干細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種化學(xué)成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含以下組分：水溶性非聚電解質(zhì)高分子、無機(jī)鹽類、維生素、氨基酸、葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素或類胰島素功能替代品如（IGF-1/2）、成纖維生長因子。本發(fā)明不含有動(dòng)物源性添加物，即各類動(dòng)物制品，不含有滋養(yǎng)層細(xì)胞，不含有條件培養(yǎng)基，具有如下優(yōu)點(diǎn)：提供了一種無動(dòng)物源性成分、化學(xué)成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基，可以避免傳統(tǒng)培養(yǎng)基血液制品提純不絕對(duì)導(dǎo)致的細(xì)胞分化；提供的全能干細(xì)胞培養(yǎng)基，可以有效的體外擴(kuò)增人全能干細(xì)胞（包括hESC和hiPSC），效果顯著，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)動(dòng)物源性培養(yǎng)基。提供的是一種無動(dòng)物源性成分、化學(xué)成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基，可以有效保證產(chǎn)品批次的質(zhì)量穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化。
【專利說明】干細(xì)胞培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種化學(xué)成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基，可用于人 類全能干細(xì)胞的培養(yǎng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 體外擴(kuò)增人全能干細(xì)胞(包括hESC和hiPSC)的方法主要有兩種；滋養(yǎng)層培養(yǎng)和無 滋養(yǎng)層培養(yǎng)。一般在培養(yǎng)基中加入胎牛血清，用于支持細(xì)胞生長，執(zhí)行細(xì)胞的功能(主要是 物質(zhì)傳送，比如脂肪酸，金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)等)。但血清非常昂貴，而且化學(xué)成分不確定，批次質(zhì) 量也存在很大的不穩(wěn)定性，如果將全能干細(xì)胞用于人體再生醫(yī)學(xué)中，培養(yǎng)MEFs的培養(yǎng)基中 補(bǔ)加的胎牛血清會(huì)使hESC和hiPSC暴露于動(dòng)物源細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)之中，且死亡的MEFs的DNA 會(huì)進(jìn)入上層全能干細(xì)胞中，造成基因污染。業(yè)界一直期望能夠有一種無動(dòng)物源性成分、化學(xué) 成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明旨在提供一種化學(xué)成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無動(dòng)物源性成分、化學(xué)成分確 定的干細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是： 干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含W下組分：水溶性非聚電解質(zhì)高分子、無機(jī)鹽類、維生素、氨基酸、 葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膜島素或類膜島素功能替代品如（IGF-1/2)、成纖維生長因子。
[0005] 本發(fā)明采用人工合成的細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)的水溶性非聚電解質(zhì)高分子代替原有培養(yǎng)系 統(tǒng)中來自于血清的蛋白等動(dòng)物源成分，執(zhí)行細(xì)胞功能(主要是物質(zhì)傳送，比如脂肪酸，金屬 離子轉(zhuǎn)運(yùn)等)。此外，為了維持干細(xì)胞特別是全能干細(xì)胞的生長，必須添加足夠量的各種培 養(yǎng)基成分，W維持干細(xì)胞粘附、鋪展、遷移和長期自我更新，所W培養(yǎng)基需要添加各種無機(jī) 鹽類、維生素、氨基酸、葡萄糖W及其他成分。各種無機(jī)鹽、維生素、氨基酸和生長因子是細(xì) 胞擴(kuò)增的必要成分。葡萄糖是為細(xì)胞生長、增殖提供足夠的能量來源。文獻(xiàn)顯示，微量元素， 如鋒、砸、銅、鋼，猛等等對(duì)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長也至關(guān)重要。
[0006] 作為優(yōu)選，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中所用的非聚電解質(zhì)水溶性高分子為W下的一種或 多種；聚己帰醇，聚己帰化咯焼麗，聚己二醇，水溶性非聚電解質(zhì)高分子的分子量范圍為 500-5, 000, 000,進(jìn)一步的在 1，000-1，000, 000,更進(jìn)一步的在 2, 000-200, 000,所述培養(yǎng) 基含有總非聚電解質(zhì)水溶性高分子的質(zhì)量濃度為0.001%到10% (w/v)，更進(jìn)一步濃度為 0. 01-7%，更進(jìn)一步在0. 1-5%，W溶解于去離子水或抑緩沖或W粉末形式加入。
