一種利用不脫毒纖維素水解液產(chǎn)微生物油脂的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用不脫毒纖維素水解液產(chǎn)微生物油脂的方法。本發(fā)明公開(kāi)一種生產(chǎn)微生物油脂的方法，是將可產(chǎn)生微生物油脂的菌接種至含有未脫毒纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在微生物油脂積累期之前，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液。本發(fā)明的有益效果在于：微生物可直接利用預(yù)處理后不經(jīng)脫毒的纖維素水解液生產(chǎn)油脂，省去了纖維素脫毒處理，簡(jiǎn)化了工藝，降低了生產(chǎn)成本；兩階段補(bǔ)料方式和兩階段溶氧控制顯著提高了微生物油脂含量和油脂產(chǎn)量，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種利用不脫毒纖維素水解液產(chǎn)微生物油脂的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)微生物油脂的方法；特別涉及一種利用不脫毒纖維素水解液產(chǎn)微生物油脂的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，人口的迅速增長(zhǎng)和工業(yè)的不斷發(fā)展，化石資源的消耗強(qiáng)度日益增高，日趨嚴(yán)峻的燃油供應(yīng)形勢(shì)，使得能源短缺問(wèn)題成為擺在人類面前不可避免的重要問(wèn)題之一。生物柴油是近年來(lái)基于環(huán)境惡化和能源危機(jī)發(fā)展起來(lái)的一種可替代化石燃料的可再生新能源，具有很大發(fā)展?jié)摿?，但過(guò)高的成本成為限制微生物油脂產(chǎn)業(yè)化的主要原因。
[0003]微生物油脂(microbial oil)又稱單細(xì)胞油脂(single cell oil),是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚矗诰w內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂，其較動(dòng)物油脂及植物油脂具有細(xì)胞增殖快、生產(chǎn)周期短、生長(zhǎng)所需的原料豐富、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂作為制備生物柴油的原料在未來(lái)生物柴油產(chǎn)業(yè)中將發(fā)揮重要作用。
[0004]木質(zhì)纖維素作為自然界中來(lái)源最為廣泛，價(jià)格極為低廉，且能再生的綠色資源，有望成為持續(xù)穩(wěn)定地生產(chǎn)微生物油脂的原料。但木質(zhì)纖維素在預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的許多副產(chǎn)物會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)和發(fā)酵，脫毒的預(yù)處理方法可以除去水解液中抑制物，但脫毒過(guò)程工藝復(fù)雜，且脫毒過(guò)程中有10-20%左右的糖損，因此，脫毒大大增加了微生物油脂的生產(chǎn)成本，是木質(zhì)纖維類原料大規(guī)模生產(chǎn)微生物油脂的一個(gè)重要障礙。如果能夠開(kāi)發(fā)直接利用纖維素水解液的工藝，則可以簡(jiǎn)化操作過(guò)程，減少糖損失，降低生產(chǎn)成本，提高整個(gè)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性。
[0005]目前，微生物油脂的研究主要集中在以純葡萄糖或木糖為原料，或是以脫毒后的纖維素水解液為原料生產(chǎn)微生物油脂。劉澤軍等用圓紅冬孢酵母在經(jīng)Ca(OH)2脫毒處理后的玉米秸桿水解液中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)油脂，發(fā)酵時(shí)間5d，得到的生物量為13.5g/L，油脂產(chǎn)量
4.71g/L，油脂含量為34.9%。黃等以經(jīng)稀硫酸水解并由Ca(OH)2過(guò)中和及離子交換樹(shù)脂脫毒處理后的稻桿為原料，由阿薩西絲孢酵母T.fermentans CICC1368發(fā)酵生產(chǎn)油脂,其生物量達(dá)到28g/l，油脂產(chǎn)量llg/Ι，油脂含量40%，而采用不脫毒的水解液，油脂產(chǎn)量?jī)H1.7g/I。Tsigie等將甘蔗渣用稀鹽酸進(jìn)行水解，并用Ca(OH)2過(guò)中和脫毒，由解脂耶羅威亞酵母菌Y.1ipolytica Polg發(fā)酵生產(chǎn)油脂，油脂含量和濃度分別達(dá)到58.5%和6.68g/l。由于纖維素原料經(jīng)預(yù)處理后，生成乙酸，糠醛，5-羥甲基糠醛，酚類物質(zhì)等抑制物，抑制微生物的生長(zhǎng)及油脂的合成，目前對(duì)不脫毒纖維素水解液直接利用生產(chǎn)油脂的報(bào)道還不多見(jiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種利用不脫毒纖維素水解液產(chǎn)微生物油脂的方法。
[0007]本發(fā)明提供一種生產(chǎn)微生物油脂的方法，是將可產(chǎn)生微生物油脂的菌接種至含有未脫毒纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在微生物油脂積累期之前，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度維持在20g/l-30g/l，同時(shí)補(bǔ)加氮源，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為50-100，同時(shí)控制溶氧> 30% ;在微生物油脂積累期，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，只補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度維持在20g/l-30g/l，同時(shí)控制溶氧為5% -10%，直到發(fā)酵結(jié)束；
