復(fù)合菌劑及所采用的復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法，包括以下步驟：1)、分別制備枯草芽孢桿菌菌液、地衣芽孢桿菌菌液和丁酸梭菌菌液；2)、將發(fā)酵罐內(nèi)加入基礎(chǔ)發(fā)酵液；3)、控制基礎(chǔ)發(fā)酵液的溫度為36～38℃，控制罐壓0.01Mpa，先投入枯草芽孢桿菌液發(fā)酵培養(yǎng)，再投入地衣芽孢桿菌菌液繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，最后投入丁酸梭菌菌液靜置厭氧發(fā)酵培養(yǎng)；4)、步驟3)所得的發(fā)酵液過(guò)濾后離心濃縮至原體積的28～32％；然后經(jīng)噴霧干燥，得復(fù)合益生菌制劑。本發(fā)明克服了微生物單獨(dú)發(fā)酵過(guò)程中滅菌次數(shù)多、進(jìn)料次數(shù)多的缺點(diǎn)，簡(jiǎn)化發(fā)酵程序，同時(shí)通過(guò)連續(xù)發(fā)酵中和不同微生物的協(xié)同作用，提高活菌數(shù)、降低雜菌數(shù)，提高了微生物的作用效果。
CGMCC No. 9386
20140625

CGMCC No. 9385
20140625

CGMCC No. 9383
20140625
【專利說(shuō)明】復(fù)合菌劑及所采用的復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種復(fù)合微生物的發(fā)酵工藝--丁酸梭菌、地 衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的分段連續(xù)發(fā)酵工藝。

【背景技術(shù)】
[0002] 丁酸梭菌是一種厭氧的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，由于其嚴(yán)格厭氧，在發(fā)酵環(huán)境中如 有氧氣存在，丁酸梭菌菌體將不會(huì)生長(zhǎng)甚至死亡。丁酸梭菌耐熱、耐酸、耐膽汁，且對(duì)多種飼 用抗生素有較強(qiáng)的耐受性，可配伍使用；可產(chǎn)生淀粉酶，水解淀粉和糖類；產(chǎn)生丁酸、醋酸 和乳酸等代謝產(chǎn)物。其在臨床上已被廣泛應(yīng)用于治療消化、小兒等各種原因引起的腸道菌 群紊亂、急慢性腹瀉、腸應(yīng)激綜合征、抗生素相關(guān)性腸炎等各種腸道疾病，且在日本、韓國(guó)等 地作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖上也取得了很好的效果，對(duì)于減少當(dāng)前飼料中抗生素產(chǎn) 品的濫用、減少藥物在肉品中的殘留、降低動(dòng)物細(xì)菌的耐藥性和保障動(dòng)物健康方面有著重 要的意義，是一種理想的、具有廣闊開發(fā)前景的微生態(tài)制劑。
[0003] 地衣芽孢桿菌是一種兼性厭氧的微生物，其在有氧無(wú)氧條件下均可生長(zhǎng)，進(jìn)入動(dòng) 物胃腸道后在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可以消耗腸內(nèi)氧氣，維持腸道厭氧環(huán)境，促進(jìn)腸道有益菌如 雙歧桿菌和乳酸菌的增殖和發(fā)育，防止病原菌及腐敗菌在腸道內(nèi)的異常增殖，從而調(diào)節(jié)動(dòng) 物腸道微生態(tài)平衡。地衣芽孢桿菌能形成孢子，而且能耐高溫（KKTC)、耐酸堿、耐擠壓和 耐溫度變化等，能滿足生產(chǎn)加工特性，在飼料中應(yīng)用具有良好的生產(chǎn)性能。我國(guó)對(duì)地衣芽孢 桿菌的應(yīng)用開發(fā)起步較晚，因此導(dǎo)致目前市場(chǎng)上雖有一些地衣芽孢桿菌產(chǎn)品，但其有效活 菌數(shù)低、生產(chǎn)工藝復(fù)雜且成本較高，而且產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，影響了其使用效果。
[0004] 枯草芽孢桿菌是好氧的微生物，在有氧條件下生長(zhǎng)，進(jìn)入動(dòng)物胃腸道后能迅速消 耗消化道內(nèi)的游離氧，形成腸道低氧環(huán)境，促進(jìn)有益厭氧菌生長(zhǎng)，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類， 降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌的生長(zhǎng)。枯草芽孢桿菌菌體能自身合成消化性酶類， 如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，在消化道中與內(nèi)源酶共同發(fā)揮作用，提高飼料消化率。同時(shí)枯 草芽孢桿菌在繁殖過(guò)程中能合成多種維生素，提高動(dòng)物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性。具 有產(chǎn)酶量高、抑菌能力強(qiáng)、安全性好、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。此外，枯草芽孢桿菌具有耐酸、耐鹽、耐高 溫（l〇〇°C )及耐擠壓的特性，在飼料加工中保存良好，有利于推廣應(yīng)用。其作為極具開發(fā)潛 力的微生物菌種已廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、畜牧業(yè)、水產(chǎn)及科研諸領(lǐng)域。