[0007] 作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的種類及用量如下；氯化軸3-5g/L，4-輕 己基脈嗦己賴酸5-7 g/l，砸酸軸0.0000005-0. 0000060 g/l，硫酸鎮(zhèn)0.05-0. 2 g/l，氯 化鐘 0. 15-0. 45 g/l，磯酸軸 0. 075-0. 2 g/l，硝酸鐘 0. 00005-0. 00009 g/l，氯化巧 0.08-0. 25 g/L，焦葡萄酸軸 0.05-0. 4 g/L，氨氧化軸 0.3-0. 9 g/L，碳酸軸 1.5-4. 5 g/L。
[0008] 作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中維生素的組成及用量如下：維生素B7 0.000005-0. 000025g/l，維生素 C 0.002-0. 004 g/l，維生素 B5 0.002-0. 006 g/l，膽堿 0.002-0. 006 g/l，葉酸0.002-0. 006 g/l，肌醇 0.005-0. 02 g/l，煙醜胺 0.002-0. 006 g/l， 化唆酵 0. 002-0. 006 g/l，核黃素 0. 0002-0. 0006 g/l，硫胺 0. 002-0. 006 g/l，維生素 B12 0.000005-0. 00002日 g/L。
[0009] 作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸種類及其用量如下；丙氨酸0.015-0. 035 g/l，天冬醜胺酸 0.01-0. 035 g/l，精氨酸 0.06-0. 10 g/l，天口 冬氨酸 0.02-0. 04 g/ L，半脫氨酸0.3-0. 5 g/L，脫氨酸0.05-0.2 g/L，谷氨醜胺0.8-1. 5 g/L，谷氨酸 0.06-0.09 g/l，甘氨酸 0.02-0. 04 g/l，組氨酸 0.03-0. 05 g/l，異亮氨酸 0.05-0. 25 g/ 以亮氨酸0.05-0. 25 g/l，賴氨酸0.05-0. 25 g/l，蛋氨酸0.02-0.04 g/l，苯丙氨酸 0. 055-0. 075g/l，脯氨酸 0.03-0. 05 g/l，絲氨酸 0.03-0. 055 g/l，蘇氨酸 0.07-0. 15 g/ 以色氨酸 0.005-0.025 g/l，酪氨酸 0.05-0. 15 g/l，額氨酸 0.02-0.04 g/L。
[0010] 作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖用量為1-10 g/L。
[0011] 作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白是APO脫轉(zhuǎn)鐵蛋白或者巧樣酸鐵，用量 為 I-IOOmg /L。
[0012] 作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中膜島素或類膜島素功能替代品的用量是I-IOOmg/ L。
[0013] 作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中成纖維生長因子用量是0. lng-l(K)ng/ml。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明不含有動(dòng)物源性添加物，即各類動(dòng)物制品，不含有滋 養(yǎng)層細(xì)胞，不含有條件培養(yǎng)基，具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、提供了一種無動(dòng)物源性成分、化學(xué)成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基，可W避免傳統(tǒng)培養(yǎng)基 血液制品提純不絕對(duì)導(dǎo)致的細(xì)胞分化。
[0015] 2、提供的全能干細(xì)胞培養(yǎng)基，可W有效的體外擴(kuò)增人全能干細(xì)胞(包括hESC和 hiPSC)，效果顯著，可W代替?zhèn)鹘y(tǒng)動(dòng)物源性培養(yǎng)基。
[0016] 3、提供的是一種無動(dòng)物源性成分、化學(xué)成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基，可W有效保證 產(chǎn)品批次的質(zhì)量穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化。
