本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地涉及一種米糠蛋白的提取方法，尤其涉及一種兩步酶解提取米糠蛋白的方法。

背景技術(shù)：

米糠是大米加工過程中的一種重要的副產(chǎn)物，我國盛產(chǎn)稻米，因此米糠資源也非常豐富。米糠中含有豐富的膳食纖維、蛋白質(zhì)、淀粉、維生素、肌醇等營養(yǎng)物質(zhì)。其中蛋白質(zhì)在米糠中的含量高達12％～16％。米糠蛋白含有的人體必需氨基酸比較齊全，生物效價高。營養(yǎng)價值甚至可以與雞蛋蛋白相媲美，并且，米糠蛋白具有低過敏性的特點，被廣泛應用于嬰幼兒食品中。

盡管米糠蛋白具有優(yōu)異的營養(yǎng)性，但是其蛋白產(chǎn)品卻很難商業(yè)化，原因主要包括：(1)米糠蛋白中的四種蛋白溶解性差異大，很難通過單一溶劑獲得高純度的蛋白產(chǎn)品；(2)蛋白分子之間含有大量的二硫鍵，導致蛋白的溶解性很差，給提取增加了難度；(3)米糠中豐富的植酸鹽、半纖維素和纖維素與蛋白緊密結(jié)合在一起，增加了提取難度，影響了蛋白純度。從上世紀60年代起，國外研究者就開始了對米糠蛋白提取的研究，主要的提取方法有堿法提取、酶法提取以及物理法提取。堿法是提取米糠蛋白最常見的一種方法，堿能夠作用于蛋白分子間的氫鍵、酰胺鍵和二硫鍵，使更多的蛋白分子溶出，并且堿法提取簡單易操作。但是此方法獲得的蛋白產(chǎn)品風味和色澤不理想，提取時使用高濃度的堿產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，還會引起營養(yǎng)物質(zhì)的損失；物理法被廣泛應用于大米胚乳蛋白的分離、大豆蛋白分離等蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)上。但是米糠蛋白的特別之處在于其蛋白分子與植酸、纖維素等通過化學鍵緊密的結(jié)合在一起，這種結(jié)構(gòu)很難通過物理方法破壞，并且物理提取設(shè)備投資大且工藝復雜；目前來看，酶法是生產(chǎn)高品質(zhì)蛋白的最佳方法。生物酶法提取米糠蛋白具有條件溫和，對蛋白的影響小，而且降解后的多肽具有一定的生理活性，在增大蛋白溶解性的同時，還能改善發(fā)泡，乳化等性能。但是僅用蛋白酶提取的方法會導致蛋白的提取率和純度都較低。這是因為米糠蛋白不僅有大量的分子間的二硫鍵，同時還與米糠中的淀粉、纖維素等組分形成共價鍵。這些結(jié)構(gòu)大大阻礙了蛋白酶的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種兩步酶解提取米糠蛋白的方法，該方法操作簡單，重復性好，可以大大提高米糠蛋白的提取率以及純度。

根據(jù)本發(fā)明的一種兩步酶解提取米糠蛋白的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)取去除淀粉后的米糠渣，加入蒸餾水調(diào)漿，米糠渣占蒸餾水重量的5％-20％(料液比)，用質(zhì)量百分比濃度為10％的鹽酸調(diào)至pH為4.5-6.5以及溫度為45℃-65℃，加入細胞破壁酶，基于漿料的總重量，加入細胞破壁酶的量為0.05％-0.25％，反應1h-5h后，得到經(jīng)過預處理后的漿料(醪)。

