一種用于檢測五常大米主要品種的引物對、檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測五常大米主要品種的引物對、檢測試劑盒及其檢測方法，所述引物對，包括：特征DNA片段S48-468引物對，核苷酸序列為SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；特征DNA片段S75-632/692引物對，核苷酸序列為SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；特征DNA片段S43-1000引物對，核苷酸序列為SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示；特征DNA片段SBE1引物對，核苷酸序列為SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示；特征DNA片段S73-2438引物對，核苷酸序列為SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)通過一次多重PCR反應(yīng)進(jìn)行五常大米主要品種鑒定的目的，從而實(shí)現(xiàn)對五常大米品種的快速檢測。
【專利說明】-種用于檢測五常大米主要品種的引物對、檢測試劑盒及 其檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)方法檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于檢測五常大米主要品 種的引物對及其檢測方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003] 一、五常大米主要品種 按GB/T19266-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品五常大米》標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，五常大米可使用的品種被 界定為"五優(yōu)稻、松粳系列及通過審定的其它符合五常種植條件的優(yōu)質(zhì)粳稻品種"，據(jù)估計(jì)， 五常大米有40多個(gè)品種。按照文獻(xiàn)及網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫查詢到的信息，五常大米的主要品種有： (1)五優(yōu)稻系列：包括由田永太育成的五優(yōu)稻1號(hào)及五優(yōu)稻4號(hào)(五優(yōu)稻4號(hào)為目前五常大 米主栽品種)，以及不同育種單位以五優(yōu)稻1號(hào)為親本選育出的大米品種，如五常市龍鳳山 長粒香水稻研究所和五常市種子公司育成的五優(yōu)稻3號(hào)（五優(yōu)C)，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院五 常水稻研究所育成的五優(yōu)稻A，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所育成的龍稻7號(hào)、龍香 稻2號(hào)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的東農(nóng)425、東農(nóng)426、東農(nóng)427、東農(nóng)428、東農(nóng)429、東農(nóng)430,黑 龍江省五常種子公司和哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)工程所育成的五工稻1號(hào)，黑龍江省監(jiān)獄 管理局農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的龍盾106,這些品種在遺傳上均為五優(yōu)稻1號(hào)的后代。（2)松 粳系列：包括由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院第二水稻所育成的松粳3、松粳6、松粳7、松粳8、松粳 9、松粳10、松粳12,黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院五常水稻研究所育成的松粳香1號(hào)、松粳香2號(hào)， 松粳系列的部分品種與五優(yōu)稻1號(hào)具有遺傳親緣關(guān)系。
[0004] 從遺傳系譜看，五優(yōu)稻1號(hào)骨干親本是從松粳3號(hào)品系變異個(gè)體中經(jīng)系統(tǒng)選育成， 而以五優(yōu)稻1號(hào)為親本培育出的品種有：五工稻1號(hào)、五優(yōu)稻3號(hào)、五優(yōu)稻4號(hào)、松粳7號(hào)、松 粳8號(hào)、松粳9號(hào)、松粳12號(hào)、龍稻7號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)426、東農(nóng)427、東農(nóng)428、東農(nóng)429、 東農(nóng)430、龍盾106。因而，上述這些品種與五優(yōu)稻1號(hào)及五優(yōu)稻4號(hào)親緣關(guān)系相近。
