ClCAC基因和ClSAND基因在西瓜果實基因表達(dá)分析中作為內(nèi)參基因的應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明屬于基因表達(dá)分析【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，具體涉及ClCAC基因和ClSAND基因在西瓜果實發(fā)育過程中用作為基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因的應(yīng)用。本發(fā)明為ClCAC和ClSAND基因設(shè)計了特異引物，該引物跨基因上相鄰的2個外顯子的接頭位點，以基因組DNA為模板時無擴(kuò)增產(chǎn)物，以cDNA為模板是可以擴(kuò)增出目標(biāo)片段，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1-4所示。通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測表明，ClCAC基因和ClSAND基因在不同基因型、不同坐果方式的西瓜果實的不同發(fā)育階段均能穩(wěn)定表達(dá)，是西瓜果實發(fā)育過程中利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測基因表達(dá)分析的可靠內(nèi)參基因組合。該內(nèi)參基因組合具有表達(dá)穩(wěn)定性好、不受cDNA樣品中是否存在基因組DNA污染影響等優(yōu)點。【專利說明】CICAC基因和CISAND基因在西瓜果實基因表達(dá)分析中作為內(nèi)參基因的應(yīng)用【
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】[0001]本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)【
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】，涉及基因表達(dá)分析過程中所需的內(nèi)參基因?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]目前，實時熒光定量PCR(簡稱為qRT-PCR)已經(jīng)被廣泛地用于基因表達(dá)的定量分析，以及RNA-seq和基因芯片結(jié)果的驗證。該技術(shù)簡單，快速，但其結(jié)果的可靠性依賴于選擇表達(dá)穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。內(nèi)參基因的作用主要是去除樣品準(zhǔn)備和qRT-PCR分析過程中非生物變異的干擾，如RNA提取的質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄的效率、qRT-PCR分析中的擴(kuò)增效率等。因此，qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上受內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響，使用表達(dá)不穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參會導(dǎo)致目的基因的表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)生很大的偏差。[0003]當(dāng)前在西瓜中利用qRT-PCR分析基因表達(dá)的研究中，選用的內(nèi)參基因主要是過去用于RT-PCR等技術(shù)進(jìn)行定性分析時的內(nèi)參基因，如：Actin，18SrRNA等，然而這些傳統(tǒng)內(nèi)參的表達(dá)存在著一定的變異，并不適用于qRT-PCR這樣靈敏度很高的分析技術(shù)。NormFinder等基因表達(dá)穩(wěn)定性評價方法的出現(xiàn)，大大提商了人們篩選表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因的準(zhǔn)確性（AndersenCL,JensenJL,OrntoftTF:Normalizationofreal-timequantitativereversetranscription-PCRdata:Amodel-basedvarianceestimationapproachtoidentifygenessuitedfornormalization,appliedtobladderandcoloncancerdatasets.CancerRes2004,64(15):5245-5250.)。最近有研究篩選出了西瓜在正常生長、生物脅迫和非生物脅迫條件下的內(nèi)參基因（KongQ,YuanJ,GaoL,ZhaoS,Jiangff,HuangY,BieZ:IdentificationofSuitableReferenceGenesforGeneExpressionNormalizationinqRT-PCRAnalysisinWatermelon.PLoSONE2014,9(2):e90612.)