用于通過連續(xù)灌注和交互切向流來培養(yǎng)細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于通過連續(xù)灌注和交互切向流來培養(yǎng)細(xì)胞的方法。本發(fā)明涉及通過對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)來培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞，其中，細(xì)胞培養(yǎng)基被加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過濾器模塊上循環(huán)，導(dǎo)致液體流出物的細(xì)胞密度較之細(xì)胞培養(yǎng)物要低，而過濾器模塊內(nèi)的流是交互切向流。優(yōu)選地，培養(yǎng)基按照特定的灌注速率加入和/或從培養(yǎng)物中至少將生物質(zhì)移出一次。本方法尤其適合于培養(yǎng)聚集的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及這樣的方法：其中，細(xì)胞會生產(chǎn)生物物質(zhì)(優(yōu)選地，生產(chǎn)抗體)，所述生物物質(zhì)可在下游加工過程中被進(jìn)一步純化。
【專利說明】用于通過連續(xù)灌注和交互切向流來培養(yǎng)細(xì)胞的方法
[0001] 本發(fā)明是申請日為2005年3月4日、申請?zhí)枮?00580007175. 4、題為"用于通過 連續(xù)灌注和交互切向流來培養(yǎng)細(xì)胞的方法"的申請的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及對細(xì)胞的灌注培養(yǎng)（perfusion culturing)。
[0003] 本發(fā)明公開了一種方法，用于通過對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)來培養(yǎng)細(xì)胞， 所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞，其中，細(xì)胞培養(yǎng)基被加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，其中， 細(xì)胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過濾器模塊上循環(huán)，導(dǎo)致液體流出物的細(xì)胞密度較細(xì)胞培養(yǎng) 物要低，而過濾器模塊內(nèi)的流是交互切向流。
[0004] 我們^(奇地發(fā)現(xiàn)，按照本發(fā)明對動物（特別是哺乳動物）細(xì)胞或酵母細(xì)胞進(jìn)行灌 注培養(yǎng)，可以獲得極其高的存活細(xì)胞密度，而細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)一步展示出極其高的細(xì)胞存活 率（viability)。此外，還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的灌注方法使得培養(yǎng)物內(nèi)細(xì)胞聚集更少，甚至能獲得 單個的細(xì)胞的懸浮液，而沒有可見的聚集物。這是令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槭褂玫图羟袟l件， 例如，在灌注細(xì)胞培養(yǎng)中，典型地，不會使細(xì)胞不聚集。灌注細(xì)胞培養(yǎng)期間的細(xì)胞聚集是不 利的，因?yàn)槔缂?xì)胞聚集物中細(xì)胞代謝情況不均一使得過程控制會更難。如果細(xì)胞形成了 5個或更多個細(xì)胞的聚集物，以及當(dāng)聚集物總的來說包含細(xì)胞總量中5%或更多的時候，這 就尤其麻煩。
[0005] 在US 6, 544, 424中描述了一種灌注方法。雖然，該文獻(xiàn)提到，該方法可以被用于 對動物細(xì)胞進(jìn)行灌注培養(yǎng)，但是其既沒有公開也沒有暗示本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的高細(xì)胞密度。此 外，US 6, 544, 424B1中公開，該灌注過程可以減少中空纖維膜表面上障礙物的粘附和生長， 但是其既沒有公開也沒有暗示細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞本身會更少地聚集。