[0017] 4、本發(fā)明提供的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基成本較傳統(tǒng)動(dòng)物源性培養(yǎng)基低，有利于規(guī) ?；瘧?yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[001引圖1:實(shí)驗(yàn)1中干細(xì)胞擴(kuò)增速度結(jié)果圖； 圖2:實(shí)驗(yàn)2中Matrigel鋪板狀態(tài)下干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果圖； 圖3:實(shí)驗(yàn)2水溶性高分子作為添加劑被加入DMEM/F12/N2培養(yǎng)基用于hESCs培養(yǎng)， 培養(yǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)照片； 圖4 ;實(shí)驗(yàn)3小鼠胚胎干細(xì)胞在含有PVA的培養(yǎng)基與DMEM/F12/FBS15%培養(yǎng)基中細(xì)胞 增殖數(shù)量結(jié)果圖； 圖5 ;實(shí)驗(yàn)3水溶性高分子PVA3化作為添加劑被加入DMEM/F12/N2培養(yǎng)基用于hESCs 培養(yǎng)4她后照片。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0020] 實(shí)施例1 ; 干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含了 W下組分：聚己帰醇、無機(jī)鹽類、維生素、氨基酸、葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋 白、膜島素、成纖維生長因子。
[0021] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的聚己帰醇成分，是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)聚己帰醇，W溶解于 去離子水的形式加入，其用量W質(zhì)量濃度計(jì)為0.1-4. 6%，所用的聚己帰醇的分子量為 100000 ； 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的無機(jī)鹽種類和用量如下：氯化軸3 g/L，4-輕己基脈嗦己 賴酸5g/L,砸酸軸0.0000005g/L，硫酸鎮(zhèn)0. 2 g/L，氯化鐘0. 15g/L，磯酸軸0. 2 g/L，硝 酸鐘0. 00009 g/l，氯化巧0. 08g/l，焦葡萄酸軸0. 05 g/l，氨氧化軸0. 9 g/l，碳酸軸4. 5 g/L ； 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的維生素種類及用量如下；維生素B7 0.000005g/l，維生素 C 0.002g/l，維生素 B5 0.006 g/l，膽堿 0.006 g/l，葉酸 0.006 g/l，肌醇 0.02g/l，煙醜胺 0. 006g/L，化唆酵 0. 002g/l，核黃素 0. 0006 g/L，硫胺（維生素 Bl) 0. 006 g/L，維生素 B12 用量 0. 000025 g/L ; 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的氨基酸種類及其用量如下；丙氨酸0.035 g/l，天冬醜胺酸 O.Olg/l，精氨酸0. 10 g/l，天口冬氨酸0.04 g/l，半脫氨酸0.5 g/l，脫氨酸0.05 g/l，谷 氨醜胺〇.8g/L，谷氨酸0.09 g/L，甘氨酸0.04 g/L，組氨酸0.05 g/L，異亮氨酸0.25 g/ 以亮氨酸0.25 g/l，賴氨酸0.05 g/l，蛋氨酸0.02 g/l，苯丙氨酸0.055g/l，脯氨酸 0. 03 g/l，絲氨酸0.03 g/l，蘇氨酸0.07 g/l，色氨酸0.005 g/l，酪氨酸0.05 g/l，額氨 酸 0. 02 g/L ; 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的葡萄糖用量是lOg/L。
[002引作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的轉(zhuǎn)鐵蛋白是;APO脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，用量10 mg/L。
[0023] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的膜島素用量是2 mg/L。
[0024] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的成纖維生長因子用量是lOng/ml。
[00幼 實(shí)施例2 干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含了 W下組分：聚己帰化咯焼麗、無機(jī)鹽類、維生素、氨基酸、葡萄糖、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、膜島素、成纖維生長因子。
[0026] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的聚己帰化咯焼麗成分，是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，W溶解于抑緩 沖液形式加入，其用量W質(zhì)量濃度計(jì)為2%，所用的聚己帰醇的分子量為50000。
[0027] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的無機(jī)鹽種類和用量是；氯化軸5g/L，4-輕己基脈嗦己 賴酸7 g/l，砸酸軸0.000006g/l，硫酸鎮(zhèn)0.05 g/l，氯化鐘0.45 g/l，磯酸軸0.075 g/ 以硝酸鐘0.00005 g/l，氯化巧0.25 g/l，焦葡萄酸軸0.4 g/l，氨氧化軸0.3 g/l，碳酸軸 1.5 g/L。