[0005] 上述益生菌的單獨(dú)發(fā)酵菌面臨的發(fā)酵成本高、活菌數(shù)低、雜菌多等問(wèn)題，而國(guó)內(nèi)外 對(duì)三聯(lián)發(fā)酵技術(shù)尚未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種復(fù)合微生物的聯(lián)系發(fā)酵新工藝，克服微生物 單獨(dú)發(fā)酵過(guò)程中滅菌次數(shù)多，進(jìn)料次數(shù)多的缺點(diǎn)，簡(jiǎn)化發(fā)酵程序，降低微生物發(fā)酵的生產(chǎn)成 本，同時(shí)通過(guò)連續(xù)發(fā)酵中和不同微生物的協(xié)同作用，提高活菌數(shù)、降低雜菌數(shù)，提高微生物 的作用效果。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法，包括以下步 驟：
[0008] 1)、分別制備枯草芽孢桿菌菌液、地衣芽孢桿菌菌液和丁酸梭菌菌液；
[0009] 2)、將發(fā)酵罐內(nèi)加入15噸培養(yǎng)基III作為基礎(chǔ)發(fā)酵液；
[0010] 3)、控制基礎(chǔ)發(fā)酵液的溫度為36?38°C，控制罐壓0. OIMpa，投入140?160L的 枯草芽孢桿菌液于36?38°C的溫度、750?850m3/h的通氣量、攪拌條件下發(fā)酵培養(yǎng)11? 13h(較佳為12h);
[0011] 然后，投入140?160L的地衣芽孢桿菌菌液于36?38°C的溫度、750?850m3/h 的通氣量、攪拌條件下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)15?17h(較佳為16h);
[0012] 接著，停止攪拌和通氣，于36?38 °C的溫度下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)2h ;
[0013] 最后，投入140?160L的丁酸梭菌菌液于36?38°C的溫度靜置厭氧發(fā)酵培養(yǎng) 23?25h(較佳為24h);
[0014] 4)、步驟3)所得的發(fā)酵液過(guò)濾后離心濃縮至原體積的28?32% ;然后經(jīng)噴霧干 燥，得復(fù)合益生菌制劑。
[0015] 作為本發(fā)明的復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法的改進(jìn)：
[0016] 培養(yǎng)基III的制備方法為：葡萄糖20g，玉米粉10g，大豆粉40g，酵母粉8g，Ig硅油 (H201 - 100)，碳酸氫鈣0. 5g，氯化鈣0. 015g，硫酸銨lg，硫酸鎂0. 15g，硫酸錳0. 15g，加水 1000ml，用 NaHCO3 調(diào)節(jié) pH 至 7. 0,于 121-128°C條件下消毒 30-35min。
[0017] 作為本發(fā)明的復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0018] 枯草芽孢桿菌菌液的制備方法為：
[0019] 將3. Oml的濃度為50 X 108cfu/ml的枯草芽孢桿菌（保藏號(hào)：CGMCC No. 9383)菌 液接種于1. 9?2. IL的培養(yǎng)基I中，于36?38°C搖床培養(yǎng)17?19h(較佳為18h)，然后 投入280?320L的培養(yǎng)基III于36?38°C、9?IlmVh的通氣量、攪拌條件下擴(kuò)大培養(yǎng)培 養(yǎng)17?19h(較佳為18h);得枯草芽孢桿菌菌液；
[0020] 地衣芽孢桿菌菌液的制備方法為：
[0021] 將3. Oml的濃度為50 X 108cfu/ml的地衣芽孢桿菌（保藏號(hào)：CGMCC No. 9385)菌 液接種于1. 9?2. IL的培養(yǎng)基I中，于36?38°C搖床培養(yǎng)17?19h (較佳為18h)，然后投 入280?320L的培養(yǎng)基III于36?38°C、9?IlmVh的通氣量、攪拌條件下擴(kuò)大培養(yǎng)17? 19h(較佳為18h);得地衣芽孢桿菌菌液；
[0022] 丁酸梭菌菌液的制備方法為：
[0023] 將3. Oml的濃度為2. 0 X 108cfu/ml的丁酸梭菌（保藏號(hào)：CGMCC No. 9386)菌液接 種于1. 9?2. IL的培養(yǎng)基II中，于36?38°C靜置厭氧培養(yǎng)17?19h(較佳為18h)，然后 投入280?320L的培養(yǎng)基III于36?38°C靜置厭氧擴(kuò)大培養(yǎng)17?19h (較佳為18h)，得丁 酸梭菌菌液；