[0006] Voisier et al. (Biotechnol. Bioeng. 82(2003)，751-765)對懸浮哺乳細(xì)胞高密 度灌注培養(yǎng)中的多種細(xì)胞駐留技術(shù)進(jìn)行了綜述。其中提到的細(xì)胞駐留系統(tǒng)中沒有一種能夠 提供本發(fā)明的極其高的存活細(xì)胞密度以及極其高的細(xì)胞存活率。
[0007] 細(xì)胞灌注培養(yǎng)在本領(lǐng)域中有其傳統(tǒng)含義，即，這意味著，在培養(yǎng)期間，通過分離設(shè) 備來保留細(xì)胞，其中存在較之分離前具有更低的細(xì)胞密度的液體流出物，并且存在細(xì)胞培 養(yǎng)基流入物。在本發(fā)明的方法中，該分離設(shè)備是包含中空纖維的過濾器模塊。
[0008] 灌注培養(yǎng)包括但不限于，連續(xù)流和半連續(xù)流，例如，逐步流（step-wise flow)或交 錯流（staggered flow) 〇
[0009] 術(shù)語"中空纖維"指管狀的膜。該管的內(nèi)徑優(yōu)選在0. 3至6. Omm之間，更優(yōu)選地， 在0.5至3. Omm之間，最優(yōu)選地，在0.5至2. Omm之間。優(yōu)選地，膜的網(wǎng)孔大小被選擇為：網(wǎng) 孔中孔的大小接近細(xì)胞直徑，確保細(xì)胞能駐留下來，而細(xì)胞殘骸能通過過濾器。優(yōu)選地，網(wǎng) 孔大小為3-30 μ m。
[0010] 包含中空纖維的過濾器模塊可通過商業(yè)途徑獲得，例如，從General Electric (以 前的Amersham)獲得。
[0011] "過濾器模塊內(nèi)的交互切向流"指：在與中空纖維的膜表面相同的方向上（即，與 之相切的方向）存在一道流，所述的流來回流動，在與所述過濾器表面基本垂直的方向上 存在另一道流。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得切向流。例如，在US 6, 544, 424 中描述過，可以用一個泵使細(xì)胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過濾器模塊上循環(huán)，用另一個泵 移出細(xì)胞密度較過濾器分離之前更低的液體，由此獲得交互切向流。
[0012] 在本發(fā)明的方法中，適用于培養(yǎng)細(xì)胞的任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)基原則上都可使 用。選擇細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)條件的方針都是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，并且在例如Freshney， R. I. Culture of animal cells(a manual of basic techniques),4th edition 2000, wiley-Liss 的第 8 章和第 9 章以及 Doyle, A. , Griffiths, J. B. , Newell, D. G. Cell&Tissue culture !Laboratory Procedures 1993, John wiley&Sons 中提供過。
[0013] 通常，用于哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基包含鹽、氨基酸、維生素、脂類、去垢劑、 緩沖液、生長因子、激素、細(xì)胞因子、微量元素和碳水化合物。鹽的例子包括鎂鹽，例如 MgCl2 · 6H20、MgSO4 和 MgSO4 · 7H20 ;鐵鹽，例如 FeSO4 · 7H20 ;鉀鹽，例如 KH2P04、KCl ;鈉鹽，例 如NaH2P04、Na2HPO4和鈣鹽，例如CaCl 2 · 2H20。氨基酸的例子是全部20種已知的蛋白質(zhì)源 氨基酸，例如，組氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸。維生素的例子包括：抗壞血酸、 生物素、膽堿C1、肌醇、D-泛酸、核黃素。脂類的例子包括：脂肪酸，例如亞油酸和油酸；大豆 蛋白胨和乙醇胺。去垢劑的例子包括Tween 80和Pluronic F68。緩沖液的例子是HEPES。 生長因子/激素/細(xì)胞因子包括IGF、氫化可的松和（重組）胰島素。微量元素的例子是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括Zn、Mg和Se。碳水化合物的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖和 丙酮酸鹽/酯。