(2)將上述步驟(1)中得到的漿料直接加入蒸餾水重新進行調(diào)漿至米糠渣的濃度為8％-12％，并用質(zhì)量百分比濃度為30％的氫氧化鈉重新調(diào)節(jié)pH為6.5-9.0及溫度為60℃-95℃，無需其他處理加入堿性蛋白酶，基于漿料的總重量，堿性蛋白酶的用量為1.0％-3％，反應1h-6h后，離心分離，取上清液并冷凍干燥，即可得到蛋白產(chǎn)品。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的調(diào)漿后的料液比為10％-13％，進一步優(yōu)選為12％。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的加入細胞破壁酶的量為0.15％-0.25％，進一步優(yōu)選為0.2％。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的pH為5.0-6.5，進一步優(yōu)選為6。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的溫度為55℃-65℃，進一步優(yōu)選為60℃。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的反應時間為2h-4h，進一步優(yōu)選為3h。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述再次調(diào)漿的醪濃度為9％-11％，進一步優(yōu)選為10％。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述的堿性蛋白酶的用量為1.5％-2.5％，進一步優(yōu)選為2.11％。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述的再次調(diào)漿的pH為8.0-9.0，進一步優(yōu)選為8.5。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述的溫度為85℃-90℃，進一步優(yōu)選為88℃。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述的反應時間為1h-3h，進一步優(yōu)選為2h。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述的離心轉(zhuǎn)速為3000rpm-8000rpm，優(yōu)選為4000rpm-6000rpm，進一步優(yōu)選為5000rpm。

根據(jù)本發(fā)明的所述兩步酶解提取米糠蛋白方法中步驟1)得到的漿料無需其他處理，可以直接用于步驟2)中，無需例如過濾，蒸餾等除酶或其他成分的工藝。

而且，根據(jù)本發(fā)明的所述兩步酶解提取米糠蛋白方法中無需加入堿或酸等反應物進行反應，所述堿包括無機堿或有機堿，所述酸包括無機酸或有機酸。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明的兩步酶解提取米糠蛋白方法與其他的酶法提取相比，本方法能夠充分的提高米糠蛋白的提取率。由于米糠蛋白含有較多的二硫鍵，并且與米糠中的植酸、纖維素等等聚集在一起，單酶提取很難獲得較高的提取率。本發(fā)明的發(fā)明人在蛋白酶提取米糠蛋白之前使用細胞破壁酶對米糠細胞進行破壁。細胞破壁酶不僅能夠降解米糠細胞壁的纖維素骨架，使鑲嵌在細胞壁中的蛋白脫落下來，同時也能使植物細胞壁崩潰，釋放細胞中的蛋白質(zhì)，沒有了細胞壁的阻隔，隨后加入的蛋白酶能夠?qū)Φ鞍走M行充分的酶解，極大的增加了米糠蛋白的提取率。雙酶法提取米糠蛋白的方法為工業(yè)上提取米糠蛋白提供了理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為醪濃度對復合纖維素酶作用效果影響的對比圖；

圖2為溫度對堿性蛋白酶作用效果影響的對比圖；

圖3為pH對堿性蛋白酶作用效果影響的對比圖。

具體實施方式

以下，將詳細地描述本發(fā)明。在進行描述之前，應當理解的是，在本說明書和所附的權(quán)利要求書中使用的術(shù)語不應解釋為限制于一般含義和字典含義，而應當在允許發(fā)明人適當定義術(shù)語以進行最佳解釋的原則的基礎(chǔ)上，根據(jù)與本發(fā)明的技術(shù)方面相應的含義和概念進行解釋。因此，這里提出的描述僅僅是出于舉例說明目的的優(yōu)選實例，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，從而應當理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以由其獲得其他等價方式或改進方式。

以下實施例僅是作為本發(fā)明的實施方案的例子列舉，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在不偏離本發(fā)明的實質(zhì)和構(gòu)思的范圍內(nèi)的修改均落入本發(fā)明的保護范圍。除非另有說明，以下實施例中使用的反應物均為市售產(chǎn)品。

實施例1

(1)復合纖維素酶的作用：將10g去淀粉和植酸后的殘渣加入73g水調(diào)漿至12％醪濃度(醪濃度＝物料質(zhì)量/(物料質(zhì)量+蒸餾水質(zhì)量))，加入占漿料重量0.2％的復合纖維素酶(細胞破壁酶)，質(zhì)量百分比濃度為10％的鹽酸調(diào)至pH＝6，在溫度60℃條件下反應3h，即可得到經(jīng)過預處理后的漿料。