[0024] 所述培養(yǎng)基I為牛肉膏蛋白胨搖瓶培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基II為RCM培養(yǎng)基。備注說(shuō) 明：這2種培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基。
[0025] 作為本發(fā)明的復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0026] 所述步驟4)中的過(guò)濾為經(jīng)100目過(guò)濾；噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度210°C ±5°C、出風(fēng)口 溫度 95°C ±5°C。
[0027] 本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述任一方法制備而得的復(fù)合益生菌制劑（即，復(fù)合菌 劑）。
[0028] 本發(fā)明制得的產(chǎn)品（復(fù)合益生菌制劑）中枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌和丁酸酸 菌含量分別約為 I. 5 X 109cfu/g、L 8 X 109cfu/g、L 2 X 107cfu/g。總菌數(shù)約為 3. 3 X IO9Cfu/ g°
[0029] 備注說(shuō)明，本發(fā)明所涉及的3種菌株的保藏信息具體如下：
[0030] 枯草芽孢桿菌菌株HJBA058,保藏名稱為：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)， 保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)：CGMCC No. 9383,保藏日期：2014年06 月25日。
[0031] 地衣芽孢桿菌菌株HJBL008,保藏名稱為：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址： 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)：CGMCC No. 9385,保藏 日期：2014年06月25日。
[0032] 丁酸梭菌菌株HJCB998,保藏名稱為：丁酸梭菌（Clostridium butyricum)，保藏 單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)：CGMCC No. 9386,保藏日期：2014年06月 25臼。
[0033] 本發(fā)明工藝的主要特點(diǎn)是：
[0034] (1)、有三次接種、三次發(fā)酵過(guò)程，第一次接種枯草芽孢桿菌菌液進(jìn)行枯草芽孢桿 菌芽孢的發(fā)酵，第二次接種地衣芽孢桿菌菌液進(jìn)行地衣芽孢桿菌芽孢的發(fā)酵，第三次接種 丁酸梭菌菌液進(jìn)行丁酸梭菌芽孢的發(fā)酵（厭氧發(fā)酵）；
[0035] (2)、枯草芽孢桿菌為好氧菌，地衣芽孢桿菌為兼性厭氧菌，在枯草芽孢桿菌和地 衣芽孢桿菌聯(lián)合發(fā)酵的后期，停止通氣，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌會(huì)迅速耗盡發(fā)酵液 中殘存的氧，為丁酸梭菌提供厭氧條件，從而節(jié)省了驅(qū)氧成本。
[0036] (3)、發(fā)酵過(guò)程中只需第一次投入基礎(chǔ)發(fā)酵液，分不同時(shí)間段進(jìn)三種菌液的接種， 即可在一個(gè)發(fā)酵罐里完成三種菌的發(fā)酵生產(chǎn)，由此反復(fù)循環(huán)，避免了間歇性發(fā)酵工藝的清 罐、上料、滅菌、冷卻等復(fù)雜的準(zhǔn)備性工藝環(huán)節(jié)，保證了完全在密閉的環(huán)境中內(nèi)進(jìn)行，從而有 效地減少了污染機(jī)會(huì)，降低了生產(chǎn)成本。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例1 :復(fù)合益生菌的發(fā)酵技術(shù)
[0038] 培養(yǎng)基I :牛肉膏蛋白胨搖瓶培養(yǎng)基的制備方法為（常規(guī)技術(shù)）：在5g牛肉膏、 IOg蛋白胨、5g NaCl中加入IOOOmL水；調(diào)節(jié)pH 7.0,置高溫滅菌鍋中于121°C條件下滅菌 30min〇
[0039] 培養(yǎng)基II :RCM培養(yǎng)基的制備方法為（常規(guī)技術(shù)）：在胰蛋白胨10g、酵母粉3g、牛 肉浸粉l〇g、葡萄糖5g、可溶性淀粉lg、氯化鈉5g、無(wú)水乙酸鈉 I. 5g、半胱氨酸鹽0. 5g中加 入IOOOmL水，調(diào)節(jié)ρΗ7·5,加入食品級(jí)白油（約1 - 2cm)置高溫滅菌鍋中于115°C、20min 滅菌，備用。