[0028] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的維生素種類及用量如下；維生素B7 0. 000025g/l，維 生素 C 0. 004 g/L，維生素 B5 0. 002 g/L，膽堿 0. 002 g/L，葉酸 0. 002g/l，肌醇 0. 005g/L， 煙醜胺0. 002g/l，化唆酵0. 006g/l，核黃素0. 0002g/L，硫胺(維生素BI )0. 006 g/L，維生素 B12 用量 0.000005 g/L。
[0029] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的氨基酸種類及其用量是；丙氨酸0. 035 g/l，天冬醜胺 酸O.Olg/l，精氨酸0. 10 g/l，天口冬氨酸0.02 g/l，半脫氨酸0.3g/l，脫氨酸0.2 g/l，谷 氨醜胺1.5 g/l，谷氨酸0.06 g/l，甘氨酸0.02 g/l，組氨酸0.03 g/l，異亮氨酸0.05 g/l，亮氨酸0.05 g/l，賴氨酸0.25 g/l，蛋氨酸0.04g/l，苯丙氨酸0.075g/l，脯氨酸 0. 05 g/l，絲氨酸 0.055 g/l，蘇氨酸 0.15 g/l，色氨酸 0.025 g/l，酪氨酸 0.15 g/l，額 氨酸 0. 04 g/L ; 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的葡萄糖用量是3. 5g/L ; 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的轉(zhuǎn)鐵蛋白是：巧樣酸鐵，用量1 mg/L。
[0030] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的膜島素用量是50 mg/L。
[0031] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的成纖維生長因子用量是化g/ml。
[00礎(chǔ) 實(shí)施例3 干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含了 W下組分：聚己二醇、無機(jī)鹽類、維生素、氨基酸、葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋 白、膜島素、成纖維生長因子。
[0033] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的聚己二醇成分，是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，W去離子水溶液液體 形式加入。其用量W重量濃度計(jì)為10%，分子量為500。
[0034] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的無機(jī)鹽種類和用量是；氯化軸4. 5 g/L，4-輕己基脈 嗦己賴酸5.5 g/l，砸酸軸0.000020 g/l，硫酸鎮(zhèn)0.1 g/l，氯化鐘0.25 g/l，磯酸軸 0. 2 g/l，硝酸鐘0.00006 g/l，氯化巧0.11 g/l，焦葡萄酸軸0.35 g/l，氨氧化軸0.6 g/U 碳酸軸 1.9g/L。
[00巧]作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的維生素種類及用量如下；維生素B7 0. 000015g/l，維 生素C用量0. 003 g/l，維生素B5用量0. 0025g/l，膽堿0. 0025 g/l，葉酸0. 0025 g/l，肌 醇0. 008g/l，煙醜胺0. 0025 g/L，化唆酵0. 0025 g/L，核黃素0. 00025 g/L，硫胺（維生素 BI) 0. 0025 g/l，維生素 B12 用量 0. 000015g/L。
[0036] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的氨基酸類及其用量是；丙氨酸0. 025 g/l，天冬醜胺酸 0. 02 g/l，精氨酸0. 08 g/l，天口冬氨酸0. 03 g/l，半脫氨酸0. 4 g/l，脫氨酸0. 08 g/l， 谷氨醜胺0.9 g/l，谷氨酸0.065g/L，甘氨酸0.025 g/l，組氨酸0.033 g/l，異亮氨酸 0. 052 g/l，亮氨酸0. 1 g/l，賴氨酸0. 1 g/l，蛋氨酸0. 1 g/l，苯丙氨酸0. 06/1，脯氨 酸0.035g/l，絲氨酸0.035 g/l，蘇氨酸0.09g/l，色氨酸0.02g/l，酪氨酸0.07g/l，額 氨酸 0. 025 g/L。
[0037] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的葡萄糖用量是10 g/L。
[003引作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的轉(zhuǎn)鐵蛋白是;APO脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，用量5 mg/L。
[0039] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的膜島素用量是lOOmg/L。
[0040] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的成纖維生長因子用量是l(K)ng/ml。
[0041] 實(shí)施例4 干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含了 W下組分：聚己二醇、聚己帰醇、無機(jī)鹽類、維生素、氨基酸、葡萄 糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膜島素、成纖維生長因子。
