一種將外源基因定點(diǎn)整合到靶標(biāo)基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種將外源基因定點(diǎn)整合到哺乳類動(dòng)物靶標(biāo)基因的方法，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將外源基因定點(diǎn)整合到靶標(biāo)基因，特別是將Cre基因定點(diǎn)整合到小鼠Enpp1基因第一個(gè)外顯子內(nèi)，該技術(shù)不僅整合效率高(20％)；操作步驟簡(jiǎn)單，僅需構(gòu)建一個(gè)外源基因載體；同時(shí)不存在位置效應(yīng)影響。
【專利說明】一種將外源基因定點(diǎn)整合到靶標(biāo)基因的方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體而言，主要涉及外源基因knock-in及過表達(dá)載體 的構(gòu)建方法以及依托CRISPR/Cas9技術(shù)可將該載體上的外源基因及過表達(dá)的目的基因整 合到基因組特定位點(diǎn)。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，我國(guó)醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展很迅速，但是同時(shí)也存在著很多問題，例如研發(fā)基礎(chǔ)薄 弱、仿制國(guó)外專利泛濫、缺少自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)等等，這些都嚴(yán)重制約著我國(guó)的醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展。 因此，增強(qiáng)我國(guó)的藥品研發(fā)能力刻不容緩。藥物研發(fā)過程就是疾病致病機(jī)理和藥物靶標(biāo)篩 選的過程，篩選的過程大都借助于各類人類疾病的動(dòng)物疾病模型，特別是與人親緣關(guān)系較 近的各類動(dòng)物模型來(lái)分析疾病的發(fā)病機(jī)制和新型藥物的研發(fā)。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)在構(gòu)建動(dòng)物模 型方面是個(gè)很好的工具，可以將目的基因插入到基因組內(nèi)，在體內(nèi)正常發(fā)揮功能，這為研究 疾病的分子機(jī)理提供了極其有用的工具。
[0003] 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因研究中，將外源基因片段顯微注射到受精卵，通過隨機(jī)插入方式將 外源基因整合到機(jī)體基因組上；但是隨機(jī)插入方式會(huì)受到位置效應(yīng)的影響以及載體自身大 小限制，不能包含完整的調(diào)控原件往往使外源基因的表達(dá)水平較低，甚至不表達(dá)或異位表 達(dá)。同時(shí)，由于外源基因的多拷貝隨機(jī)插入到宿主基因組中，這種方式對(duì)宿主來(lái)說存在一定 風(fēng)險(xiǎn)。這些弊端限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展。因此，需要一種能使外源基因高效表達(dá)，同時(shí)具 有較高的安全性和可靠性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
[0004] 為了高效的整合外源基因以及在宿主內(nèi)正常表達(dá)，克服轉(zhuǎn)入基因受到位置效應(yīng)的 影響，研究者們?cè)谳d體上加入核基質(zhì)附著元件、位點(diǎn)控制元件、絕緣子等元件以減弱位置效 應(yīng)的影響，但是由于基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，位置效應(yīng)仍存在影響；同時(shí)，外源基因在宿主 基因組內(nèi)仍是以隨機(jī)方式整合，降低了轉(zhuǎn)基因的安全性及可靠性，這些弊端仍是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基 因研究急需解決的問題?；虼虬屑夹g(shù)的出現(xiàn)克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的弊端，大大提高了轉(zhuǎn)基 因的可控性，該技術(shù)利用外源基因與基因組序列間的同源性進(jìn)行同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)外源基因 整合到宿主基因組內(nèi)的一門技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、可穩(wěn)定遺傳以及外源基因不受位置效應(yīng) 影響等優(yōu)點(diǎn)。但是基因重組打靶技術(shù)面臨重組效率低，構(gòu)建步驟復(fù)雜，同時(shí)伴隨不正常重組 等缺點(diǎn)。因此，急需一種快速、高效、簡(jiǎn)單整合外源基因的方法。
[0005] 目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組編輯方面有著很大的優(yōu)勢(shì)，不僅可以定點(diǎn)刪除目 的基因還可以定點(diǎn)整合目的基因。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種商效定點(diǎn)整合外源基因的方法，以提商外源基因在宿主 內(nèi)正常表達(dá)，同時(shí)具有安全可靠性，本發(fā)明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將外源基因定點(diǎn)整合到 靶標(biāo)基因，特別是將Cre基因定點(diǎn)整合到小鼠Enppl基因第一個(gè)外顯子內(nèi)，該技術(shù)不僅整合 效率高（20% );操作步驟簡(jiǎn)單，僅需構(gòu)建一個(gè)外源基因載體；同時(shí)不存在位置效應(yīng)影響。利 用該技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)具有高可控性和安全性，降低了轉(zhuǎn)基因生物的風(fēng)險(xiǎn)。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種將外源基因定點(diǎn)整合到哺乳類動(dòng)物靶標(biāo)基因的方法，其特征在于所述方法 為：（1)將外源基因擴(kuò)增后連接至外源基因重組表達(dá)載體上，構(gòu)建重組外源基因載體；（2) 將靶標(biāo)基因跟載體連接，構(gòu)建重組靶標(biāo)基因載體；（3)將重組外源基因載體與重組靶標(biāo)基 因載體分別經(jīng)過Aatll和SphI酶切、瓊脂糖凝膠回收，獲得外源基因-靶標(biāo)基因片段；(4) 以px330質(zhì)粒（Addgene:42230)為模板，在含17啟動(dòng)子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R 作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pGME-T載體連接，獲得質(zhì)粒pGEM-Cas9,再將質(zhì) 粒pGEM-Cas9經(jīng)線性化、體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化試劑盒回收，獲得Cas9mRNA ; (5)根據(jù)靶標(biāo)基 因序列，人工合成含17啟動(dòng)子序列的sgRNA，即片段17-sgRNA，再將片段17-sgRNA克隆到 pGME-T載體，經(jīng)線性化、體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化試劑盒回收，獲得I7-sgRNA-靶標(biāo)基因mRNA ; (6)將Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶標(biāo)基因mRNA和外源基因-靶標(biāo)基因片段混合成混合液，注 射哺乳類動(dòng)物受精卵（優(yōu)選小鼠受精卵），實(shí)現(xiàn)將外源基因定點(diǎn)整合到靶標(biāo)基因的目的；