[0005] 二、五常大米主栽品種五優(yōu)稻4號(hào)的特征 據(jù)專家估計(jì)，五常市的200萬畝水稻種植田中，約90%的稻田種植五優(yōu)稻4號(hào)，五優(yōu)稻 4號(hào)是五常大米的主栽品種。五優(yōu)稻4號(hào)由黑龍江省五常市中糧美裕長粒香水稻研究所的 田永太于1999年育成，是從五優(yōu)稻1號(hào)優(yōu)良變異株中經(jīng)4代系統(tǒng)選育而成的常規(guī)種，并于 2009年通過審定（審定編號(hào)為黑審稻2009005)。五優(yōu)稻4號(hào)為晚熟品種，生育期138-140 天，所需活動(dòng)積溫2800°C，株高98-105cm，穗長25cm，穗粒數(shù)110粒，千粒重28g，分蘗能力 中上，抗病性強(qiáng)，抗倒能力中等。受產(chǎn)區(qū)獨(dú)特的地理、氣候等影響，五優(yōu)稻4號(hào)干物質(zhì)積累 多、水稻成熟期產(chǎn)區(qū)晝夜溫差大，大米中可速溶的雙鏈糖積累較多。但五優(yōu)稻4號(hào)存在熟期 晚，抗倒能力差等缺點(diǎn)，栽培方法不當(dāng)就可能導(dǎo)致成熟期拖后、倒伏而嚴(yán)重減產(chǎn)。
[0006] 綜合多個(gè)研究資料，五優(yōu)稻4號(hào)糙米率為82?84%，精米率為70?76%，整精米率 為65?70%，長寬比為2. 5?2. 7,堊白度為1?3%，膠稠度為67?73mm，直鏈淀粉為17? 18%，蛋白質(zhì)含量為6. 0?6. 6%，食味評分為85?93分，屬于一級優(yōu)質(zhì)米。五優(yōu)稻4號(hào)品種 粒型細(xì)長，五優(yōu)稻4號(hào)的米粒為長粒，青白透明，蒸煮時(shí)具備特有的清香味，飯粒表面有油 光，口感綿軟略粘、微甜、略有韌性，冷卻后仍保持良好口感，剩飯不回生。與五優(yōu)稻4號(hào)在 米粒型狀相似的品種出現(xiàn)較多(如松粳6號(hào)、松粳7號(hào)、松粳9號(hào)、五優(yōu)稻1號(hào))，但遠(yuǎn)不及五 優(yōu)稻4號(hào)食味好。
[0007] 三、五常大米的常見摻假手段 五常市水稻種植面積不是很大，年產(chǎn)僅80萬噸，而每年國內(nèi)市場銷售的五常大米達(dá) 1000多萬噸，可見市面上銷售的五常大米存在較多的摻假造假現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，不法商家使用 639或非五常產(chǎn)的普通長粒米冒充"稻花香"，或?qū)⑾商蚁忝缀臀宄A江米混合冒充"五常稻 花香"，或在普通大米中添加香精冒充"五常稻花香"。五常大米主栽品種五優(yōu)稻4號(hào)的出米 率最高為每100斤出米58斤，收購價(jià)在2. 4-2. 7元/斤，價(jià)格在10元/斤以上的才有可能 是100%純正的五優(yōu)稻4號(hào)。因而，由于五常大米(特別是五優(yōu)稻4號(hào))獨(dú)特和美味的品質(zhì)及 口感，正宗的五常大米價(jià)格較為昂貴，給了不法大米企業(yè)及商家有利可圖的造假動(dòng)機(jī)。
[0008] 五常市共有290多家大米生產(chǎn)企業(yè)，目前核準(zhǔn)允許使用地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品專用標(biāo) 志的大米企業(yè)為92家，仍有一些企業(yè)在第二批申請使用地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品專用標(biāo)志。在米 業(yè)公司實(shí)際生產(chǎn)和銷售過程中，存在較多不規(guī)范行為：（1)由于五優(yōu)稻4號(hào)的稻谷收購價(jià) 常年較低，因而米業(yè)公司一般會(huì)默許農(nóng)民摻入其它的米。當(dāng)米業(yè)公司生產(chǎn)的米摻雜有其它 的品種時(shí)，米業(yè)公司常見的解決方法是不使用地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品專用標(biāo)志，而改用較模棱 兩可的標(biāo)志，廠址注明為五常市，并經(jīng)常使用"稻花香"等非正規(guī)命名，以規(guī)避標(biāo)簽不合格情 況。（2)由于地理環(huán)境條件相近，吉林省榆樹縣及黑龍江省尚志縣種植的五優(yōu)稻4號(hào)與五常 市的五優(yōu)稻4號(hào)口感相差不大，但由于吉林省榆樹縣及黑龍江省尚志縣不屬于五常大米地 理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)區(qū)域，因而此兩個(gè)地方產(chǎn)出的五優(yōu)稻4號(hào)多賣入五常市，并由五常市加工 出售。（3)不法商家直接使用非五常大米品種進(jìn)行冒充或摻雜。
[0009] 常用于摻入五優(yōu)稻4號(hào)的大米品種有639、東農(nóng)425、東農(nóng)428、吉林101、農(nóng)陽16 號(hào)。在摻假的品種中，由于639不抗病，現(xiàn)在種植較少，而東農(nóng)425、東農(nóng)428最常用于五常 大米的摻假。由于東農(nóng)425、東農(nóng)428與五優(yōu)稻4號(hào)遺傳親緣關(guān)系近，米粒外型極為相近，給 鑒定工作帶來極大難度。
[0010] 五常大米摻假造假現(xiàn)象非常嚴(yán)重，不僅造成了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重?fù)p害了 "五常大米"的品牌形象，破壞了"地理標(biāo)志"產(chǎn)品的信譽(yù)，影響了市場秩序，給監(jiān)管工作帶來 極大的困難。
