一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶及分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶及分離純化方法，屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。該糖基轉(zhuǎn)移酶具有如SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明一方面利用生物工程技術(shù)，在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶，用于催化生成根皮苷；另一方面采用飽和硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜等分離純化方法，具有簡單易行，周期短，重復(fù)性高，酶蛋白活力高等優(yōu)點。
【專利說明】一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶及分離純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶及 其分離純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 根皮苷（Phloridzin)屬于二氫查爾酮類，是根皮素（Phloretin)的葡萄糖苷，主 要存在于蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實中，是蘋果多酚中最具代表性的一種多酚類 成分，近年來又在多穗柯甜茶中發(fā)現(xiàn)了根皮苷的存在。根皮苷除了具有抗菌、抗氧化、清除 體內(nèi)自由基及保護心臟等生物活性外，最突出的作用就是可以降低血糖。根皮苷專一地、競 爭性地抑制鈉離子關(guān)聯(lián)葡萄糖載體（Sodium-linked glucose transporters, SGLTs)對葡 萄糖分子的運輸，從而抑制葡萄糖在小腸和腎的吸收。因此，根皮苷可以作為一種潛在的降 糖藥物，應(yīng)用前景廣闊。
[0003] 糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase, GT, EC2. 4. X. y)是專門催化糖基化反應(yīng)的 酶類，它們將活性糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到糖基受體，形成糖苷鍵，產(chǎn)物包括寡糖、多糖、各 種復(fù)合糖（糖蛋白、糖脂）和糖苷化合物（如花色苷、黃酮糖苷、白藜蘆醇糖苷等）。在 CAZy(Carbohydrate Active enzymes Database)數(shù)據(jù)庫中，目前已劃分 94 個家族。植物 糖基化的作用是通過增加親水性改變苷元的溶解性，提供進入膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的途徑。糖基化 通過調(diào)節(jié)重要細胞代謝物的水平、活性和定位的功能在保持細胞內(nèi)平衡方面起到很大的作 用。某些糖基化反應(yīng)參與植物體內(nèi)激素的平衡調(diào)節(jié)。另外糖基化還能降低或除去內(nèi)源和外 源物質(zhì)的毒性。糖基轉(zhuǎn)移酶具有底物特異性，故植物中含有多種糖基轉(zhuǎn)移酶，如人參皂苷 肋 2葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、葛根素糖基轉(zhuǎn)移酶、紅景天苷糖基轉(zhuǎn)移酶、查爾酮糖基轉(zhuǎn)移酶、花青素 糖基轉(zhuǎn)移酶、染料木素糖基轉(zhuǎn)移酶、槲皮素糖基轉(zhuǎn)移酶、甜葉菊苷糖基轉(zhuǎn)移酶等。蘋果根皮 苷糖基轉(zhuǎn)移酶存在于蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實中，催化根皮素生成根皮苷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶及分離純化方法，該方法 利用生物工程技術(shù)，在感受態(tài)細胞中異源表達蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶，經(jīng)色譜分離純化，制 得重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶，方法簡單易行、周期短、重復(fù)性高。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0006] 一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶，該糖基轉(zhuǎn)移酶具有如SEQ. ID. NO. 1所示的氨基 酸序列。
[0007] -種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶，編碼所述重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸 序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
[0008] 一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，包括以下步驟：
[0009] 1)采用CTAB法提取蘋果葉總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的CDNA為模板，用一對帶有酶切 位點的引物FOl和ROl進行PCR擴增，經(jīng)檢測后獲取目的基因條帶，對PCR產(chǎn)物進行回收；
[0010] 2)將步驟1)得到的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，采用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 后，篩選重組子，得到重組質(zhì)粒；
[0011] 3)對重組質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性克隆、測序，得到重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的基 因序列；
[0012] 4)對含有重組質(zhì)粒的菌體進行異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達，異源表達 產(chǎn)物通過飽和硫酸按沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜 純化，再經(jīng)腸激酶切除載體標(biāo)簽蛋白，獲得純化后的重組根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0013] 步驟1)所述的引物FOl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，引物ROl的核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 4所示；酶切所用的酶為BamH I和Hind III。
[0014] 所述的感受態(tài)細胞為大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。
[0015] 所述熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的具體操作為：
[0016] ①將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至裝有感受態(tài)細胞的離心管中，輕輕混勻；
[0017] ②冰浴30min后，在42°C熱激90s，冰浴3min ;
[0018] ③加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37 °C下振蕩培養(yǎng)Ih?3h ;
[0019] ④復(fù)蘇后的菌液離心，吸取上清液，對留在離心管底部的菌液用移液槍吹打重 懸；