為了判定復合纖維素酶的預處理效果，可以將漿料抽濾，所得到的濾液進行冷凍干燥之后，測定其蛋白含量，以蛋白的提取率判定復合纖維素酶的作用效果，結(jié)果如圖1所示，步驟(1)的蛋白提取率為6％。

(2)堿性蛋白酶的作用：將步驟(1)中得到的漿料重新加入17g水調(diào)漿至醪濃度為10％，調(diào)至pH為8.5，加入占漿料重量2.11％的堿性蛋白酶，在溫度為88℃條件下反應2h，所得到的漿料經(jīng)過5000rpm離心10分鐘，得到濾液，濾液冷凍干燥后，即可得到蛋白產(chǎn)品。用元素分析法測定蛋白產(chǎn)品的蛋白含量，即可判定堿性蛋白酶的提取效果。結(jié)果如圖2及圖3所示，步驟(2)的蛋白質(zhì)的提取率為85.3％。

關(guān)于醪濃度的改變對復合纖維素酶作用效果的對比實施例

對比實施例1

除了將步驟(1)中的醪濃度設(shè)置為5％以外。按照實施例1中相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖1所示，步驟(1)的蛋白提取率為3％。

對比實施例2

除了將步驟(1)中的醪濃度設(shè)置為10％以外。按照實施例1中相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖1所示，步驟(1)的蛋白提取率為3.2％。

對比實施例3

除了將步驟(1)中的醪濃度設(shè)置為15％以外。按照實施例1中相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖1所示，步驟(1)的蛋白提取率為5.2％。

對比實施例4

除了將步驟(1)中的醪濃度設(shè)置為20％以外。按照實施例1中相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖1所示，步驟(1)的蛋白提取率為5.1％。

從圖1的數(shù)據(jù)可以看出步驟(1)中的醪濃度對復合纖維酶的蛋白提取率有直接影響，當醪濃度為10％-13％時，蛋白提取率較高；當醪濃度為12％時，蛋白提取率最高。

關(guān)于溫度的改變對堿性蛋白酶作用效果的對比實施例

對比實施例5

除了將步驟(2)中溫度設(shè)置為60℃以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖2所示，步驟(2)的蛋白提取率為32％。

對比實施例6

除了將步驟(2)中溫度設(shè)置為65℃以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖2所示，步驟(2)的蛋白提取率為41％。

對比實施例7

除了將步驟(2)中溫度設(shè)置為70℃以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖2所示，步驟(2)的蛋白提取率為45％。

對比實施例8

除了將步驟(2)中溫度設(shè)置為75℃以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖2所示，步驟(2)的蛋白提取率為48％。

對比實施例9

除了將步驟(2)中溫度設(shè)置為80℃以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖2所示，步驟(2)的蛋白提取率為71％。

對比實施例10

除了將步驟(2)中溫度設(shè)置為90℃以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖2所示，步驟(2)的蛋白提取率為85％。雖然與實施例1提取率相差不大，但是考慮到節(jié)約成本，實施例1對應的溫度更加適合。

對比實施例11

除了將步驟(2)中溫度設(shè)置為95℃以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖2所示，步驟(2)的蛋白提取率為73％。

關(guān)于pH的改變對堿性蛋白酶作用效果的對比實施例。

對比實施例12

除了將步驟(2)中pH設(shè)置為6.5以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖3所示，步驟(2)的蛋白提取率為14％。

對比實施例13

除了將步驟(2)中pH設(shè)置為7.0以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖3所示，步驟(2)的蛋白提取率為28％。

對比實施例14

除了將步驟(2)中pH設(shè)置為7.5以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖3所示，步驟(2)的蛋白提取率為48％。

對比實施例15

除了將步驟(2)中pH設(shè)置為8.0以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖3所示，步驟(2)的蛋白提取率為62％。

對比實施例16

除了將步驟(2)中pH設(shè)置為9.0以外，按照實施例1相同的方法提取米糠蛋白。結(jié)果如圖3所示，步驟(2)的蛋白提取率為80％。