[0014] 細(xì)胞培養(yǎng)基的pH、溫度、溶解氧濃度和滲透壓摩爾濃度（osmolarity)原則上并不 重要，其取決于所選用細(xì)胞的種類。優(yōu)選地，pH、溫度、溶解氧濃度和滲透壓摩爾濃度被選擇 為：其對于細(xì)胞的生長和生產(chǎn)率來說是最優(yōu)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何找到對灌注培養(yǎng) 來說最優(yōu)的pH、溫度、溶解氧濃度和滲透壓摩爾濃度。通常,最優(yōu)pH介于6. 6和7. 6之間， 最優(yōu)溫度介于30至39°C之間，最優(yōu)滲透壓摩爾濃度介于260至400m0sm/kg之間。
[0015] 可有利地用本發(fā)明方法處理的細(xì)胞可以是從本發(fā)明的方法獲得好處（即培養(yǎng)至 極其高的存活細(xì)胞密度以及極其高的細(xì)胞存活率）的任何種類的細(xì)胞。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的方法，極其高的存活細(xì)胞密度是每mL至少80x IO6個細(xì)胞的密度， 優(yōu)選地，每mL至少IOOx IO6個細(xì)胞，更優(yōu)選地，每mL至少IlOx IO6個細(xì)胞，更優(yōu)選地，每 mL至少120x IO6個細(xì)胞，更優(yōu)選地，每mL至少130x IO6個細(xì)胞，最優(yōu)選地，每mL至少140x IO6個細(xì)胞。典型地，細(xì)胞密度的合適上限可以是每mL大約500x IO6個細(xì)胞。
[0017] 令人驚奇地，本發(fā)明的極其高的細(xì)胞密度還伴隨著極其高的細(xì)胞存活率。極其高 的細(xì)胞存活率是至少為90 %的存活率，優(yōu)選為至少95 %，更優(yōu)選為至少97%，最優(yōu)選為至 少 99%。
[0018] 應(yīng)當(dāng)理解，非常高的存活細(xì)胞密度和非常高的細(xì)胞存活率是在灌注培養(yǎng)進(jìn)行一段 時間之后達(dá)到的，通常是當(dāng)細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，對哺乳動物細(xì)胞而言，典型的是灌注培養(yǎng) 初始化之后12至25天。
[0019] 本發(fā)明的方法適合用于培養(yǎng)動物細(xì)胞或酵母細(xì)胞，尤其適合用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì) 胞。
[0020] 本發(fā)明的方法還尤其適合用于對培養(yǎng)期間（尤其是灌注培養(yǎng)期間）容易形成或固 有地會形成聚集物的細(xì)胞（所謂的聚集細(xì)胞）進(jìn)行培養(yǎng)。令人驚奇地，本發(fā)明的方法不僅 能減少過濾器膜上的聚集物分布，還能減少灌注培養(yǎng)期間細(xì)胞的聚集，甚至是減少固有地 趨向于形成聚集物的細(xì)胞的聚集。根據(jù)本發(fā)明對聚集細(xì)胞的培養(yǎng)能使得培養(yǎng)物中至少5個 細(xì)胞的聚集物僅包含細(xì)胞總數(shù)的至多5%，優(yōu)選地，至多4%，更優(yōu)選地，至多3%，進(jìn)一步更 優(yōu)選地，細(xì)胞總數(shù)的至多2%。尤其優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明對聚集細(xì)胞的培養(yǎng)使得培養(yǎng)物是真 正的單個的細(xì)胞的懸浮液。
[0021] 聚集細(xì)胞是形成至少5個細(xì)胞的聚集物的細(xì)胞，所述聚集物占到細(xì)胞總數(shù)的至少 5 %。優(yōu)選地，聚集物由至少6個，更優(yōu)選至少7個，進(jìn)一步更優(yōu)選至少8個，進(jìn)一步更優(yōu)選 至少9個，進(jìn)一步更優(yōu)選至少10個細(xì)胞組成。優(yōu)選地，聚集物總的來說包含細(xì)胞總數(shù)的至 少7%，更優(yōu)選至少10%，最優(yōu)選15%。