[0008]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為20g/l_30g/l ；
[0009]所述微生物油脂積累期為所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌的穩(wěn)定期及以后的時(shí)期；
[0010]所述發(fā)酵培養(yǎng)液是指菌體發(fā)酵時(shí)的培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液含有發(fā)酵培養(yǎng)基和可產(chǎn)生微生物油脂的菌。
[0011]上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為30g/l、20g/l或25g/l ；
[0012]所述發(fā)酵培養(yǎng)基是在所述未脫毒纖維素水解液中加入終濃度為4g/L的(NH4) 2S04、6g/L 的 KH2PO4,2g/L 的 Na2HPO4'2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaCl2、0.12g/L 的 FeCl3,并調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0，即得；
[0013]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH具體為6.0、6.5或7.0 ;
[0014]所述未脫毒纖維素水解液的制備方法如下:將纖維素原料用酸進(jìn)行水解得到。
[0015]上述任一所述的方法中，所述未脫毒纖維素水解液的制備方法如下:將纖維素原料固體粉末與含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和lg/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液按照體積比1:5-1:10混合，IlO0C -130。。水解lh_5h，過(guò)濾除渣，調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0 ；
[0016]所述含有0.5g/ 100ml-3g/10ml的硫酸和lg/100ml_3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具體為0.5g/100ml，磷酸具體為1.5g/100ml ；
[0017]或，
[0018]所述含有0.5g/ 100ml-3g/10ml的硫酸和lg/100ml_3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具體為lg/100ml,磷酸具體為lg/100ml ；
[0019]或，
[0020]所述含有0.5g/ 100ml-3g/10ml的硫酸和lg/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具體為3g/100ml，磷酸具體為3g/100ml ；
[0021]所述體積比具體為1:5、1:7或1:10 ;
[0022]所述水解的條件具體為123°C水解lh、130°C水解3h或110°C水解5h ；
[0023]所述未脫毒纖維素水解液的pH具體為6.0、6.5或7.0 ;
[0024]所述未脫毒纖維素水解液中糖的濃度具體為200g/l。
[0025]上述任一所述的方法中，所述纖維素原料固體粉末為甘蔗渣固體粉末、玉米芯固體粉末或秸桿固體粉末；
[0026]所述秸桿固體粉末具體為玉米秸桿固體粉末。
[0027]上述任一所述的方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30_35°C，pH為6.0-7.0，通氣量為 0.5-2.0vvm ；
[0028]所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度具體為30°C、32°C、35°C ；
[0029]所述發(fā)酵培養(yǎng)的pH具體為6.0、6.5或7.0 ;
[0030]所述通氣量具體為0.5vvm> 1.0vvm或2.0vvm ；
[0031]所述氮源為硫酸銨或硝酸鉀；
[0032]所述微生物油脂積累期之前發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為50、70或100 ；
[0033]所述在微生物油脂積累期的溶氧控制為5%、8%或10% ；
[0034]所述發(fā)酵結(jié)束為從發(fā)酵開(kāi)始120h_226h后；
[0035]所述發(fā)酵結(jié)束具體為從發(fā)酵開(kāi)始120h、199h或226h后。
[0036]上述任一所述的方法中，所述將可產(chǎn)生微生物油脂的菌接種至含有未脫毒纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)之前，還包括種子培養(yǎng)的步驟，是將所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌接種到種子培養(yǎng)基，30-35°C，150-250rpm，培養(yǎng)20_30h，得到種子培養(yǎng)液；
[0037]所述種子培養(yǎng)的條件具體為30°C，150rpm，培養(yǎng)20h ;或，35°C，250rpm，培養(yǎng)30h ；或，32°C，200rpm,培養(yǎng) 28h。
[0038]上述任一所述的方法中，所述種子培養(yǎng)液是按照體積百分含量5% -10%的比例接入所述含有未脫毒纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的；
[0039]所述接種量具體為5%、8%或10% ；
