氨基葡萄糖乙?；富?，在宿主內(nèi)形成從葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的完整合成途徑，構(gòu)建的工程菌株能利用葡萄糖或甘油為底物，通過好氣發(fā)酵培養(yǎng)合成 N -乙酰氨基葡萄糖，以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用方法，屬于遺傳工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]斧乙酰氨基葡萄糖是一種葡萄糖的衍生物，在人體內(nèi)具有多種生理功能，主要作為軟骨、關(guān)節(jié)處的潤滑液的主要成分而對骨關(guān)節(jié)的健康起著十分重要的作用。通過補(bǔ)充外源的氨基葡萄糖和N~乙酰氨基葡萄糖對于治療中老年關(guān)節(jié)疾病，緩解關(guān)節(jié)疼痛在歐美國家已作為常用的方法而得到廣泛的應(yīng)用。此外，斧乙酰氨基葡萄糖還廣泛應(yīng)用于嬰兒食品添加、化妝品和飼料添加等方面，用途十分廣泛。
[0003]目前斧乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)是通過氨基葡萄糖和乙酸酐經(jīng)化學(xué)縮合反應(yīng)而成，其主要原料氨基葡萄糖主要是通過用鹽酸或硫酸水解蝦蟹外殼而生產(chǎn)得到。在氨基葡萄糖的生產(chǎn)過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的含鹽酸(或硫酸)乙酸的工業(yè)廢水，給環(huán)境帶來很大的壓力。因此利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)斧乙酰氨基葡萄糖成為國內(nèi)外近幾年研究的熱點(diǎn)。
[0004]大腸桿菌以其培養(yǎng)簡單，遺傳操作成熟，而被用作多種發(fā)酵產(chǎn)品的首選宿主。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)斧乙酰氨基葡萄糖的菌種改造通常根據(jù)大腸桿菌現(xiàn)有的氨基葡萄糖相關(guān)代謝途徑，利用代謝工程進(jìn)行修飾改造，以實(shí)現(xiàn)能利用簡單的葡萄糖或甘油等碳源，經(jīng)在大腸桿菌體內(nèi)多步酶促反應(yīng)，最終合成N~乙酰氨基葡萄糖。目前國內(nèi)外構(gòu)建N~乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)菌株一般都通過引入6-磷酸氨基葡萄糖乙?；傅酱竽c桿菌中表達(dá)，從而將體內(nèi)代謝生成的6-磷酸氨基葡萄糖合成為N~乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖，進(jìn)而脫去磷酸根，最終形成斧乙酰氨基葡萄糖。本發(fā)明嘗試通過引入不同于現(xiàn)有公開的技術(shù)手段的酶在大腸桿菌中表達(dá)，架構(gòu)不同的代謝途徑，并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中同樣高產(chǎn)斧乙酰氨基葡萄糖的目的。另外，現(xiàn)有N~乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)的大腸桿菌菌株中，為了阻止斧乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物在體內(nèi)的回流和降解，通過敲除大腸桿菌中因簇來實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明中只敲除個(gè)基因，保留了其中的兩個(gè)基因，以達(dá)到盡量避免對大腸桿菌體內(nèi)基因的過多改動(dòng)和敲除且能同樣實(shí)現(xiàn)阻止斧乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物在體內(nèi)的回流和降解的目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用方法，該高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌可通過RED重組實(shí)現(xiàn)基因的敲除進(jìn)而達(dá)到代謝途徑的阻斷，通過外源基因表達(dá)架構(gòu)起新的代謝途徑。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:該高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌，所述大腸桿菌是通過將編碼氨基葡萄糖乙?；富蚝途幋a6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)氪竽c桿菌過量表達(dá)，并敲除大腸桿菌中的斧乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物分解代謝和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一系列酶構(gòu)建而成。
[0007]所述氨基葡萄糖乙?；甘悄艽呋被咸烟呛鸵阴］o酶A生成斧乙酰氨基葡萄糖的酶。
[0008]所述氨基葡萄糖乙?；竵碓从诒〈妓缶?Clostridiumacetobutylicuni)或能表達(dá)相同功能酶的微生物；所述氨基葡萄糖乙?；傅幕颢@得是根據(jù)GenBank N0.AE001437.1中的CA_C0184基因序列全基因合成，或利用丙酮丁醇梭菌的基因組DNA為模板通過PCR擴(kuò)增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。
[0009]所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶是能催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺生成6-磷酸氨基葡萄糖的酶。
[0010]所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶來源于大腸桿菌或具有相同功能酶的微生物；
6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的基因獲得可根據(jù)GenBank N0.NC_007779的大腸桿菌W3110基因組序列，經(jīng)全基因合成得到，或利用大腸桿菌基因組DNA為模板通過PCR擴(kuò)增獲得。