〇該研究認(rèn)為，西瓜在正常生長條件下至少需要9個內(nèi)參基因才能對目標(biāo)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。顯然使用如此多的內(nèi)參基因是不合理的，尤其是當(dāng)目標(biāo)基因的數(shù)目非常少的時候。并且，越來越多研究認(rèn)為沒有普遍適用的內(nèi)參基因。西瓜被認(rèn)為是研究非呼吸躍變型果實發(fā)育的理想模式作物，但目前對西瓜果實基因進(jìn)行表達(dá)分析時，仍使用表達(dá)穩(wěn)定性缺乏系統(tǒng)驗證的ISSrRNA作為內(nèi)參基因，這嚴(yán)重影響了西瓜果實發(fā)育過程中進(jìn)行基因表達(dá)定量分析的準(zhǔn)確性。[0004]番茄紅素是紅肉西瓜果實中一種主要的類胡蘿卜素，八氫番茄紅素合成酶（PSY)催化了類胡蘿卜素合成路徑中的第一步反應(yīng)，是調(diào)控西瓜果實類胡蘿卜素含量的一種關(guān)鍵酶。通過西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到PSY家族基因有兩個成員，ClPSYl(Cla009122)和C1PSY2(Cla005425)，但僅C1PSY1在西瓜果實中調(diào)控番茄紅素的積累（StefaniaG,GabriellaP,JeML,YiZ,ZhangF,GiuseppeD,JamesJG,MarcelloSL:ComparativegenomicsrevealscandidatecarotenoidpathwayregulatorsofripeningWatermelonfruit.BMCGenomics2013,14:781)。因此，分析C1PSY1在西瓜果實中的動態(tài)表達(dá)變化及其與番茄紅素的積累量的相關(guān)性，可以用來檢測內(nèi)參基因的可靠性?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]為解決在西瓜果實發(fā)育過程中進(jìn)行基因表達(dá)分析時缺乏經(jīng)系統(tǒng)驗證的、表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因問題，本發(fā)明提供了專門用于西瓜果實發(fā)育過程中基因表達(dá)分析的可靠的內(nèi)參基因，該內(nèi)參基因不僅在西瓜果實發(fā)育過程中表達(dá)穩(wěn)定，而且還可以不受cDNA樣品中存在基因組DNA污染的影響。[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：選擇12個在其他作物的果實中被驗證為穩(wěn)定的或目前在西瓜果實中使用的基因作為候選內(nèi)參基因，為其中10個候選內(nèi)參基因設(shè)計了跨外顯子接頭位點的引物，使其在基因組DNA模板上無擴(kuò)增產(chǎn)物；用qRT-PCR分析了這12個候選內(nèi)參基因在不同基因型、不同坐果方式和果實發(fā)育階段的48個西瓜果實樣本中的表達(dá)量；用NormFinder軟件計算候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值，確定C1CAC為西瓜果實發(fā)育過程中表達(dá)最為穩(wěn)定的單個內(nèi)參基因、C1CAC和C1SAND為最佳內(nèi)參組合；分別用單個C1CAC基因、C1CAC和C1SAND組合標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因C1PSY1基因的表達(dá)，以18SrRNA為對照，發(fā)現(xiàn)用C1CAC或C1CAC和C1SAND組合作內(nèi)參時，C1PSY1基因的表達(dá)模式與西瓜果實中番茄紅素生物合成表現(xiàn)出了很好的相關(guān)性，而以18SrRNA為內(nèi)參定量C1PSY1基因的表達(dá)與西瓜果實中番茄紅素生物合成并無相關(guān)性，從而驗證了C1CAC或C1CAC和C1SAND組合作為內(nèi)參基因?qū)ξ鞴瞎麑嵃l(fā)育過程中基因表達(dá)進(jìn)行相對定量的可靠性。[0007]本發(fā)明的特點在于：為候選內(nèi)參基因設(shè)計了跨相鄰?fù)怙@子接頭位點的引物，可以排除cDNA樣品中存在基因組DNA污染對結(jié)果的影響；全面分析了不同基因型、不同坐果方式和不同發(fā)育階段對候選基因表達(dá)的影響；篩選出專門用于西瓜果實發(fā)育過程中基因表達(dá)分析的單個內(nèi)參基因C1CAC和內(nèi)參組合C1CAC和C1SAND;用C1CAC或C1CAC和C1SAND組合為內(nèi)參對C1PSY1基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量，發(fā)現(xiàn)C1PSY1基因的表達(dá)模式與西瓜果實中番茄紅素積累表現(xiàn)出了一致性，進(jìn)一步證實了C1CAC或C1CAC和C1SAND組合作為西瓜果實發(fā)育過程中基因表達(dá)分析時內(nèi)參基因的可靠性。