[0040]所述種子培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為葡萄糖、(NH4)2SO4、酵母粉、KH2PO4, Na2HPO4和MgSO4 ;所述葡萄糖在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，所述(NH4)2SO4在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為2g/L，所述酵母粉在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為lg/L，所述KH2PO4在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為7g/L，所述Na2HPO4在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為2g/L,所述MgSO4在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為1.5g/L,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為6。
[0041]上述任一所述的方法中，所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌為粘紅酵母或圓紅冬孢酵母。
[0042]上述任一所述的方法中，所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌為粘紅酵母時(shí)，所述種子培養(yǎng)的條件為30°C，150rpm,培養(yǎng)20h ；
[0043]所述接種量為10% ；
[0044]所述發(fā)酵培養(yǎng)基是在所述未脫毒纖維素水解液中加入終濃度為4g/L的(NH4) 2S04、6g/L 的 KH2PO4,2g/L 的 Na2HPO4'2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaCl2、0.12g/L 的 FeCl3,并調(diào)節(jié)溶液的PH至6.0 ;
[0045]所述未脫毒纖維素水解液的制備方法如下:將纖維素原料固體粉末與含1.5g/100ml磷酸與0.5g/100ml硫酸的水溶液按照體積比1:5混合，123°C水解Ih,過(guò)濾除渣，調(diào)節(jié)pH至6.0 ;
[0046]所述纖維素原料固體粉末為玉米芯固體粉末；
[0047]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為30g/l ；
[0048]所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30°C，pH為6.0，通氣量為1.0vvm ；
[0049]所述在微生物油脂積累期之前的溶氧控制為30% ；
[0050]所述在微生物油脂積累期之前補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液的時(shí)間分別在從發(fā)酵開(kāi)始的48h，72h，共補(bǔ)料2次；
[0051]所述氮源為硫酸銨；
[0052]所述在微生物油脂積累期之前發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為50 ；
[0053]所述在微生物油脂積累期補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液的時(shí)間為從發(fā)酵開(kāi)始的96h，120h，144h，共補(bǔ)料3次；
[0054]所述在微生物油脂積累期的溶氧控制為10% ；
[0055]所述在微生物油脂積累期為從發(fā)酵開(kāi)始的96h之后；
[0056]所述未脫毒纖維素水解液中糖的濃度具體為200g/l ；
[0057]所述發(fā)酵結(jié)束為從發(fā)酵開(kāi)始199h后。
[0058]上述任一所述的方法中，所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌為粘紅酵母時(shí)，所述種子培養(yǎng)的條件為35°C，250rpm,培養(yǎng)30h ；
[0059]所述接種量為5%;
[0060]所述發(fā)酵培養(yǎng)基是在所述未脫毒纖維素水解液中加入終濃度為4g/L的(NH4) 2S04、6g/L 的 KH2PO4,2g/L 的 Na2HPO4'2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaCl2、0.12g/L 的 FeCl3,并調(diào)節(jié)溶液的PH至6.5 ;
[0061]所述未脫毒纖維素水解液的制備方法如下:將纖維素原料固體粉末與含有l(wèi)g/100ml硫酸和lg/100ml磷酸的水溶液按照體積比1:10混合，130°C水解3h,過(guò)濾除洛，調(diào)節(jié)pH至6.5 ;
[0062]所述纖維素原料固體粉末為甘蔗渣固體粉末；
[0063]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為20g/l ；
[0064]所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為35°C，pH為6.5，通氣量為2.0vvm ；
[0065]所述在微生物油脂積累期之前的溶氧控制為40% ；
[0066]所述在微生物油脂積累期之前補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液的時(shí)間分別在從發(fā)酵開(kāi)始的24h，48h，共補(bǔ)料2次；
[0067]所述氮源為硝酸鉀；
[0068]所述在微生物油脂積累期之前發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為100 ；
[0069]所述在微生物油脂積累期補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液的時(shí)間為從發(fā)酵開(kāi)始的72h，96h，共補(bǔ)料2次；
[0070]所述在微生物油脂積累期的溶氧控制為5% ；