【權(quán)利要求】
1. 一種將外源基因定點(diǎn)整合到靶標(biāo)基因的方法，其特征在于所述方法為：（1)將外源 基因擴(kuò)增后連接至外源基因重組表達(dá)載體上，構(gòu)建重組外源基因載體；（2)將靶標(biāo)基因跟 載體連接，構(gòu)建重組靶標(biāo)基因載體；（3)將重組外源基因載體與重組靶標(biāo)基因載體分別經(jīng) 過Aatll和SphI酶切、瓊脂糖凝膠回收，獲得外源基因-靶標(biāo)基因片段；（4)以px330質(zhì)粒 為模板，在含17啟動(dòng)子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR反 應(yīng)產(chǎn)物與PGME-T載體連接，獲得質(zhì)粒pGEM-Cas9,再將質(zhì)粒pGEM-Cas9經(jīng)線性化、體外轉(zhuǎn)錄 及RNA純化試劑盒回收，獲得Cas9mRNA ; (5)根據(jù)靶標(biāo)基因序列，人工合成含17啟動(dòng)子序列 的sgRNA，即片段17-sgRNA，再將片段17-sgRNA克隆到pGME-T載體，經(jīng)線性化、體外轉(zhuǎn)錄及 RNA純化試劑盒回收，獲得T7-sgRNA-靶標(biāo)基因mRNA ; (6)將Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶標(biāo)基 因mRNA和外源基因-靶標(biāo)基因片段混合成混合液，注射哺乳類動(dòng)物受精卵，實(shí)現(xiàn)將外源基 因定點(diǎn)整合到靶標(biāo)基因的目的； Cas9_F : 5' -TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3' Cas9-R :5' -GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3'。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述每20 混合液中Cas9mRNA、 T7-sgRNA-靶標(biāo)基因mRNA和外源基因-靶標(biāo)基因片段的濃度分別為50ng/ yl、20ng/ yl和 lOng/y l〇
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述外源基因?yàn)镃re基因。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述靶標(biāo)基因?yàn)樾∈驟nppl基因。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述哺乳類動(dòng)物受精卵為小鼠受精卵。
6. 如權(quán)利要求3?5之一所述的方法，其特征在于所述方法為：（1)重組外源基因載體 的構(gòu)建：以GFP-Cre載體為模板，在引物pCre-F和引物pCre-R的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，回 收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到pGME-T載體，獲得重組外源基因載體pCre-Knockin，核苷酸序列為 SEQ ID NO. 1 所示； pCre-F: 5' -GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTCCAATTTACTGA CCGT-3， pCre-R:5，-ATAAGAGAAGAGGGACAGCT-3,； (2) 重組靶標(biāo)基因載體的構(gòu)建：將小鼠Enppl基因與載體pGEM-T連接，構(gòu)建重組靶標(biāo) 基因載體pGEM-Enppl，核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示； (3) 外源基因-靶標(biāo)基因片段：將步驟（1)獲得的重組外源基因載體pCre-Knockin和 步驟（2)獲得的重組祀標(biāo)基因載體pGEM-Enppl經(jīng)酶切后連接，構(gòu)建載體pCre-Enppl，核苷 酸序列為SEQ ID NO. 3所示； (4) T7-sgRNA-EnpplmRNA :根據(jù)Enppl的核苷酸序列，人工合成T7-sgRNA序列， 序列為SEQ ID NO. 6所示，將SEQ ID NO. 6所示的T7-sgRNA序列克隆到pGME-T載 體，獲得質(zhì)粒T7-sgRNA-Enppl，將質(zhì)粒T7-sgRNA-Enppl進(jìn)行線性化、體外轉(zhuǎn)錄獲得 T7-sgRNA_EnpplmRNA ; (5) 以px330質(zhì)粒為模板，在含17啟動(dòng)子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R作用下進(jìn) 行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物與pGME-T載體連接，獲得質(zhì)粒pGEM-Cas9,再將質(zhì)粒pGEM-Cas9經(jīng) 線性化、體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化試劑盒回收，獲得Cas9mRNA ; Cas9_F : 5' -TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3' Cas9-R:5' -GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3' ； (6)將T7-sgRNA-EnpplmRNA、Cas9mRNA與載體pCre-Enppl混合，然后注射小鼠受精卵， 再將受精卵孵育，實(shí)現(xiàn)將外源基因Cre定點(diǎn)整合到小鼠Enppl內(nèi)的目的。
【文檔編號(hào)】C12N15/89GK104342457SQ201410553171
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】陳勇龍, 黃華榮, 張遵義, 羊雪芹 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)