[0008]本發(fā)明的優(yōu)點是：[0009](1)首先，專門針對于西瓜果實發(fā)育過程中基因表達(dá)變化，第一次篩選出了表達(dá)穩(wěn)定的、適用于做內(nèi)參的單個C1CAC基因、C1CAC基因和C1SAND基因組合；其次，為穩(wěn)定的內(nèi)參基因設(shè)計了跨相鄰?fù)怙@子接頭位點的引物，使之不會受到cDNA樣品中可能存在的基因組DNA污染的干擾。[0010](2)可靠性。首先，本發(fā)明考慮到基因型、坐果方式和不同發(fā)育階段對候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定的影響，從而選出了表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因；其次，本發(fā)明用C1PSY1基因的表達(dá)模式及其與西瓜果實中番茄紅素積累的相關(guān)性，證實了C1CAC和C1SAND內(nèi)參基因組合的可靠性。[0011](3)實用性。首先，本發(fā)明具有廣泛的適用性，可以用于不同基因型、不同坐果方式和不同發(fā)育階段的西瓜果實樣品中基因表達(dá)分析時的內(nèi)參基因，為西瓜果實發(fā)育中基因表達(dá)分析提供了一個一致的比較標(biāo)準(zhǔn)；其次，由于C1CAC和C1SAND基因在基因組DNA上都無擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，無論cDNA樣品中是否存在基因組DNA污染，本內(nèi)參組合都可以使用，所以更加實用?！緦＠綀D】【附圖說明】[0012]圖1:候選內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。[0013]圖2:用C1CAC基因及C1CAC和C1SAND組合基因標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因（C1PSY1基因）的表達(dá)，以18SrRNA為對照，檢驗C1PSY1基因的表達(dá)模式及其與西瓜果實中番茄紅素積累的相關(guān)性。[0014]圖3:分別用單個C1CAC以及C1CAC和C1SAND組合為內(nèi)參時C1PSY2基因在西瓜果實成熟過程中的相對表達(dá)量。[0015]圖4:分別用單個C1CAC以及C1CAC和C1SAND組合為內(nèi)參時C1ZDS基因在西瓜果實成熟過程中的相對表達(dá)量。[0016]圖5:分別用單個C1CAC以及C1CAC和C1SAND組合為內(nèi)參時C1CHYB1基因在西瓜果實成熟過程中的相對表達(dá)量?！揪唧w實施方式】[0017]實施例1[0018](1)植物材料和處理：選用西瓜自交系97103和F1代雜交種8424為材料，種植在塑料大棚中，開花前一天對即將開花的子房進(jìn)行套袋隔離。開花當(dāng)天分別進(jìn)行人工授粉和CPPU處理誘導(dǎo)西瓜坐果。CPPU(氯吡脲0.1%;四川國光農(nóng)化股份有限公司）使用濃度為20mg/L，早晨8h取下紙袋，均勻噴在西瓜子房上，然后再套袋隔離，防止傳粉。每個處理重復(fù)3次，隨機排列。分別在授粉及CPPU處理后0,1，3,5,7,10,12,18,23,27,30和35天對果實進(jìn)行取樣，每個處理隨機取3個果實，作為每一個取樣點的生物學(xué)重復(fù)。授粉和CPPU處理后〇，1，3天取子房，3天后的果實取中心果肉，液氮速凍，-80°C保存。[0019]⑵總RNA的分離，第一鏈cDNA的合成和DNA的分離：西瓜果實樣本采用TaKaRa(PlantRNAExtractionKit;包含gDNA去除的步驟）分離總RNA，每一個品種不同的處理間均有3個生物學(xué)重復(fù)。用Nanodrop2000檢測RNA的濃度和質(zhì)量，A260/A280和A260/A230的比值要在1.8-2之間。RNA的完整性采用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電泳圖譜28S，18S條帶清晰，表明RNA完整性較好。RNA檢測合格后，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。luL總RNA米用PrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa)試劑盒首先進(jìn)行g(shù)DNA去除步驟，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（兩步法：37°C15min;85°C5s)形成20iiL第一鏈cDNA。兩個品種不同處理間樣本分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后每一份材料進(jìn)行重復(fù)，作為備份。-80°C保存?；蚪MDNA的分離，采用西瓜葉片作為材料，使用天根生化有限公司試劑盒-植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。