[0022] 哺乳動物細(xì)胞的例子包括：CHO(中國倉鼠卵巢）細(xì)胞、雜交瘤、BHK(幼倉鼠腎）細(xì) 胞、骨髓瘤細(xì)胞、人類細(xì)胞（例如HEK-293細(xì)胞、人成淋巴細(xì)胞、PER.C6?細(xì)胞）、小鼠細(xì)胞 (例如，NSO 細(xì)胞）。酵母細(xì)胞的例子包括 Saccharomyces cerevisiae、Phaffia rhodozyma、 Kluyveromyces Iactis或來自Pichia屬的酵母細(xì)胞。
[0023] 優(yōu)選地，使用哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選地，CH0、NS0、PER.C6?細(xì)胞。還優(yōu)選地，可以 使用已知在培養(yǎng)期間會發(fā)生聚集的細(xì)胞（聚集細(xì)胞）。最優(yōu)選地，使用PER.C6?細(xì)胞。
[0024] 例如，可在顯微鏡下對細(xì)胞聚集進(jìn)行測定。
[0025] 將細(xì)胞培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)物中的速率（流入速率或灌注速率）會影響細(xì)胞的存活 率和密度。
[0026] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，按照下述公式1的灌注速率，將細(xì)胞培養(yǎng)基加入：
[0027] 灌注速率=SPR*細(xì)胞培養(yǎng)物總體積*存活細(xì)胞密度 （1)
[0028] 其中，灌注速率以每天多少升來表示，其中，SPR是比灌注速率，S卩，細(xì)胞培養(yǎng)基被 加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中的速率，其被表示為每時間單位每存活細(xì)胞中加入的培養(yǎng)基的體積， 并且，其中，存活細(xì)胞密度是每單位體積中存活細(xì)胞的數(shù)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以測定得到 存活細(xì)胞的數(shù)量，例如，通過臺盼藍(lán)排除方法來測定。
[0029] 比灌注速率優(yōu)選被選擇為0. 01至0. 3nL/細(xì)胞/天之間，更優(yōu)選地，0. 01至0. 2nL/ 細(xì)胞/天之間。
[0030] 當(dāng)調(diào)節(jié)灌注速率時，可以有利地考慮其它參數(shù)，例如被加入到培養(yǎng)物中的葡萄糖 的量和/或氧氣濃度。例如，對PER.C6?而言，作為培養(yǎng)基灌注速率的一部分，葡萄糖灌 注速率優(yōu)選被選用為3至20毫摩爾/L之間，更優(yōu)選地，5至15毫摩爾/L之間。
[0031] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定流出速率。液體的流出速率是通過灌注速率來確定 的，其通常被選用為相等的值。
[0032] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，流出的液體基本上沒有存活細(xì)胞。
[0033] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，從細(xì)胞培養(yǎng)物中至少移出一次生物質(zhì)（biomass) (即，細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞），并將額外的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，以補(bǔ)償移出的 生物質(zhì)。移出生物質(zhì)可以獲得更高的細(xì)胞密度?？梢赃B續(xù)或逐步地移出生物質(zhì)。
[0034] 在逐步方法中，在給定的時間段內(nèi)將生物質(zhì)連續(xù)移出。如果使用逐步方法，優(yōu)選在 細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的恰好之前或之后立即開始移出生物質(zhì)。
[0035] 如果使用逐步方法，對每個生物質(zhì)移出步驟而言，優(yōu)選地，每天移出的生物質(zhì)體積 為工作體積的2至40%，更優(yōu)選地，每天為工作體積的5至30%，進(jìn)一步更優(yōu)選地，每天為 工作體積的10至25%。
[0036] "工作體積"指細(xì)胞培養(yǎng)物的總體積。