[0071]所述在微生物油脂積累期為從發(fā)酵開(kāi)始的72h之后；
[0072]所述未脫毒纖維素水解液中糖的濃度具體為200g/l。
[0073]所述發(fā)酵結(jié)束為從發(fā)酵開(kāi)始120h后。
[0074]上述任一所述的方法中，所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌為圓紅冬孢酵母時(shí)，所述種子培養(yǎng)的條件為32°C，200rpm,培養(yǎng)28h ；
[0075]所述接種量為8%;
[0076]所述發(fā)酵培養(yǎng)基是在所述未脫毒纖維素水解液中加入終濃度為4g/L的(NH4) 2S04、6g/L 的 KH2PO4,2g/L 的 Na2HPO4'2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaCl2、0.12g/L 的 FeCl3,并調(diào)節(jié)溶液的PH至7.0 ;
[0077]所述未脫毒纖維素水解液的制備方法如下:將纖維素原料固體粉末與含有3g/100ml硫酸和3g/100ml磷酸的水溶液按照體積比1:7混合，110°C水解5h,過(guò)濾除洛,調(diào)節(jié)pH至7.0 ;
[0078]所述纖維素原料固體粉末為秸桿固體粉末，具體為玉米秸桿固體粉末；
[0079]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為25g/l ；
[0080]所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為32°C，pH為7.0，通氣量為0.5vvm ；
[0081]所述在微生物油脂積累期之前的溶氧控制為30% ；
[0082]所述在微生物油脂積累期之前補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液的時(shí)間分別在從發(fā)酵開(kāi)始的36h, 60h, 80h共補(bǔ)料3次；
[0083]所述氮源為硝酸鉀；
[0084]所述在微生物油脂積累期之前發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為70 ；
[0085]所述在微生物油脂積累期補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液的時(shí)間為從發(fā)酵開(kāi)始的100h，130h, 160h, 190h 共補(bǔ)料 4 次；
[0086]所述在微生物油脂積累期的溶氧控制為8% ；
[0087]所述在微生物油脂積累期為從發(fā)酵開(kāi)始的10h之后；
[0088]所述未脫毒纖維素水解液中糖的濃度具體為200g/l ；
[0089]所述發(fā)酵結(jié)束為從發(fā)酵開(kāi)始226h后。
[0090]一種未脫毒纖維素水解液也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，其制備方法如下:將纖維素原料固體粉末與含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和lg/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液按照體積比1:5-1:10混合，110°C -130。。水解l_5h，過(guò)濾除渣，調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0 ；
[0091]所述含有0.5g/ 100ml-3g/10ml的硫酸和lg/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具體為0.5g/100ml，磷酸具體為1.5g/100ml ；
[0092]或，
[0093]所述含有0.5g/ 100ml-3g/10ml的硫酸和lg/100ml_3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具體為lg/100ml,磷酸具體為lg/100ml ；
[0094]或，
[0095]所述含有0.5g/ 100ml-3g/ 100ml的硫酸和lg/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具體為3g/100ml，磷酸具體為3g/100ml ；
[0096]所述體積比具體為1: 5、1:7或1:10 ;
[0097]所述水解的條件具體為123°C水解lh、130°C水解3h或110°C水解5h ；
[0098]所述未脫毒纖維素水解液的pH具體為6.0、6.5或7.0 ;
[0099]所述纖維素原料固體粉末具體為甘蔗渣固體粉末、玉米芯固體粉末或秸桿固體粉末；
[0100]所述秸桿固體粉末具體為玉米秸桿固體粉末。
[0101]上述未脫毒纖維素水解液在制備微生物油脂中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0102]本發(fā)明提供的產(chǎn)微生物油脂的方法是以不脫毒纖維素水解液為原料，通過(guò)兩階段補(bǔ)料方式進(jìn)行高密度培養(yǎng)，同時(shí)采用兩階段溶氧控制，顯著提高了生物量，同時(shí)可獲得較高的微生物油脂產(chǎn)量。
[0103]本發(fā)明的有益效果在于:微生物可直接利用預(yù)處理后不經(jīng)脫毒的纖維素水解液生產(chǎn)油脂，省去了纖維素脫毒處理，簡(jiǎn)化了工藝，降低了生產(chǎn)成本；兩階段補(bǔ)料方式和兩階段溶氧控制顯著提高了微生物油脂含量和油脂產(chǎn)量，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0104]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0105]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0106]下述實(shí)施例中未脫毒纖維素水解液的濃度表示未脫毒纖維素水解液中的糖占未脫毒纖維素水解液的比例，比如200g/l未脫毒纖維素水解液表示每升未脫毒纖維素水解液中含有糖200g。