[0042] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的聚己二醇、聚己帰醇成分，是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，W溶解于 去離子水形式加入，聚己二醇用量的重量百分比為1%，分子量為2500,聚己帰醇用量的重 量百分比是0.001%，分子量為5000000。
[0043] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的無機(jī)鹽種類和用量是；氯化軸3. 5g/L，4-輕己基脈 嗦己賴酸6 g/l，砸酸軸0.0000025 g/l，硫酸鎮(zhèn)0.15 g/l，氯化鐘0.25 g/l，磯酸軸 0.085 g/l，硝酸鐘0.00008 g/l，氯化巧0.12 g/l，焦葡萄酸軸0.25 g/l，氨氧化軸 0. 35 g/l，碳酸軸 2. 5 g/L。
[0044] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的維生素種類及含量如下；維生素B7 0.0000015g/l， 維生素C用量0.0025 g/l，維生素B5用量0.005 g/l，膽堿0.0025 g/l，葉酸0.006 g/l， 肌醇0. 02 g/l，煙醜胺0.004 g/l，化唆酵0.004 g/l，核黃素0.004 g/l，硫胺(維生素BI) 0. 004 g/l，維生素 B12 用量 0.00001 g/L。
[0045] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的氨基酸類及其用量是：草醜己酸0.2 g/l，丙氨酸 0.015g/l，天冬醜胺酸0.015 g/l，精氨酸0.06g/l，天口冬氨酸0.025 g/l，半脫氨酸0.35 g/l，脫氨酸0. 055 g/l，谷氨醜胺0. 85 g/l，谷氨酸0. 065 g/l，甘氨酸0. 025 g/l，組 氨酸0.035 g/l，異亮氨酸0. 15 g/l，亮氨酸0. 15 g/l，賴氨酸0. 15 g/l，蛋氨酸0.025 g/l，苯丙氨酸〇.〇65g/l，脯氨酸0.035 g/l，絲氨酸0.035 g/l，蘇氨酸0.075 g/l，色氨 酸 0.02 g/l，酪氨酸 0.055 g/l，額氨酸 0.025 g/L。
[0046] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的葡萄糖用量是4. 5g/L。
[0047] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的成纖維生長因子用量是20ng/ml。
[0048] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的轉(zhuǎn)鐵蛋白是巧樣酸鐵，用量10 mg/L。
[0049] 作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分所用的類膜島素功能替代品是IGF-1/2,用量是0. 1 ng/L。
[0050] 本發(fā)明的干細(xì)胞培養(yǎng)基，用于干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)如下： 實(shí)驗(yàn)一： W實(shí)施例1中干細(xì)胞培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，此培養(yǎng)基含有FGF2 lOng/ml，培養(yǎng)連續(xù)進(jìn) 行了 5代(約30天)。
[0051] 此實(shí)驗(yàn)中用于陽性對(duì)照組的培養(yǎng)液是（1)含有N2和B27各Ix的DMEM-F12培養(yǎng) 液，含有 FGF2 20ng/ml;(2)含有 Knockout serum r巧Iacement 的 hESCs 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，含 有FGF2 lOng/ml。所有培養(yǎng)基每天更換一次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組初始種植細(xì)胞密度為1萬/每孔 (48孔板)，干細(xì)胞擴(kuò)增速度結(jié)果見圖1。
[005引由圖1結(jié)果證明：有PVA的化學(xué)組分確定的培養(yǎng)基，可W用于人類全能干細(xì)胞的培 養(yǎng)，且培養(yǎng)效果好于B27-N2-DMEM/F12配方和傳統(tǒng)的Knockout Serum R巧Iacement配方。
[0053] 實(shí)驗(yàn)二 干細(xì)胞培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)人類全能干細(xì)胞，在Matrigel鋪板狀態(tài)下進(jìn)行。作為細(xì)胞培 養(yǎng)基成分所用的水溶性高分子為聚己帰醇或者PEG (聚己二醇)或者PVP (聚己帰化咯焼麗） 成分，是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，W溶解于去離子水形式加入，高分子具體型號(hào)和其他縮寫見下表1。