[0037] "生物質(zhì)移出步驟"指從開始移出生物質(zhì)到結(jié)束之間的時間。如果使用連續(xù)方法， 那么連續(xù)移出生物質(zhì)，直到細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束。優(yōu)選地，連續(xù)移出生物質(zhì)起始自細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定狀 態(tài)的恰好之前或之后。優(yōu)選地，移出的生物質(zhì)體積每天為工作體積的2至40 %，更優(yōu)選地， 每天為工作體積的3至30%，進(jìn)一步更優(yōu)選地，每天為工作體積的4至15%。
[0038] 額外加入細(xì)胞培養(yǎng)基用于補(bǔ)償生物質(zhì)的移出。其中將額外的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到細(xì) 胞培養(yǎng)物中的加料可以與灌注加料合并，但是其也可以采用單獨(dú)加料的形式。本領(lǐng)域技術(shù) 人員知道需要加入多少額外的細(xì)胞培養(yǎng)基來補(bǔ)償生物質(zhì)的移出。通常，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加 入額外細(xì)胞培養(yǎng)基的速率與生物質(zhì)移出速率相同。
[0039] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，細(xì)胞要生產(chǎn)生物物質(zhì)（biological substances)。 適合在對細(xì)胞的灌注培養(yǎng)中生產(chǎn)的生物物質(zhì)原則上是可以通過動物（尤其是哺乳動物）和 酵母細(xì)胞生產(chǎn)的所有生物物質(zhì)，例如，治療和診斷用的蛋白質(zhì)，例如，單克隆抗體，生長因子 或肽激素，酶，多核苷酸，例如用于基因療法的病毒載體，疫苗等。
[0040] 在本發(fā)明的灌注培養(yǎng)方法中，流出液體較之分離之前的液體，具有更低的細(xì)胞密 度，但是生物物質(zhì)的濃度相同。
[0041] 優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)生物制藥產(chǎn)品，生物制藥產(chǎn)品是具有醫(yī)藥應(yīng)用的 生物物質(zhì)。生物制藥產(chǎn)品的例子如下（括號之間是相應(yīng)生物制藥產(chǎn)品的商品名的例子）：替 奈替普酶（Tenect印lase) (TN Kase?)、（重組）抗出血因子（ReFacto?)、成淋巴細(xì)胞干擾素 a-nl (ffellferon?) > (重組）凝血因子（NovoSeven?)、依那西普（Etanercept) (Enbrel?)、 曲妥珠單抗（Trastuzumab) (Herceptin?)、英利昔單抗（Infliximab) (Remicade?)、巴 利昔單抗（Basiliximab) (Simulect?)、達(dá)克珠單抗（Daclizumab) (Zenapaz?)、（重組） 凝血因子 IX (Benefix?)、促紅細(xì)胞生成素 alpha ( Epogen? )、G-CSF ( Neupogen?: Filgrastim)、干擾素 alpha-2b( Infergen? )、重組胰島素（Humulin? )、干擾素 beta la( Avonex? )、因子 VIII ( KoGENate? )、葡糖腦苷脂酶（Cerezyme?)、干擾素 beta lb ( Betaseron? )、TNF alpha 受體（Enbrel? )、囊泡刺激激素（Gonal-F? )、Mab 阿 昔單抗（Synagis?、ReoPro? )、Mab ritiximab( Rituxan? )、組織血纖蛋白溶解酶原 激活因 （Activase?、Actilyase? )、人生長激素（Protropin?、Norditropin?' GenoTropin?)。具有可能的醫(yī)藥應(yīng)用的多核苷酸的例子是基因治療用的質(zhì)粒DNA。目 前在臨床試驗(yàn)中針對醫(yī)藥應(yīng)用對一些基因治療用DNA進(jìn)行了檢驗(yàn)。疫苗的例子是 肝、口腔四價(jià)輪狀病毒疫苗（RotaShield?)、狂犬病疫苗（RanAvert?)、乙型肝炎疫苗 (RECOMBIVAX HB?、Engerix? )和滅活甲型肝炎疫苗（VAQTAtm)。