[0020](3)候選內(nèi)參基因的選擇，引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增：選擇CAC，PP2A，RAN，RPS15，SAND，TBP2,TIP41，TUA5,TUB和UPL7作為候選內(nèi)參基因，在擬南芥網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/)搜索對應(yīng)的擬南芥cDNA序列的ID,然后在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)對西瓜Q)S進(jìn)行BLASTN，得到西瓜的同源基因ID，用Primed采用跨外顯子接頭位點的方式設(shè)計引物，引物產(chǎn)物的擴(kuò)增長度控制在80-200bp之間。而Actin，18SrRNA引物參考文獻(xiàn)中報道的序列（KongQ，YuanJ，GaoL,ZhaoS,Jiangff,HuangY,BieZ:IdentificationofSuitableReferenceGenesforGeneExpressionNormalizationinqRT-PCRAnalysisinWatermelon.PLoSONE2014,9(2):e90612.)。最終，西瓜物種名的縮寫詞"Cl"被添加到已通過鑒定的西瓜特異性同源基因名前。用合成的引物對混合樣的cDNA和gDNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增（常規(guī)PCR程序：95°〇預(yù)變性5!^11，941：變性3〇8,561：退火3〇8,721：延伸3〇8,31個循環(huán)，721：延伸4111111)，PCR的擴(kuò)增采用2XPCR反應(yīng)物（天根生化科技有限公司），產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，候選內(nèi)參基因（C1CAC，C1PP2A，C1RAN，C1RPS15,C1SAND，C1TBP2,C1TIP41，C1TUA5，C1TUB，C1UPL7)cDNA條帶清晰，gDNA無條帶表明該引物具有特異性，并排除了gDNA的污染。C1ACT在gDNA模板上擴(kuò)增出的產(chǎn)物長度大于cDNA模板，表明C1ACT在gDNA上的擴(kuò)增片段中包含了內(nèi)含子序列。同時，C1ACT在gDNA和cDNA模板上都唯一的擴(kuò)增出了目標(biāo)片段，表明樣品cDNA中不存在gDNA污染。而18SrRNA在cDNA和gDNA模板上都擴(kuò)增出了相同的片段，表明使用該基因作為內(nèi)參無法判斷cDNA樣品中有無gDNA的污染，同時，當(dāng)有g(shù)DNA污染存在時，也無法排除其對結(jié)果的干擾。候選內(nèi)參基因的引物序列及擴(kuò)增特征見表1，其擴(kuò)增特異性檢測結(jié)果見圖1。[0021]表1候選內(nèi)參基因的引物序列及qRT-PCR的擴(kuò)增特征[0022]【權(quán)利要求】1.C1CAC基因和C1SAND基因在采用實時熒光定量PCR分析西瓜果實的基因表達(dá)時作為內(nèi)參基因的應(yīng)用，其特征是：(1)ClCAC基因單獨作為西瓜果實基因表達(dá)分析中的內(nèi)參基因；或(2)C1CAC基因和C1SAND基因組合的幾何平均數(shù)作為西瓜果實基因表達(dá)分析中的內(nèi)參基因，所述C1CAC基因的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示，所述C1SAND基因的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。2.-種采用實時熒光定量PCR分析西瓜果實基因表達(dá)的方法，其特征是：(1)ClCAC基因單獨作為西瓜果實基因表達(dá)分析中的內(nèi)參基因；或(2)C1CAC基因和C1SAND基因組合的幾何平均數(shù)作為西瓜果實基因表達(dá)分析中的內(nèi)參基因，所述C1CAC基因的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示，所述C1SAND基因的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。3.如權(quán)利要求2所述的采用實時熒光定量PCR分析西瓜果實基因表達(dá)的方法，其特征是：所述C1CAC基因的跨相鄰?fù)怙@子接頭的引物核苷酸序列是：正向引物序列：GAACTTGGCACCTGTCCTGT反向引物序列：GAACAGTGCAACAGCCTCAA;所述C1SAND基因的跨相鄰?fù)怙@子接頭的引物核苷酸序列是：正向引物序列：TGCAAACATAAGGTTATCAGTCTTG反向引物序列：GCATACAAAAACGCCATAGGA?！疚臋n編號】C12Q1/68GK104342438SQ201410510145【公開日】2015年2月11日申請日期:2014年9月28日優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日【發(fā)明者】別之龍,孔秋生,袁靜賢,高凌云,黃遠(yuǎn),程菲申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)