[0107]下述實(shí)施例中的菌體生物量(即細(xì)胞干重)是指菌體的質(zhì)量與發(fā)酵培養(yǎng)液的比例，油脂產(chǎn)量是指油脂的質(zhì)量與發(fā)酵培養(yǎng)液的比例，油脂含量是指油脂的質(zhì)量占菌體的質(zhì)量百分含量。發(fā)酵培養(yǎng)液是指菌體發(fā)酵時(shí)的培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液含有發(fā)酵培養(yǎng)基和菌體。
[0108]粘紅酵母(Rhodotorula Glutinis)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC2.704。
[0109]圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC2.107。
[0110]玉米芯購(gòu)自高唐宏達(dá)玉米芯顆粒有限公司。
[0111]甘蔗渣、玉米秸桿購(gòu)自北京本地市場(chǎng)。
[0112]下述實(shí)施例中的微生物油脂積累期為所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌的穩(wěn)定期及以后的時(shí)期。
[0113]實(shí)施例1、粘紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)油脂方式I
[0114]一、菌種:粘紅酵母(Rhodotorula Glutinis)
[0115]二、培養(yǎng)基的制備
[0116](I)種子培養(yǎng)基:由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為葡萄糖、(NH4)2SO4、酵母粉、KH2PO4, Na2HPO4和MgSO4 ;所述葡萄糖在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，所述(NH4)2SO4在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為2g/L，所述酵母粉在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為lg/L，所述KH2PO4在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為7g/L,所述Na2HPO4在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為2g/L，所述MgSO4在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為1.5g/L,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為6，115°C滅菌15min備用。
[0117](2)未脫毒纖維素水解液的制備:將玉米芯固體粉末和含1.5g/100ml磷酸與
0.5g/100ml硫酸的水溶液按照體積比1:5混合，并在123°C水解I小時(shí)，用真空泵抽濾除濾渣，得到未脫毒纖維素水解液，調(diào)節(jié)溶液的PH至6.0，115°C滅菌15min備用。
[0118](3)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:在滅菌前的未脫毒纖維素水解液中加入終濃度為4g/L的(NH4) 2S04、6g/L 的 KH2PO4,2g/L 的 Na2HPO4'2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaCl2、0.12g/L 的 FeCl3,并調(diào)節(jié)溶液的pH至6.0，115°C滅菌15min備用。
[0119]三、發(fā)酵
[0120](I)在500ml搖瓶中裝種子培養(yǎng)基50ml，將粘紅酵母接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行有氧培養(yǎng)，溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)20h，得到種子液。
[0121](2)將種子液以體積百分含量10%的接種量接入5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基3L (發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為30g/l)。pH6.0，通氣量1.0vvm，溶氧控制30%，30°C培養(yǎng)，攪拌；當(dāng)總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加200g/l未脫毒纖維素水解液進(jìn)行補(bǔ)料(分別在48h，72h共補(bǔ)料2次)，維持發(fā)酵培養(yǎng)液的總糖濃度為20-30g/l，同時(shí)補(bǔ)加硫酸銨，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為50 ;在微生物油脂積累期，當(dāng)總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，只補(bǔ)加200g/l未脫毒纖維素水解液(96h，120h, 144h共補(bǔ)料3次)，維持發(fā)酵培養(yǎng)液的總糖濃度為20-30g/l。在微生物油脂積累期前(具體為發(fā)酵開(kāi)始的96h前)溶氧控制在30%，到達(dá)微生物油脂積累期之后(具體為發(fā)酵開(kāi)始的96h后)溶氧控制在10%。
[0122]四、發(fā)酵結(jié)果
[0123]發(fā)酵結(jié)束(從發(fā)酵開(kāi)始199h)后，菌體生物量(即細(xì)胞干重)達(dá)到77.8g/l，利用氣相色譜測(cè)得的油脂產(chǎn)量為36.4g/l，計(jì)算得到的油脂含量為47%。
[0124]實(shí)施例2、粘紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)油脂方式2
[0125]一、菌種:粘紅酵母(Rhodotorula Glutinis)