[0042] 可在所謂的下游加工中對流出物中的生物物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化。下游加工通常包 括若干純化步驟，其組合和順序可以變動。下游加工過程中純化步驟的例子是：分離步驟 (例如，通過親和色譜和/或離子交換色譜）、用于濃縮生物物質(zhì)的步驟（例如，通過超濾或 滲濾）、交換緩沖液的步驟和/或去除或滅活病毒的步驟（例如，通過病毒過濾、pH改變或 溶劑去垢劑處理）。
[0043] 下面將通過下述實(shí)施例來闡述本發(fā)明，但是下述實(shí)施例對本發(fā)明沒有限制。
[0044] 實(shí)施例1 :對人細(xì)朐系P{ZR.G(3?講行工藝優(yōu)化，用于牛產(chǎn)牛物藥物導(dǎo)論
[0045]目前有大量的表達(dá)平臺用于生產(chǎn)生物藥物。新產(chǎn)品中的大多數(shù)必須選擇哺乳動物 體系，這主要是由于這些細(xì)胞含有而其它細(xì)胞缺乏的糖基化機(jī)制。但是目前，這些細(xì)胞的細(xì) 胞質(zhì)量和得到的生產(chǎn)率都比相應(yīng)的微生物體系要低10-100倍，如果這些微生物細(xì)胞有生 產(chǎn)上述產(chǎn)物的機(jī)制的話。
[0046] 針對PHR.C6?細(xì)胞系（擁有大量特征，使其有利于生產(chǎn)生物藥物的人細(xì)胞系） 開發(fā)了一種灌注培養(yǎng)系統(tǒng)及方法。灌注方法包括對培養(yǎng)物中多種組分的分離，使得細(xì)胞可 被保留，收獲物被獲取，培養(yǎng)基的更新得以進(jìn)行。對PER.C6?細(xì)胞系進(jìn)行的連續(xù)灌注培養(yǎng) 中，旋轉(zhuǎn)過濾器（spinfilter)、聲學(xué)設(shè)備（acoustic device)和交互切向流（ATF)單元的性 能被評測。
[0047] 材料和方法
[0048] 細(xì)胞系及其保持：將產(chǎn)牛人IgG的ΡΕΚ.(:6Φ):細(xì)胞系用于本研究。細(xì)胞被保持在 不含血清的商業(yè)培養(yǎng)基（EX-CELL? VPRO培養(yǎng)基，JRH Biosciences)中，其中補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺（Gibco)。PF.R.C6?細(xì)胞系是人的紅細(xì)胞系，其上帶有使用磷酸甘油酸酯激 酶啟動子的腺病毒5型（ad5)El基因。
[0049] 牛物反應(yīng)器設(shè)置:在該研究中，使用IL和4L工作體積的反應(yīng)器（Applikon，荷蘭 和B. Braun,德國）。Braun DOJ3控制器（B. Braun,德國）被用于按照給定的設(shè)置來執(zhí)行工 藝。溫度保持為36. 5°C (范圍為35. 5-37. 5°C)。通過靠頂部空間對入口氣體組合物進(jìn)行 自動調(diào)節(jié)，以及通過微孔噴頭進(jìn)行間歇式噴射，將溶解氧濃度控制為空氣飽和的50% (范 圍40-60% )。pH的設(shè)置點(diǎn)為7. 1 (范圍為6. 7-7. 5)，通過頂部空間的CO2流對其進(jìn)行控制。 用存活細(xì)胞密度在〇. 2-0. 5*106個細(xì)胞/mL范圍內(nèi)的接種體將細(xì)胞接種到發(fā)酵罐中。灌注 開始于存活細(xì)胞密度在1_3*1〇 6個細(xì)胞/mL的范圍內(nèi)的時候。
[0050] 細(xì)胞駐留：用三種不同的設(shè)備將細(xì)胞保持在反應(yīng)器中。首先，使用孔徑為IOym 的旋轉(zhuǎn)過濾器（GKD，DUren，德國）。第二種，使用Bios印BDI1015細(xì)胞駐留系統(tǒng)和控制器 (AppliSens，荷蘭）。最后來評測ATF-4控制單元，其裝有相關(guān)的中空纖維膜模塊（Refine Technology，美國）。所用的中空纖維過濾器是CFP-2-E-8SIP型號（0. 2微米，面積： 4600em2，Amersham Bioscience，從 Magellan instruments，美國獲得）。為保持恒定的培 養(yǎng)物體積，使用水平傳感器控制回路。
[0051] 分析方法：用臺盼藍(lán)排除方法，對生物反應(yīng)器的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照下述方法來 測定存活細(xì)胞的數(shù)量：將大量用臺盼藍(lán)染色過的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Fuchs Rosenthal血球計(jì)數(shù)器 中。將血球計(jì)數(shù)器的腔室放到顯微鏡下，對合適數(shù)量的小格進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用下述公式來計(jì) 算存活細(xì)胞密度：