[0011] 四、現(xiàn)有的五常大米品種鑒定方法 五常大米品種的鑒定僅是由育種專家的肉眼觀察和經(jīng)驗(yàn)判斷，目前仍無有效的鑒定方 法，主要原因在于：（1)五常大米主要品種眾多，達(dá)40多種，且多數(shù)品種親緣關(guān)系相近，部 分品種的大米外觀極為相近(如東農(nóng)425、東農(nóng)428與五優(yōu)稻4號(hào)的大米外觀相近)，感官鑒 定方法的準(zhǔn)確度在很大程度上依賴于育種專家的知識(shí)水平和經(jīng)驗(yàn)，很容易出現(xiàn)誤判結(jié)果。 (2)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫上無五常大米主要品種的DNA序列，因而無法直接通過五常大米主要品種 的DNA序列設(shè)計(jì)引物，以達(dá)到通過DNA方法鑒別五常大米主要品種的目的。（3)五常大米的 品種多，需要搜集五常大米主要品種以及摻雜至五常大米的常見大米品種的難度較大。
[0012]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明目的在于提供用于檢測五常大米主要品種的引物對及其試劑盒和檢測方 法。本發(fā)明使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD)對五常大米主要品種(五優(yōu)稻4號(hào)及其衍生品 種、五優(yōu)稻1號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)428、松粳9號(hào)、松粳6號(hào)、松粳3號(hào)、松粳香2號(hào)）以及摻雜 至五常大米的常見品種（639、綏精4號(hào)等）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出各品種特異性條帶， 開發(fā)成SCAR標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)通過一次多重PCR反應(yīng)進(jìn)行五常大米主要品種鑒定的目的，從而 實(shí)現(xiàn)對五常大米品種的快速檢測。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為： 1、一種用于檢測五常大米主要品種的引物對，包括： 特征DNA片段S48-468引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2所示； 特征DNA片段S75-632/692引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 所示； 特征DNA片段S43-1000引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示； 特征DNA片段SBE1引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8 所示； 特征DNA片段S73-2438引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示。
[0015] 2、包括前述引物對的五常大米主要品種檢測試劑盒。
[0016] 一種檢測五常大米主要品種的方法，包括步驟： (1) 配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增； (2) PCR 擴(kuò)增條件為：95°C 3min;95°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)，72°C 10min ； (3) 凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017] 所述PCR反應(yīng)體系為： 10XPCR buffer 2μ L dNTP mixture (各 2. 5mM) 1. 6 μ L MgCl2 (25mM) 1. 2μ L 7? 酶（5U/yL) 0. 1 μ L 引物 l(10uM) 各O.lyL 引物 2(10uM) 各 0.2yL DNA 模板（50ng/y L) 2μ L 滅菌超純水 11.9yL 總體積 20 μ L。
[0018] 注：引物 1 指 SEQ ID NO :1 ?8 ;引物 2 指 SEQ ID NO :9 ?10 ;10XPCR buffer 含 lOOmM Tris-HCl (pH8. 3)、500mM KC1。
[0019]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖 1 特征 DNA 片段 S48-468 引物擴(kuò)增結(jié)果。注：M :100bp DNA Ladder Marker ;C : PCR空白對照；1-23 :五優(yōu)稻4號(hào)-1、五優(yōu)稻4號(hào)-2、五優(yōu)稻4號(hào)-19、五優(yōu)稻4號(hào)-20、五優(yōu)稻 1號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)428、639、松粳9號(hào)、松粳6號(hào)、松粳3號(hào)、松粳香2號(hào)、清荷香1號(hào)、長粒 香、緩粳4號(hào)、緩香5號(hào)、五優(yōu)稻4號(hào)-6、沃科收05-97、五優(yōu)稻4號(hào)(早2)、五優(yōu)稻4號(hào)-16、 沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1號(hào)。