[0020] ⑤用移液槍將重懸菌液移入帶有Amp抗生素且在37°C保溫的LB固體培養(yǎng)基平板 上，用滅菌的涂布器涂布均勻；
[0021] ⑥將平板倒置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)12?16h。
[0022] 所述對含有重組質(zhì)粒的菌體進行異丙基-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達具體操作 為：
[0023] 挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落接種于帶有Amp抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，在37°C， 200prm下振蕩培養(yǎng)過夜，再按1 %的體積比接種到帶有Amp抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基中， 在37°C，180rpm下，振蕩培養(yǎng)至0D600達0. 6?I. 0 ;加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷， 在20°C下誘導(dǎo)4h ;經(jīng)離心收集菌體，菌體用生理鹽水洗滌，再加入細胞緩沖液，進行超聲破 碎，然后在4°C，12000rpm下離心lOmin，得到粗酶液I。
[0024] 所述飽和硫酸銨沉淀具體操作為：
[0025] 冰浴下，向粗酶液I中加入（NH4)2SO4粉末至（NH 4)2SO4終質(zhì)量濃度為30%，攪拌均 勻后離心，取上清液，繼續(xù)加入（NH 4)2SO4粉末至（NH4)2SO 4終質(zhì)量濃度為70%，攪拌均勻后， 4°C靜置lh，然后離心取沉淀；將沉淀用緩沖液溶解后用30kDa超濾離心管進行酶液的濃縮 和脫鹽，得到粗酶液II。
[0026] 所述DEAE-Sepharose陰離子交換層析的具體操作為：
[0027] 將粗酶液II過0. 22 μ m的濾膜，然后采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，用NaCl以lmL/min 進行線性洗脫，檢測各個洗脫峰的糖基轉(zhuǎn)移酶酶活，將有酶活的部分進行合并收集，轉(zhuǎn)入透 析袋，用PEG20000在4°C進行濃縮，得到酶液III。
[0028] 所述Sephadex-75凝膠過濾色譜純化具體操作為：
[0029] 將酶液III注射到AKTA蛋白純化系統(tǒng)，使用Sephadex-75凝膠柱進行純化，用緩沖 液以lmL/min流速進行洗脫，檢測各個洗脫峰的糖基轉(zhuǎn)移酶酶活，合并收集有酶活的部分， 轉(zhuǎn)入透析袋用PEG20000在4°C進行濃縮。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0031] 本發(fā)明公開了克隆得到的蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列全長1452個堿基對， 該基因編碼483個氨基酸。
[0032] 本發(fā)明一方面利用生物工程技術(shù)，在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達蘋果 根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶，用于催化生成根皮苷；另一方面采用飽和硫酸銨沉淀、陰離子 DEAE-Sepharose交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜等分離純化方法，具有簡單易行， 周期短，重復(fù)性高，酶蛋白活力高等優(yōu)點。
[0033] 經(jīng)本發(fā)明方法分離純化得到的重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的活性最適pH值為 8. 5,活性最適溫度為45°C，當(dāng)金屬離子在反應(yīng)體系的終濃度為5mM時，Ca2+和Mg 2+對該重 組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶有促進作用，Na+和K +作用不明顯，Al 3+、Cu2+、Mn2+和Zn 2+有顯著 的抑制作用，Cu2+的抑制作用最強。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為采用DEAE-S印harose FF純化重組糖基轉(zhuǎn)移酶活性峰色譜圖；
[0035] 圖2為采用Superdex? 75凝膠色譜純化重組糖基轉(zhuǎn)移酶色譜圖；
[0036] 圖3為純化后的重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶SDS-PAGE電泳圖；
[0037] 圖4為酶反應(yīng)產(chǎn)物色譜圖；
[0038] 圖5為根皮苷標(biāo)品質(zhì)譜圖；
[0039] 圖6為酶反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)譜圖；
[0040] 圖7為pH對重組糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響結(jié)果圖；
[0041] 圖8為溫度對重組糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響結(jié)果圖；
[0042] 圖9為金屬離子對重組糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0043] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0044] 本發(fā)明所提供的蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆技術(shù)方案是：采用CTAB法 (CTAB，hexadecyltrimethylammonium bromide，十六燒基三甲基溴化按，是一種陽離子去 污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。）提取蘋果葉總RNA，以反 轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用一對帶有酶切位點的引物R) 1和RO1進行PCR擴增，用1. 0 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測，在紫外光下割取目的基因條帶，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行 PCR產(chǎn)物回收，將膠回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5 α，用 藍白斑法篩選重組子，重組質(zhì)粒提取采用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，重組質(zhì)粒 雙酶切鑒定陽性克隆，測序?？寺〉玫降奶O果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列全長1452個堿基 對，該基因編碼483個氨基酸。
[0045] 本發(fā)明所提供的表達載體的構(gòu)建技術(shù)方案是：用BamH I和Hind III將得到的蘋 果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因進行雙酶切，用T4連接酶與同樣用BamH I和Hind III雙酶切的 pET-32a(+)質(zhì)粒連接。
[0046] 本發(fā)明提供的含有蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組菌株的技術(shù)方案是：用 轉(zhuǎn)化到DH5 α后所提的陽性重組質(zhì)粒pET-32a-p2' GT熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌 BL21(DE3)中。