[0011]所述大腸桿菌中的N~乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物分解代謝和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一系列酶包括十乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脫乙酰酶，6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶，十乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
[0012]所述N~乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脫乙酰酶由基因編碼，6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶由成基因編碼，斧乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由放基因編碼，甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由fflaaJK基因族編碼。
[0013]所述敲除大腸桿菌中的N~乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物分解代謝和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一系列酶的基因，是通過RED重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。
[0014]優(yōu)選的，所述丙酮丁醇梭菌為菌株ATCC 824。
[0015]該高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，具體操作如下:在大腸桿菌BL21 (DE3)中，敲除基因簇和基因簇，將基因分別克隆到同一表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入敲除了 nagABmW基因簇的大腸桿菌中，即得。
[0016]該高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的應(yīng)用方法，其特征在于:利用所述高產(chǎn)斧乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)N~乙酰氨基葡萄糖，以葡萄糖或甘油為碳源，酵母粉或酵母膏為有機(jī)氮源，氨水為無機(jī)氮源，通氣好氧發(fā)酵而實(shí)現(xiàn)。
[0017]本發(fā)明技術(shù)方案說明如下:
所述高產(chǎn)N~乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌中，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代謝途徑為:葡萄糖經(jīng)因編碼的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)，生成6-磷酸葡萄糖，經(jīng)基因編碼的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化生產(chǎn)6-磷酸果糖，再經(jīng)基因編碼的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶催化生產(chǎn)6-磷酸氨基葡萄糖，再經(jīng)磷酸化酶催化脫磷酸生成氨基葡萄糖，再經(jīng)基因編碼的氨基葡萄糖乙酰化酶催化生成N~乙酰氨基葡萄糖，并分泌到細(xì)胞外。具體可見圖1所
/Jn ο
[0018]所述氨基葡萄糖乙酰化酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)氪竽c桿菌表達(dá)，可將這兩個(gè)基因克隆到表達(dá)載體上后，以質(zhì)粒的方式在大腸桿菌中表達(dá)。
[0019]所述基因/?鄉(xiāng)4、似淡和似放在大腸桿菌BL21 (DE3)中以基因簇連鎖存在，可一次性全部敲除。
[0020]所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。大腸桿菌BL21 (DE3)用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體(如pET系列)的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。大腸桿菌BL21(DE3)基因型:F_, ompT, hsdS (rBB-mB—) , gal, dcm (DE3)。
[0021]Red/ET重組是新近出現(xiàn)的一種基于λ噬菌體Red操縱子(Red a/Red β/Red Y )和Rac噬菌體RecE/RecT重組系統(tǒng)的DNA工程技術(shù)。
[0022]GenBank是美國國立衛(wèi)生研究院維護(hù)的基因序列數(shù)據(jù)庫，匯集并注釋了所有公開的核酸序列。
[0023]甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，屬于大腸桿菌特異性的PTS系統(tǒng)。大腸桿菌至少有15種特異性的PTS系統(tǒng)，分別負(fù)責(zé)葡萄糖、甘露糖、甘露醇、果糖、纖維二糖、海藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、β-葡萄糖苷等PTS糖類的轉(zhuǎn)運(yùn)和活化。對于麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘油、蜜二糖等無PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的糖類，大腸桿菌只能通過糖特異性的透性酶運(yùn)輸。其他細(xì)菌也都存在這兩種運(yùn)輸機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)不同糖類。