[0126]二、培養(yǎng)基的制備
[0127](I)種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1的步驟二中種子培養(yǎng)基的制備。
[0128](2)未脫毒纖維素水解液的制備:用粉碎機(jī)對(duì)甘蔗渣進(jìn)行粉碎，得到甘蔗渣固體粉末，將甘蔗渣固體粉末和含lg/100ml硫酸和lg/100ml磷酸的水溶液按照體積比1:10混合，并在130°C水解3小時(shí)，用真空泵抽濾除濾渣，得到未脫毒纖維素水解液，調(diào)節(jié)溶液的pH至6.5,115°C滅菌15min備用。
[0129](3)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:在滅菌前的未脫毒纖維素水解液中加入終濃度為4g/L的(NH4) 2S04、6g/L 的 KH2PO4,2g/L 的 Na2HPO4'2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaCl2、0.12g/L 的 FeCl3,并調(diào)節(jié)溶液的pH至6.5，115°C滅菌15min備用。
[0130]三、發(fā)酵
[0131](I)在500ml搖瓶中裝種子培養(yǎng)基50ml，將粘紅酵母接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行有氧培養(yǎng)，溫度35°C，搖床轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)30h，得到種子液。
[0132](2)將種子液以體積百分含量5%的接種量接入5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基3L (發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為20g/l)。pH6.5，通氣量2.0vvm，溶氧控制40%，35°C培養(yǎng)，攪拌。當(dāng)總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加200g/l未脫毒纖維素水解液進(jìn)行補(bǔ)料(分別在24h、48h共補(bǔ)料2次)，維持發(fā)酵培養(yǎng)液的總糖濃度為20-30g/l，同時(shí)補(bǔ)加硝酸鉀，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為100 ;在微生物油脂積累期，當(dāng)總糖濃度降至1g/I以下時(shí)，只補(bǔ)加200g/l未脫毒纖維素水解液(72h，96h共補(bǔ)料2次)，維持發(fā)酵培養(yǎng)液的總糖濃度為20-30g/l。在微生物油脂積累期前(具體為發(fā)酵開(kāi)始的72h前)溶氧控制在40%，到達(dá)微生物油脂積累期之后(具體為發(fā)酵開(kāi)始的72h后)溶氧控制在5%。
[0133]四、發(fā)酵結(jié)果
[0134]發(fā)酵結(jié)束(從發(fā)酵開(kāi)始120h)后，菌體生物量(即細(xì)胞干重)達(dá)到45.1g/l，利用氣相色譜測(cè)得的油脂產(chǎn)量為27.lg/Ι，計(jì)算得到的油脂含量為60%。
[0135]實(shí)施例3、圓紅冬孢酵母發(fā)酵生產(chǎn)油脂
[0136]一、菌種:圓紅冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides)
[0137]二、培養(yǎng)基的制備
[0138](I)種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1的步驟二中種子培養(yǎng)基的制備。
[0139](2)未脫毒纖維素水解液的制備:用粉碎機(jī)對(duì)玉米秸桿進(jìn)行粉碎，得到秸桿固體粉末，將秸桿固體粉末和含3g/100ml硫酸和3g/100ml磷酸的水溶液按照體積比1:7在110°C水解5小時(shí)，用真空泵抽濾除濾渣，調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0,115°C滅菌15min備用。
[0140](3)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:在滅菌前的未脫毒纖維素水解液中加入4g/L的(NH4) 2S04、6g/L 的 KH2PO4,2g/L 的 Na2HPO4'2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaCl2、0.12g/L 的 FeCl3,并調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，115°C滅菌15min備用。
[0141]三、發(fā)酵
[0142](I)在500ml搖瓶中裝種子培養(yǎng)基50ml，將圓紅冬孢酵母接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行有氧培養(yǎng)，溫度32°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)28h，得到種子液。
[0143](2)將種子液以體積百分含量8%的接種量接入5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基3L (發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為25g/l)。pH7.0，通氣量0.5vvm，溶氧控制30%，32°C培養(yǎng)，攪拌。當(dāng)總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加200g/l未脫毒纖維素水解液進(jìn)行補(bǔ)料(36h，60h，80h共補(bǔ)料3次)，維持發(fā)酵培養(yǎng)液的總糖濃度為20-30g/l，同時(shí)補(bǔ)加硝酸鉀，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為70 ;在微生物油脂積累期，當(dāng)總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，只補(bǔ)加200g/l未脫毒纖維素水解液(100h，130h, 160h, 190h共補(bǔ)料4次)，維持發(fā)酵培養(yǎng)液的總糖濃度為20-30g/l。在微生物油脂積累期前(具體為發(fā)酵開(kāi)始的10h前)溶氧控制在30%，到達(dá)微生物油脂積累期之后(具體為發(fā)酵開(kāi)始的10h后)溶氧控制在8%。