[0021] 圖 2 特征 DNA 片段 S75-632/692 引物擴(kuò)增結(jié)果。注：M :lkb plus DNA Ladder ;C : PCR空白對照；1-23 :五優(yōu)稻4號(hào)-1、五優(yōu)稻4號(hào)-2、五優(yōu)稻4號(hào)-19、五優(yōu)稻4號(hào)-20、五優(yōu)稻 1號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)428、639、松粳9號(hào)、松粳6號(hào)、松粳3號(hào)、松粳香2號(hào)、清荷香1號(hào)、長粒 香、緩粳4號(hào)、緩香5號(hào)、五優(yōu)稻4號(hào)-6、沃科收05-97、五優(yōu)稻4號(hào)(早2)、五優(yōu)稻4號(hào)-16、 沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1號(hào)。
[0022] 圖 3 特征 DNA 片段 S43-1000 引物擴(kuò)增結(jié)果。注：M :lkb plus DNA Ladder ;C :PCR 空白對照；1_23 :五優(yōu)稻4號(hào)-1、五優(yōu)稻4號(hào)-2、五優(yōu)稻4號(hào)-19、五優(yōu)稻4號(hào)-20、五優(yōu)稻1 號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)428、639、松粳9號(hào)、松粳6號(hào)、松粳3號(hào)、松粳香2號(hào)、清荷香1號(hào)、長粒 香、緩粳4號(hào)、緩香5號(hào)、五優(yōu)稻4號(hào)-6、沃科收05-97、五優(yōu)稻4號(hào)(早2)、五優(yōu)稻4號(hào)-16、 沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1號(hào)。
[0023] 圖 4 特征 DNA 片段 SBE1 引物擴(kuò)增結(jié)果。注：M :100bp DNA Ladder Marker ;C :PCR 空白對照；1_23 :五優(yōu)稻4號(hào)-1、五優(yōu)稻4號(hào)-2、五優(yōu)稻4號(hào)-19、五優(yōu)稻4號(hào)-20、五優(yōu)稻1 號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)428、639、松粳9號(hào)、松粳6號(hào)、松粳3號(hào)、松粳香2號(hào)、清荷香1號(hào)、長粒 香、緩粳4號(hào)、緩香5號(hào)、五優(yōu)稻4號(hào)-6、沃科收05-97、五優(yōu)稻4號(hào)(早2)、五優(yōu)稻4號(hào)-16、 沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1號(hào)。
[0024] 圖 5 特征 DNA 片段 S73-2438 引物擴(kuò)增結(jié)果。注：M :lkb plus DNA Ladder ;C :PCR 空白對照；1_23 :五優(yōu)稻4號(hào)-1、五優(yōu)稻4號(hào)-2、五優(yōu)稻4號(hào)-19、五優(yōu)稻4號(hào)-20、五優(yōu)稻1 號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)428、639、松粳9號(hào)、松粳6號(hào)、松粳3號(hào)、松粳香2號(hào)、清荷香1號(hào)、長粒 香、緩粳4號(hào)、緩香5號(hào)、五優(yōu)稻4號(hào)-6、沃科收05-97、五優(yōu)稻4號(hào)(早2)、五優(yōu)稻4號(hào)-16、 沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1號(hào)。
[0025] 圖6特征DNA片段引物多重PCR擴(kuò)增結(jié)果。注：M:lkb plus DNA Ladder ;C:PCR 空白對照；1_23 :五優(yōu)稻4號(hào)-1、五優(yōu)稻4號(hào)-2、五優(yōu)稻4號(hào)-19、五優(yōu)稻4號(hào)-20、五優(yōu)稻1 號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)428、639、松粳9號(hào)、松粳6號(hào)、松粳3號(hào)、松粳香2號(hào)、清荷香1號(hào)、長粒 香、緩粳4號(hào)、緩香5號(hào)、五優(yōu)稻4號(hào)-6、沃科收05-97、五優(yōu)稻4號(hào)(早2)、五優(yōu)稻4號(hào)-16、 沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1號(hào)。
[0026] 圖7五常大米主要品種的特征DNA指紋圖譜。從左到右，第一排分別是：五優(yōu)稻4 號(hào)及其衍生品種；東農(nóng)425、東農(nóng)428 ;松粳9號(hào)；五優(yōu)稻1號(hào)、松粳6號(hào)；松粳香2號(hào)；從左 到右，第二排分別是：639、松粳3號(hào)、綏香5號(hào)、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1號(hào)；綏粳 4號(hào)；長粒香；沃科收05-97。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 一、五常大米主要品種特征DNA片段開發(fā) (1)本研究使用的五常大米品種 五常大米主要品種：五優(yōu)稻4號(hào)、五優(yōu)稻1號(hào)、東農(nóng)425、東農(nóng)428、松粳9號(hào)、松粳6號(hào)、 松粳香2號(hào)、清荷香1號(hào)、五優(yōu)稻4號(hào)(早2)。
[0028] 其它品種有：639、長粒香、綏粳4號(hào)、綏香5號(hào)、沃科收05-97、沃科收05-97、沃科 收05-38、沃科收05-98、通粘1號(hào)。