[0040] 培養(yǎng)基III :種子罐（發(fā)酵罐）培養(yǎng)基制備方法為：葡萄糖20g，玉米粉10g，大豆 粉40g，酵母粉8g，Ig硅油（H201 - 100)，碳酸氫鈣0. 5g，氯化鈣0. 015g，硫酸銨lg，硫酸 鎂0. 15g，硫酸錳0. 15g，加水1000ml，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7. 0,于121-128°C條件下消毒 30_35min〇
[0041] 備注說(shuō)明：以下步驟中，搖床是指25-35轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速；攪拌是指70-80轉(zhuǎn)/分 鐘的轉(zhuǎn)速。
[0042] 步驟一，將枯草芽孢桿菌（保藏號(hào)：CGMCC No. 9383)甘油管2支（每支含有濃度 約為50 X 108cfu/ml的菌液I. 5ml)接種于1個(gè)5L三角瓶中（內(nèi)裝2L培養(yǎng)基I )，于37°C 搖床培養(yǎng)18h，然后投入至500L (裝量為300L培養(yǎng)基III)種子罐中擴(kuò)大培養(yǎng)18h (培養(yǎng)溫度 37°C、開攪拌、通氣量10m3/h)，以并此得到枯草芽孢桿菌菌液。
[0043] 將地衣芽孢桿菌（保藏號(hào)：CGMCC No. 9385)甘油管2支（每支含有濃度為 50 X 108cfu/ml的菌液1.5ml)接種于1個(gè)5L三角瓶中（內(nèi)裝2L培養(yǎng)基I )，于37°C搖床培 養(yǎng)18h，然后投入至500L (裝量為300L培養(yǎng)基III)種子罐中擴(kuò)大培養(yǎng)18h (培養(yǎng)溫度37°C、 開攪拌、通氣量l〇m3/h)，以此得到地衣芽孢桿菌菌液。
[0044] 將丁酸梭菌菌株（保藏號(hào)：CGMCC No. 9386)甘油凍存管2支（每支含有濃度為 2.0X108cfu/ml的菌液1.5ml)接種于1個(gè)5L三角瓶中（內(nèi)裝2L培養(yǎng)基II )，37°C靜置厭 氧培養(yǎng)18h，然后投入至500L (裝量為300L培養(yǎng)基III)種子罐中擴(kuò)大培養(yǎng)18h (溫度37°C， 不開攪拌、靜置厭氧培養(yǎng)）以此得到丁酸梭菌菌液。
[0045] 步驟二，將15噸培養(yǎng)基III投入20T發(fā)酵罐，作為基礎(chǔ)發(fā)酵液。
[0046] 備注說(shuō)明：于121-128°C條件下消毒30-35min這個(gè)步驟可在上述發(fā)酵罐內(nèi)完成。
[0047] 步驟三，待基礎(chǔ)發(fā)酵液溫度為37°C時(shí)，控制罐壓0. OIMpa，加入150L步驟一中制得 的枯草芽孢桿菌液，于培養(yǎng)溫度37°C、開攪拌、通氣量800m3/h的培養(yǎng)條件下進(jìn)行枯草芽孢 桿菌芽孢的發(fā)酵，發(fā)酵12h后，投入150L步驟一中制得的地衣芽孢桿菌菌液，培養(yǎng)條件不 變，繼續(xù)發(fā)酵16h，然后關(guān)攪拌、停止通氣，保溫繼續(xù)發(fā)酵2h，最后投入150L步驟一中制得的 丁酸梭菌菌液進(jìn)行發(fā)酵，于培養(yǎng)溫度37°C、關(guān)攪拌、不通氣、靜置厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)條件下繼 續(xù)發(fā)酵24h。
[0048] 步驟四，將步驟三中得到的發(fā)酵液100目過(guò)濾后，進(jìn)入碟式離心機(jī)離心，濃縮至原 體積的30%，然后經(jīng)噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度210°C ±5°C，出風(fēng)口溫度95°C ±5°C )得到成品 (粉末）復(fù)合益生菌制劑。
[0049] 備注說(shuō)明：微生物平皿和試管檢測(cè)，所得的復(fù)合菌劑中，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢 桿菌、丁酸梭菌的含量分別為 I. 5X 109cfu/g、l. 8X 109cfu/g、l. 2X 107cfu/g。
[0050] 實(shí)驗(yàn)I :復(fù)合微生物制劑在動(dòng)物上的應(yīng)用
[0051] 選取21日齡斷奶的杜X長(zhǎng)X大仔豬216頭，分為3個(gè)處理組，每個(gè)組6個(gè)重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)12頭，空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，抗生素組在基礎(chǔ)日糧中添加20mg/kg硫酸粘桿 菌素，復(fù)合發(fā)酵益生菌組在基礎(chǔ)日糧中添加300mg/kg(實(shí)施例1所得的復(fù)合益生菌劑，即通 過(guò)本發(fā)明復(fù)合發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和丁酸梭菌的復(fù)合物），試驗(yàn)期 21天。實(shí)驗(yàn)期間觀察各組豬群采食和飲水情況，記錄耗料量，測(cè)定斷奶后21天的體重，計(jì)算 平均日增重、平均日采食量和料重比；收集試驗(yàn)結(jié)束時(shí)直腸取糞，測(cè)定其中大腸桿菌、乳酸 桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和表2。