[0144]四、發(fā)酵結(jié)果
[0145]發(fā)酵結(jié)束(從發(fā)酵開(kāi)始226h)，菌體生物量(即細(xì)胞干重)達(dá)到80.1g/l，利用氣相色譜測(cè)得的油脂產(chǎn)量為40.5g/l，計(jì)算得到的油脂含量為50%。
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)微生物油脂的方法，是將可產(chǎn)生微生物油脂的菌接種至含有未脫毒纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在微生物油脂積累期之前，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度降至10g/1以下時(shí)，補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度維持在20g/l-30g/l，同時(shí)補(bǔ)加氮源，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為50-100，同時(shí)控制溶氧彡30 %;在微生物油脂積累期，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度降至10g/l以下時(shí)，只補(bǔ)加未脫毒纖維素水解液，使得發(fā)酵培養(yǎng)液中的總糖濃度維持在20g/l-30g/l，同時(shí)控制溶氧為5% -10%，直到發(fā)酵結(jié)束； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為20g/l-30g/l。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖濃度為30g/l、20g/l 或25g/l ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基是在所述未脫毒纖維素水解液中加入終濃度為4g/L的(NH4)2SO4Ag/L 的 KH2PO4,2g/L 的 Na2HPO4,2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaCl2、0.12g/L 的 FeCl3,并調(diào)節(jié) pH 至6.0-7.0，即得； 所述未脫毒纖維素水解液的制備方法如下:將纖維素原料用酸進(jìn)行水解得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述未脫毒纖維素水解液的制備方法如下:將纖維素原料固體粉末與含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和lg/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液按照體積比1:5-1:10混合，110°C _130°C水解lh_5h，過(guò)濾除渣，調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述纖維素原料固體粉末為甘蔗渣固體粉末、玉米芯固體粉末或秸桿固體粉末。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-35°C，pH 為 6.0-7.0，通氣量為 0.5-2.0vvm ； 所述氮源為硫酸銨或硝酸鉀； 所述微生物油脂積累期之前發(fā)酵培養(yǎng)液中的C/N為50、70或100 ； 所述在微生物油脂積累期的溶氧控制為5%、8%或10% ； 所述發(fā)酵結(jié)束為從發(fā)酵開(kāi)始120h-226h后。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述將可產(chǎn)生微生物油脂的菌接種至含有未脫毒纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)之前，還包括種子培養(yǎng)的步驟，是將所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌接種到種子培養(yǎng)基，30-35 V，150-250rpm,培養(yǎng)20-30h，得到種子培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)液是按照體積百分含量5% -10%的比例接入所述含有未脫毒纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于:所述可產(chǎn)生微生物油脂的菌為粘紅酵母或圓紅冬孢酵母。
9.一種未脫毒纖維素水解液，其制備方法如下:將纖維素原料固體粉末與含有0.5g/ 100ml-3g/10ml的硫酸和lg/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液按照體積比1:5-1:10混合，110°C -130。。水解l_5h，過(guò)濾除渣，調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0。
10.權(quán)利要求9所述的未脫毒纖維素水解液在制備微生物油脂中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104263771SQ201410471758
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】劉宏娟, 張建安, 劉雅婷, 王艷萍, 周玉杰, 程可可 申請(qǐng)人:清華大學(xué)