[0052] 存活細(xì)胞密度（X IO5 個細(xì)胞/ml) = (A+B)x E/320 (2)
[0053] 其中，
[0054] A =方框A中未染色細(xì)胞的數(shù)量
[0055] B =方框B中未染色細(xì)胞的數(shù)量
[0056] E =稀釋因子
[0057] 通過用帶有UV280nm吸收檢測裝置的HPLC，使用分析蛋白質(zhì)A柱來測定抗體濃度； 基于IgGl參考標(biāo)準(zhǔn)校正曲線來確定實(shí)際濃度。
[0058] 結(jié)果
[0059] 灌灃培養(yǎng)
[0060] 圖1-6顯示了用上述材料和方法獲得的結(jié)果。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0061] 圖1 :針對兩種不同的連續(xù)灌注發(fā)酵的存活細(xì)胞密度（X IO6個細(xì)胞/ml)對培養(yǎng)時 間（天）的示意圖，所述發(fā)酵是對產(chǎn)生IgGl的PFR.C6?克隆來進(jìn)行得，其中使用旋轉(zhuǎn)過 濾器分離設(shè)備。IL Applikon發(fā)酵罐的攪拌器速率被設(shè)定為100-150rpm。灌注按照IL的 工作體積進(jìn)行。對兩種灌注運(yùn)行模式而言，比灌注速率（SPR)都是0. 1-0. 3nL/細(xì)胞/天。 在兩種情況下，由于旋轉(zhuǎn)過濾器堵塞，灌注的運(yùn)行都不得不終止。
[0062] 圖2 :在用聲學(xué)設(shè)備作為細(xì)胞駐留系統(tǒng)的連續(xù)灌注系統(tǒng)中對產(chǎn)生IgGl的 PER.C6?細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。IL Applikon發(fā)酵罐的攪拌器速率被設(shè)定為100-150rpm。用于 運(yùn)行/停止循環(huán)的設(shè)置為300s向前（forward)和4. 5s向后（backwards)。在運(yùn)行期間，這 被改為300s/3s循環(huán)（第15天）。用于灌注運(yùn)行的比灌注速率在0. 1-0. 3nL/細(xì)胞/天之 間。
[0063] 圖3 :在用ATF-4單元作為細(xì)胞駐留系統(tǒng)的連續(xù)灌注系統(tǒng)中對產(chǎn)生IgGl的 PER.C6?細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)在4L的Applikon發(fā)酵罐中進(jìn)行。攪拌器速度被設(shè)置為 125rpm。ATF-4在每天0. 5至3倍之間的工作體積下運(yùn)行。SPR被設(shè)定為0. 03-0. 08nL/細(xì) 胞/天。插入圖片顯示出：培養(yǎng)物具有高細(xì)胞密度，并且完全沒有聚集細(xì)胞。
[0064] 圖4 :對兩種不同的灌注發(fā)酵而言，IgGl的生產(chǎn)率對培養(yǎng)時間（天）的圖，所述發(fā) 酵是用旋轉(zhuǎn)過濾器分離設(shè)備對產(chǎn)生IgGl的PER.C6?克隆進(jìn)行的。
[0065] 圖5 :在用聲學(xué)設(shè)備作為細(xì)胞駐留系統(tǒng)的連續(xù)灌注系統(tǒng)中，產(chǎn)生IgGl的 PHR.C6?細(xì)胞的生產(chǎn)率。
[0066] 圖6 :在用ATF單元作為細(xì)胞駐留系統(tǒng)的連續(xù)灌注系統(tǒng)中，產(chǎn)生IgGl的PFR.C6? 細(xì)胞的生產(chǎn)率。
[0067] 概括
[0068] 關(guān)于針對不同類型的灌注獲得的數(shù)據(jù)的總結(jié)，參見表1。
[0069] 表1.對使用三種不同的駐留設(shè)備進(jìn)行的灌注中存活細(xì)胞密度、體積產(chǎn)率（基于反 應(yīng)器體積）和產(chǎn)量提高的總結(jié)。加入了分批和補(bǔ)料分批的結(jié)果用于比較（數(shù)據(jù)未示出）。 [0070]

【權(quán)利要求】