[0054] 鋪板采用Matrigel,在non-TCPS下（1 ;100稀釋)，12小時(shí)37C。結(jié)果見圖2,圖 2中的12組實(shí)驗(yàn)為同時(shí)完成，組之間的對(duì)比說明了簡單添加水溶性高分子即可獲得化學(xué)組 分確定的培養(yǎng)基。相比常用商業(yè)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基能顯著提高人類全能干細(xì)胞的增殖能 力。
[00巧]水溶性高分子作為添加劑被加入DMEM/F12/N2培養(yǎng)基用于hESCs培養(yǎng)，細(xì)胞種植 密度為6, 000/well (24孔板）。培養(yǎng)72小時(shí)W后拍攝細(xì)胞形態(tài)的照片如圖3所示，照片說 明了 hESCs在有水溶性高分子添加劑的情況下，克隆形態(tài)緊密，呈未分化干細(xì)胞狀態(tài)。
[0056] 表1高分子具體型號(hào)和其它縮寫

【權(quán)利要求】
1. 干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包含以下組分：水溶性非聚電解質(zhì)高分子、無機(jī)鹽類、 維生素、氨基酸、葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素或類胰島素功能替代品、成纖維生長因子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述細(xì)胞培養(yǎng)基中含有以下非 聚電解質(zhì)水溶性高分子的一種或多種：聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，所述非聚電 解質(zhì)水溶性高分子的分子量范圍為500-5000000,所述培養(yǎng)基含有總非聚電解質(zhì)水溶性高 分子的質(zhì)量濃度為〇. 001%到10%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述非聚電解質(zhì)水溶性高分子 的分子量范圍為2000-200000,所述培養(yǎng)基含有總非聚電解質(zhì)水溶性高分子的質(zhì)量濃度為 0? 01% 到 7%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中 無機(jī)鹽的種類及用量如下：氯化鈉3-5g/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸5-7 g/L，硒酸鈉 〇.〇〇〇〇〇〇5-0. 0000060 g/L，硫酸鎂 0? 05-0. 2 g/L，氯化鉀 0? 15-0. 45 g/L，磷酸鈉 0.075-0.2 g/L，硝酸鉀 0.00005-0.00009 g/L，氯化鈣 0.08-0.25 g/L，焦葡萄酸鈉 0. 05-0. 4 g/L，氫氧化鈉 0. 3-0. 9 g/L，碳酸鈉 1.5-4. 5 g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中維生素的 組成及用量如下：維生素 B7 0. 000005-0. 000025g/L，維生素 C 0. 002-0. 004 g/L，維生素 B5 0.002-0.006 g/L，膽堿 0.002-0. 006 g/L，葉酸 0.002-0. 006 g/L，肌醇 0.005-0. 02 g/ L，煙酰胺 0.002-0. 006 g/L，吡哆醛 0.002-0. 006 g/L，核黃素 0.0002-0. 0006 g/L，硫胺 0.002-0.006 g/L，維生素 B12 0? 000005-0. 000025 g/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸種 類及其用量如下：丙氨酸0.015-0. 035 g/L，天冬酰胺酸0.01-0. 035 g/L，精氨酸0.06-0. 10 g/L，天門冬氨酸0.02-0. 04 g/L，半胱氨酸0.3-0. 5 g/L，胱氨酸0.05-0.2 g/L，谷氨 酰胺 0.8-1. 5 g/L，谷氨酸 0.06-0.09 g/L，甘氨酸 0.02-0.04 g/L，組氨酸 0.03-0.05 g/L，異亮氨酸 0.05-0.25 g/L，亮氨酸 0.05-0.25 g/L，賴氨酸 0.05-0.25 g/L，蛋氨酸 0.02-0.04 g/L，苯丙氨酸 0.055-0. 075g/L，脯氨酸 0.03-0.05 g/L，絲氨酸 0.03-0.055 g/L，蘇氨酸 0.07-0.15 g/L，色氨酸 0.005-0.025 g/L，酪氨酸 0.05-0.15 g/L，纈氨酸 0.02-0.04 g/L〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖用 量為 l-l〇g /L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白 用量為 l-l〇〇mg/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中胰島素或 類胰島素功能替代品的用量是l-l〇〇mg/L。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于：所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中成纖維生 長因子用量是〇. lng-100ng/ml。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK104357379SQ201410517249
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】劉興宇, 王猛, 韓雪, 竺亞斌 申請(qǐng)人:劉興宇