[0029] 在五常大米主要品種中，目前主栽品種為五優(yōu)稻4號(hào)，五常市的200萬畝水稻種植 田中，約90%的稻田種植五優(yōu)稻4號(hào)。
[0030] (2 ) DNA模板的制備 用粉碎機(jī)粉碎樣品，稱取約l〇〇mg，加入800 μ L 2%CTAB提取液，65°C水浴3h ;12000rpm 離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管；加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)，混合成均 勻相，12000rpm離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管；加入等體積氯仿：異戊醇（24 :1), 混合成均勻相，12000rpm離心lOmin,將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管；加入1/10體積3mol/L乙 酸鈉 （pH5. 2)和等體積異丙醇，-20°C沉淀過夜；12000rpm離心15min，倒去上清；使用70% 乙醇洗漆沉淀兩次，超凈臺(tái)中吹干；加入50μ L滅菌去離子水(含lmg/mL RNase)溶解沉淀， 37°C水浴30min ;使用紫外分光光度計(jì)測定分光，準(zhǔn)確稀釋到50ng/l·! L，-20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0031] (3)特征DNA片段篩選及引物設(shè)計(jì) 通過使用100個(gè)RAro引物對上述五常大米品種進(jìn)行RAPD-PCR反應(yīng)，從中篩選出可用 于五常大米品種鑒定的5個(gè)特征DNA片段，5個(gè)特征DNA片段分別為S48-468、S75-632/692、 S43-1000、SBE1、S73-2438,并在此5個(gè)特征DNA片段的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)SCAR引物。
[0032] 引物設(shè)計(jì)使用DNAMAN軟件進(jìn)行，考慮到進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮的因 素為：（1)將該片段的兩端RAro引物設(shè)置為SCAR引物的5'端或3'端，從而保證SCAR引 物與RAPD引物具有相同的特異性；（2)各條引物的Tm值統(tǒng)一為62°C左右，以保證在同一 退火溫度下各引物的擴(kuò)增效果一致；（3)各引物形成的二聚體少，以減少引物二聚體損耗； (4)引物在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對時(shí)特異性好，以保證方法的有效性。
[0033] (4 )單重PCR反應(yīng)液配制

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測五常大米主要品種的引物對，包括： 特征DNA片段S48-468引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2所示； 特征DNA片段S75-632/692引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 所示； 特征DNA片段S43-1000引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示； 特征DNA片段SBE1引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8 所示； 特征DNA片段S73-2438引物對，所述引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示。
2. 包括權(quán)利要求1所述引物對的五常大米主要品種檢測試劑盒。
3. -種檢測五常大米主要品種的方法，包括步驟： (1) 配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增； (2) PCR 擴(kuò)增條件為：95°C 3min;95°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin ； (3) 凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
4. 如權(quán)利要求3所述的檢測五常大米主要品種的方法，其特征是：所述PCR反應(yīng)體系 為： 所述PCR反應(yīng)體系為： 10XPCR buffer 2μ L dNTP mixture 各 2. 5mM 1. 6 μ L MgCl2 25mM 1. 2μ L Taq g| 5U/ μ L 0. 1 μ L 引物 1 lOuM 各O.lyL 引物 2 lOuM 各 0.2yL DNA 模板 50ng/yL 2μ L 滅菌超純水 11.9yL 總體積 20yL; 所述引物 1 指 SEQ ID NO :1 ?8;引物 2 指 SEQ ID NO :9 ?10 ;10XPCR buffer 含 lOOmM Tris-HCl pH8. 3、500mM KC1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104250666SQ201410482094
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】陳國培, 鄭彥婕, 黎永樂, 賴心田, 林霖, 楊國武 申請人:深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院