1. 方法用于在細(xì)胞生長期間降低聚集細(xì)胞懸浮液的聚集程度的用途，在所述方法中： 包含細(xì)胞培養(yǎng)基和聚集細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物被維持在連續(xù)灌注培養(yǎng)體系中，細(xì)胞培養(yǎng)基被加 入到所述細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過濾器模塊內(nèi)循環(huán)，導(dǎo)致液體 流出物的細(xì)胞密度較之所述細(xì)胞培養(yǎng)物要低，所述過濾器模塊內(nèi)的循環(huán)的特征為交互切向 流，以及繼續(xù)所述培養(yǎng)直至達(dá)到期望的細(xì)胞密度。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中至少將生物質(zhì)移出一次，并且 向所述細(xì)胞培養(yǎng)物中加入額外的細(xì)胞培養(yǎng)基。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述生物質(zhì)的移出在細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的恰好之前 或之后立即開始。
4. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中每天移出的生物質(zhì)的體積在所述細(xì)胞培養(yǎng)物總體積 的2至40%之間。
5. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述過濾器模塊包含中空纖維，以及所 述交互切向流是通過下述方法獲得的：用一個泵使所述細(xì)胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過濾 器模塊內(nèi)循環(huán)，以及用另一個泵移出液體流出物。
6. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的用途，其中以0. 01至0. 3nL/細(xì)胞/天之間的灌注 速率添加細(xì)胞培養(yǎng)基。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的用途，其中細(xì)胞被培養(yǎng)至存活細(xì)胞密度是每ml至少 80xl06個細(xì)胞，并且細(xì)胞的存活率為至少90%。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的用途，其中細(xì)胞總數(shù)的至多5%包含至少5個細(xì)胞 的聚集物。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述細(xì)胞為動物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
10. 如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。
11. 如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述哺乳動物細(xì)胞為PER.C6:i<細(xì)胞。
12. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)。
13. 如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述生物物質(zhì)是治療或診斷用的蛋白質(zhì)或多核苷 酸。
14. 如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述治療或診斷用蛋白質(zhì)選自由單克隆抗體，生 長因子、肽激素、酶和疫苗組成的組。
15. 如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述治療用或診斷用多核苷酸為用于基因療法的 病毒載體。
16. 如權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述生物物質(zhì)在下游加工過程中被 進(jìn)一步純化。
【文檔編號】C12N1/16GK104388324SQ201410601800
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2005年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2004年3月5日
【發(fā)明者】約翰·闊沃勒, 麥可·武本恩, 卓斯·曼紐爾·庫庫·馬丁 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司