[0047] 本發(fā)明提供的重組根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶制備技術(shù)方案是：將含有重組質(zhì)粒的菌 體進行異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)表達，異源表達產(chǎn)物通過飽和硫酸銨 沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜純化，采用腸激酶 (Enterokinase)切除載體標(biāo)簽蛋白，獲得重組根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0048] 1、基因擴增
[0049] 引物：
[0050] FOl (5' -ACGGGATCC ATG GGA GAC GTC ATT GTA CTG-3'）（劃線部分為BamH I 酶切 位點）；
[0051] ROl (5, -CCCAAGCTT TTA TGT AAT GCT ACT AAC AAA GTT G-3'）（劃線部分為 Hind III酶切位點）。
[0052] 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用FOl和ROl兩個引物進行PCR擴增，Takara Premix Taq試劑盒，PCR反應(yīng)體系如表1 :
[0053] 表I PCR反應(yīng)體系
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，該糖基轉(zhuǎn)移酶具有如SEQ. ID. NO. 1 所示的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，編碼所述重 組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3. -種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 采用CTAB法提取蘋果葉總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用一對帶有酶切位點 的引物F01和R01進行PCR擴增，經(jīng)檢測后獲取目的基因條帶，對PCR產(chǎn)物進行回收； 2) 將步驟1)得到的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，采用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后， 篩選重組子，得到重組質(zhì)粒； 3) 對重組質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性克隆、測序，得到重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的基因序 列； 4) 對含有重組質(zhì)粒的菌體進行異丙基-e -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達，異源表達產(chǎn)物 通過飽和硫酸按沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜純 化，再經(jīng)腸激酶切除載體標(biāo)簽蛋白，獲得純化后的重組根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，其特征在 于，步驟1)所述的引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，引物R01的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 4所示；酶切所用的酶為BamH I和Hind III。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，其特征在 于，所述的感受態(tài)細胞為大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，其特征在 于，所述熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的具體操作為： ① 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至裝有感受態(tài)細胞的離心管中，輕輕混勻； ② 冰浴30min后，在42°C熱激90s，冰浴3min ; ③ 加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37 °C下振蕩培養(yǎng)lh?3h ; ④ 復(fù)蘇后的菌液離心，吸取上清液，對留在離心管底部的菌液用移液槍吹打重懸； ⑤ 用移液槍將重懸菌液移入帶有Amp抗生素且在37°C保溫的LB固體培養(yǎng)基平板上，用 滅菌的涂布器涂布均勻； ⑥ 將平板倒置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)12?16h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，其特征在 于，所述對含有重組質(zhì)粒的菌體進行異丙基_ 0-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達具體操作為： 挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落接種于帶有Amp抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，在37°C， 200prm下振蕩培養(yǎng)過夜，再按1 %的體積比接種到帶有Amp抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基中， 在37°C，180rpm下，振蕩培養(yǎng)至0D600達0. 6?1. 0 ;加入異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷， 在20°C下誘導(dǎo)4h ;經(jīng)離心收集菌體，菌體用生理鹽水洗滌，再加入細胞緩沖液，進行超聲破 碎，然后在4°C，12000rpm下離心lOmin，得到粗酶液I。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，其特征在 于，所述飽和硫酸銨沉淀具體操作為： 冰浴下，向粗酶液I中加入（NH4)2S04粉末至（NH4) 2S04終質(zhì)量濃度為30%，攪拌均勻后 離心，取上清液，繼續(xù)加入（NH4)2S04粉末至（NH4) 2S04終質(zhì)量濃度為70%，攪拌均勻后，4°C 靜置lh，然后離心取沉淀；將沉淀用緩沖液溶解后用30kDa超濾離心管進行酶液的濃縮和 脫鹽，得到粗酶液II。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，其特征在 于，所述DEAE-Sepharose陰離子交換層析的具體操作為： 將粗酶液II過0. 22 y m的濾膜，然后采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，用NaCl以lmL/min進 行線性洗脫，檢測各個洗脫峰的糖基轉(zhuǎn)移酶酶活，將有酶活的部分進行合并收集，轉(zhuǎn)入透析 袋，用PEG20000在4°C進行濃縮，得到酶液III。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化方法，其特征 在于，所述Sephadex-75凝膠過濾色譜純化具體操作為： 將酶液III注射到AKTA蛋白純化系統(tǒng)，使用Sephadex-75凝膠柱進行純化，用緩沖液以 lmL/min流速進行洗脫，檢測各個洗脫峰的糖基轉(zhuǎn)移酶酶活，合并收集有酶活的部分，轉(zhuǎn)入 透析袋用PEG20000在4°C進行濃縮。
【文檔編號】C12R1/19GK104480080SQ201410675756
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】樊明濤, 徐穎, 張庭靜 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)