[0024]PCR擴(kuò)增為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸的反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用方法所具有的有益效果是:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌可以利用葡萄糖或甘油合成高水平斧乙酰氨基葡萄糖。本發(fā)明通過在大腸桿菌中架構(gòu)一條新的高產(chǎn)Ν~乙酰氨基葡萄糖的代謝通路(如圖1所示)，加強(qiáng)Ν~乙酰氨基葡萄糖合成途徑中的限速酶基因表達(dá)，同時(shí)，阻斷斧乙酰氨基葡萄糖消耗和轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑，使得工程菌株能積累高濃度的十乙酰氨基葡萄糖。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明所構(gòu)建的高水平Ν~乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)工程菌株的代謝相關(guān)途徑。

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合圖1與具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅僅限于此。
[0028]以下實(shí)施例中未注明具體條件的基因操作方法均按照常規(guī)條件，具體可參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》(薩姆布魯克J，拉塞爾D W.著，黃培堂，譯.)所述條件進(jìn)行。
[0029]實(shí)施例中所用RED重組操作過程及質(zhì)粒pKD3，pKD4和pCP20詳情可參照文獻(xiàn) Datsenko KA, Wanner BL.0ne-step inactivat1n of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products, Proc Natl Acad Sci USA.2000 Jun6;97 (12):6640-5.實(shí)施例1
本實(shí)施例為作為宿主的大腸桿菌基因簇的敲除，具體操作如下:
I)根據(jù)大腸桿菌BL21 (DE3)基因組(Genbank N0.CP001509)序列中的從基因簇及其上下游序列，設(shè)計(jì)引物:上游引物nag-Sl:
CTATCTGAGCTTGTCCGCCTGGTGTCATACTTTCTCTTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCCSEQ ID N0.1所示)和下游引物nag-Al:TGCGACGCTCAAGCGTCGCATCAGGCATAAAGCAGATTATGGGAATTAGCCATGGTCC (SEQ ID N0.2 所示)。
[0030]利用引物nag-Sl 和 nag-Al，以質(zhì)粒 pKD3 (GenBank: AY048742.1)為模板，經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增得到DNA片段，純化備用。
[0031]2)將上述片段電轉(zhuǎn)化含有重組質(zhì)粒pKD46且加阿拉伯糖誘導(dǎo)過的的大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用Red同源重組技術(shù)敲除BL21 (DE3)中的從基因簇，篩選獲得氯霉素抗性的nagABE矢話的菌株BL21 (DE3 ) / Λ nagABE:: Cm。
[0032]實(shí)施例2
本實(shí)施例為大腸桿菌宿主的皿/^?2基因簇的敲除，具體操作如下:
I)根據(jù)大腸桿菌BL21 (DE3)基因組(Genbank N0.CPOO1509)序列中的胍/?刀2基因簇及其上下游序列，設(shè)計(jì)引物:上游引物man-Sl:
ACGTTGAGGTGTTAACGATAATAAAGGAGGTAGCAAGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCCSEQ ID N0.3所示)和下游引物man-Al:
AACGGGGCCAAAAGGCCCCGGTAGTGTACAACAGTCTTAATGGGAATTAGCCATGGTCCCSEQ ID N0.4所示)；利用引物man-Sl和man-Al，以質(zhì)粒pKD4 (GenBank: AY048743.1)為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到DNA片段，純化備用。
[0033]2)將上述片段電轉(zhuǎn)化含有重組質(zhì)粒PKD46且加阿拉伯糖誘導(dǎo)過的的大腸桿菌BL21 (DE3)/AnagABE::Cm感受態(tài)細(xì)胞中，利用Red同源重組技術(shù)敲除BL21 (DE3)/AnagABE:: Cm中的基因簇，利用卡那霉素篩選得到nagABE^都失活的菌株BL21 (DE3 ) / Δ nagABE:: Cm/ Δ manXYZ:: Kan。
[0034]實(shí)施例3
本實(shí)施例為將實(shí)施例2所獲得的菌株BL21 (DE3)/AnagABE:: Cm/AmanXYZ::Kan中抗性基因消除，具體操作如下:
1)制備BL21 (DE3)/AnagABE::Cm/AmanXYZ::Kan 感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化 pCP20 質(zhì)粒，在30度氨芐青霉素、卡那霉素和氯霉素三抗平板上篩選正確的轉(zhuǎn)化子。
[0035]2)將上述轉(zhuǎn)化子在無抗LB平板上劃線，42°C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。
[0036]3)挑取單菌落分別點(diǎn)接到無抗LB平板，和卡那霉素、氯霉素雙抗平板，選擇在雙抗平板上不能生長的單菌落即為消除了卡那霉素和氯霉素抗性的菌BL21(DE3 VAnagABE/AmanXYZ0
[0037]實(shí)施例4
本實(shí)施例為對實(shí)施例3所獲得的消除了卡那霉素和氯霉素抗性的菌BL21 (DE3)/Δ nagABE/ AmanXYZ進(jìn)行基因雙表達(dá)載體pETDuet-glmS-glmA的構(gòu)建,具體操作如下:
O根據(jù)大腸桿菌W3110基因組序列(GenBank N0.NC_007779)設(shè)計(jì)引物，正向引物glmS-Sl:ctggatccgatgtgtggaattgttggcgcg (SEQ ID N0.5 所不)和反向引物 glmS-Al:catgagctcttactcaaccgtaaccgattttgc (SEQ ID N0.6所不)，該引物中的兩端增加了 ifeMlI 和Sacl位點(diǎn)；
2)以大腸桿菌W3110(美國大腸桿菌遺傳保藏中心，The E.coli genetic stockcenter, CGSC)基因組為模板，擴(kuò)增獲得基因，利用BrnEl和feci兩個(gè)限制酶克隆到表達(dá)載體pETDuet-1 (Novagen公司)上，得到表達(dá)載體pETDuet-glmS ；
3)根據(jù)基因序列(GenBankN0.AE001437.1中的CA—CO 184)全基因合成基因，兩端加Bglll和ZkI位點(diǎn)，起始密碼子前加A堿基，以保證正確的讀碼框，具體序列如下所示(SEQ ID N0.7):
AGATCTAatggaaattaaagagacatatgattttagtagcattgtagatttgtggaataaaaacataggtacagtgtatccgatgaatttagaactttttaagcaaaactatattaatgataggcaaagaaaaaaaataatgggtgcttttaatggtgaaatactaataggctttgttatatataaacagtggacatataaaagtggatctttaaagcccaaccataagataggatatataaattcaatcatagtggatataaactttaggcatcaagggataggaactaagttattagatgctgctgaagaggaattaatcaattcgggagttaaaatacttcgttgtggtagtgacacctatcacttttttcctggaatacctttagaatgtttaccttcggaagagttttttttagttagaggttataaaatgcaagactatttttatgatttaataggagatgtatctaaagtggattttaaaaaaccttctataaaagatggttttaaggttaatgtaatgaagccagaagataggaaggggctctttgaatttttagaaaaaagctttagtggaagatggcttgaagaatttattgaattttttcaggtaggaatgaaggaaagagatattgtacttataaagtataagacctctgttattgggttctcacatatatatgataacaaaagtagttttataggtccgcctatatattggaaagcattacttgggcataactacggtggtttaggacctatagggatagacaagacatatagaaaacaagggcttgggaggcttttgctatacgaatcactacagattttgaaaaaaagagaagttaagaaaatggttatagattggactgaaaaagatattataaatttttatggaaggtttaattttatgccttggaaagcatatagaaaagcaaccaaagaggtaaaagatggcaagggttaaCTCGAG ；
4)利用Bglll和Z如I兩個(gè)限制酶克隆到表達(dá)載體pETDuet-glmS上，得到雙表達(dá)載體pETDuet-glmS-glmAo
[0038]實(shí)施例5
本實(shí)施例為基因雙表達(dá)載體pACYCDuet-glmS-glmA的構(gòu)建，具體操作如下:
采用低拷貝的pACYO)uet-l(Novagen公司)質(zhì)粒作為克隆貧7?5^卩基因的載體,其他方法及過程同實(shí)施例4,用氯霉素平板篩選,最終得到雙表達(dá)載體pACY⑶uet-glmS-glmA。
[0039]實(shí)施例6
本實(shí)施例為高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建，具體操作如下:
1)將上述構(gòu)建完成的質(zhì)粒pETDuet-glmS-glmA提取后，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)/Δ nagABE/Δ manXYZ宿主內(nèi)，用氨芐青霉素平板篩選，得到最終的基因工程菌BL21 (DE3) / Λ nagABE/AmanXYZ/pETDuet-glmS-glmA,命名為:
BL21 (DE3) /Δ nagABE/ Δ manXYZ/pETDuet-glmS-glmA-01 ；
2)將上述構(gòu)建完成的質(zhì)粒pACYCDuet-glmS-glmA提取后，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3) /Δ nagABE/ Δ manXYZ宿主內(nèi)，用氯霉素平板篩選，得到最終的基因工程菌BL21 (DE3 ) /Δ nagABE/ AmanXYZ/pACYCDuet-glmS-glmA,命名為:
BL21 (DE3) /Δ nagABE/ Δ manXYZ/pACYCDuet-glmS-glmA-02。
[0040]實(shí)施例7
本實(shí)施例為高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的應(yīng)用方法的【具體實(shí)施方式】，對實(shí)施例6 中所獲得的 BL21 (DE3) / Δ nagABE/ ΔmanXYZ/pETDuet-glmS-glmA-01 和 BL21 (DE3) /Δ nagABE/ Δ manXYZ/pACYQ)uet-glmS-glmA-02分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體操作如下:
I)種子和發(fā)酵培養(yǎng)基: 培養(yǎng)基容量為IL，含有K2HPO4.3H20 21g，酵母提取物(購自O(shè)XOID公司)5g，硫酸銨7.5g,朽1檬酸鈉5g, MgSO4.7H20 0.25g，葡萄糖10g，微量元素1ml ;補(bǔ)料液為500g/L葡萄糖；
其中，微量元素組成和濃度為:硫酸錳100 mg/L，氯化鋅70 mg/L，鑰酸鈉35 mg/L，硼酸60 mg/L，氯化鈷 200 mg/L，硫酸銅 29.28 mg/L，氯化鎳 25 mg/L，濃鹽酸(37%) 0.9 ml/L ；
2)發(fā)酵過程:
過夜培養(yǎng)種子液，轉(zhuǎn)接至5L發(fā)酵罐中，37 0C，攪拌速度300~800轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧保持在30 %以上，用氨水控制pH在6.9 ;葡萄糖耗完后，開始以6g/L.h的速度補(bǔ)加葡萄糖；發(fā)酵液菌體0D6(i(i=20~25時(shí)加入終濃度為0.2 mM的IPTG，至結(jié)束發(fā)酵。
[0041]實(shí)施例8
本實(shí)施例為對實(shí)施例7所獲得的發(fā)酵液中N-乙酰氨基葡萄糖濃度的測定，具體操作如下:
將發(fā)酵液稀釋至合適倍數(shù)后，采用HPLC檢測，檢測條件如下:
色譜柱:B1_Rad AMINEX HPX 87H Organic Analysis Column (300X 7.8 mm)；
柱溫:60 °C ；
流動(dòng)相是6mM硫酸,流速是0.6 ml/min ；
檢測波長:210 nm ；
經(jīng)檢測，80 小時(shí)發(fā)酵后，BL21 (DE3) / Δ nagABE/ ΔmanXYZ/pETDuet-glmS-glmA-01 的發(fā)酵液中斧乙酰氨基葡萄糖濃度可達(dá)61g/L以上，BL21 (DE3)/AnagABE/AmanXYZ/pACYCDuet-glmS-glmA-02的發(fā)酵液中N~乙酰氨基葡萄糖濃度可達(dá)83g/L以上。
[0042]以上培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)代謝工程技術(shù)構(gòu)建的兩株大腸桿菌具有高產(chǎn)斧乙酰氨基葡萄糖的能力，具備了工業(yè)化的潛力。
[0043]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述大腸桿菌是通過將編碼氨基葡萄糖乙?；富蚝途幋a6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)氪竽c桿菌過量表達(dá)，并敲除大腸桿菌中的斧乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物分解代謝和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一系列酶構(gòu)建而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述氨基葡萄糖乙?；甘悄艽呋被咸烟呛鸵阴］o酶A生成斧乙酰氨基葡萄糖的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述氨基葡萄糖乙酰化酶來源于丙酮丁醇梭菌或能表達(dá)相同功能酶的微生物；所述氨基葡萄糖乙?；傅幕颢@得是根據(jù)GenBank N0.AE001437.1中的CA_C0184基因序列全基因合成，或利用丙酮丁醇梭菌的基因組DNA為模板通過PCR擴(kuò)增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶是能催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺生成6-磷酸氨基葡萄糖的酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶來源于大腸桿菌或具有相同功能酶的微生物；6_磷酸氨基葡萄糖合成酶的基因獲得可根據(jù)GenBank N0.NC_007779的大腸桿菌W3110基因組序列，經(jīng)全基因合成得到，或利用大腸桿菌基因組DNA為模板通過PCR擴(kuò)增獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述大腸桿菌中的N~乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物分解代謝和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一系列酶包括斧乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脫乙酰酶，6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶，斧乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述斧乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脫乙酰酶由基因編碼，6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶由因編碼，N~乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由/7<3放基因編碼，甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由manXYZ^因族編碼。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述敲除大腸桿菌中的N~乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物分解代謝和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一系列酶的基因，是通過RED重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，具體操作如下:在大腸桿菌BL21 (DE3)中，敲除基因簇和因簇，將glmSm 基因分別克隆到同一表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入敲除了 nagABEm 基因簇的大腸桿菌中，即得。
10.一種權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的應(yīng)用方法，其特征在于:利用所述高產(chǎn)N~乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)N~乙酰氨基葡萄糖，以葡萄糖或甘油為碳源，酵母粉或酵母膏為有機(jī)氮源，氨水為無機(jī)氮源，通氣好氧發(fā)酵而實(shí)現(xiàn)。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104498517SQ201410702685
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月29日
【發(fā)明者】魏哲 申請人:濱州市金朗生物科技有限公司