[0052] 表1復(fù)合益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響
[0053]
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法，其特征是包括以下步驟： 1) 、分別制備枯草芽孢桿菌菌液、地衣芽孢桿菌菌液和丁酸梭菌菌液； 2) 、將發(fā)酵罐內(nèi)加入15噸培養(yǎng)基III作為基礎(chǔ)發(fā)酵液； 3) 、控制基礎(chǔ)發(fā)酵液的溫度為36?38°C，控制罐壓0. OIMpa，投入140?160L的枯草 芽孢桿菌液于36?38°C的溫度、750?850m3/h的通氣量、攪拌條件下發(fā)酵培養(yǎng)11?13h ; 然后，投入140?160L的地衣芽孢桿菌菌液于36?38°C的溫度、750?850m3/h的通 氣量、攪拌條件下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)15?17h ; 接著，停止攪拌和通氣，于36?38°C的溫度下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)2h ; 最后，投入140?160L的丁酸梭菌菌液于36?38°C的溫度靜置厭氧發(fā)酵培養(yǎng)23? 25h ； 4) 、步驟3)所得的發(fā)酵液過(guò)濾后離心濃縮至原體積的28?32% ;然后經(jīng)噴霧干燥，得 復(fù)合益生菌制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法，其特征是： 培養(yǎng)基III的制備方法為：葡萄糖20g，玉米粉10g，大豆粉40g，酵母粉8g，lg硅油，碳酸 氫鈣0. 5g，氯化鈣0. 015g，硫酸銨lg，硫酸鎂0. 15g，硫酸錳0. 15g，加水1000ml，用NaHC03調(diào)節(jié)pH至7. 0,于121-128°C條件下消毒30-35min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法，其特征是： 枯草芽孢桿菌菌液的制備方法為： 將3. 0ml的濃度為50X 108cfu/ml的枯草芽孢桿菌（保藏號(hào)：CGMCC No. 9383)菌液接 種于1. 9?2. 1L的培養(yǎng)基I中，于36?38°C搖床培養(yǎng)17?19h，然后投入280?320L的 培養(yǎng)基III于36?38°C、9?llm3/h的通氣量、攪拌條件下擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)17?19h ;得枯草 芽孢桿菌菌液； 地衣芽孢桿菌菌液的制備方法為： 將3. 0ml的濃度為50X 108cfu/ml的地衣芽孢桿菌（保藏號(hào)：CGMCC No. 9385)菌液接 種于1. 9?2. 1L的培養(yǎng)基I中，于36?38°C搖床培養(yǎng)17?19h，然后投入280?320L的 培養(yǎng)基III于36?38°C、9?llm3/h的通氣量、攪拌條件下擴(kuò)大培養(yǎng)17?19h ;得地衣芽孢 桿菌菌液； 丁酸梭菌菌液的制備方法為： 將3. 0ml的濃度為2. OX 108cfu/ml的丁酸梭菌（保藏號(hào)：CGMCC No. 9386)菌液接種于 1. 9?2. 1L的培養(yǎng)基II中，于36?38°C靜置厭氧培養(yǎng)17?19h，然后投入280?320L的 培養(yǎng)基III于36?38°C靜置厭氧擴(kuò)大培養(yǎng)17?19h，得丁酸梭菌菌液； 所述培養(yǎng)基I為牛肉膏蛋白胨搖瓶培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基II為RCM培養(yǎng)基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合微生物的連續(xù)發(fā)酵法，其特征是： 所述步驟4)中的過(guò)濾為經(jīng)100目過(guò)濾；噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度210°C ±5°C、出風(fēng)口溫度 95°C ±5°C。
5. 如權(quán)利要求1?4任一所述方法制備而得的復(fù)合益生菌制劑。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104371960SQ201410662273
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】劉金松, 曾新福, 楊彩梅, 汪以真, 馮杰 申請(qǐng)人:浙江惠嘉生物科技有限公司, 浙江大學(xué)