一種水稻稻瘟病抗性基因RMg37及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因RMg37及其應(yīng)用。本發(fā)明公開了水稻稻瘟病新抗性基因RMg37的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列。此基因?yàn)镹BS-LRR類型抗病基因家族的成員。本發(fā)明中的抗稻瘟病基因克隆自對稻瘟病菌表現(xiàn)出高抗的水稻品系，并將其轉(zhuǎn)化至對稻瘟病菌感病的品種中，利用稻瘟病菌侵染的方法對其抗病能力進(jìn)行評估，從而最終確定該基因?qū)λ镜疚敛【哂锌剐浴?br> 【專利說明】-種水稻稻瘟病抗性基因 RMg37及其應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因 RMg37及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0003] 稻癌病是由水稻病菌（Magnaporthe oryzae)引起的真菌水稻病害。稻癌病、白葉 枯病以及紋枯病是世界范圍內(nèi)水稻的三大病害，其中稻瘟病是危害最嚴(yán)重的一種。作為世 界性的病害，稻瘟病每年在全球范圍內(nèi)造成水稻產(chǎn)量損失達(dá)10%_30%。而在中國，自從20世 紀(jì)90年代以來，稻瘟病的年發(fā)生面積均在380萬公頃（hm2)以上。并且在南北稻區(qū)，稻瘟 病的危害最為嚴(yán)重，每年均有不同程度的稻瘟病害發(fā)生，重病區(qū)嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)芯植刻飬^(qū) 顆粒無收。因此，對稻瘟病防治抵御一直都是研究的熱點(diǎn)。但是，常規(guī)的化學(xué)農(nóng)藥已不能解 決植物病害日趨嚴(yán)重的耐藥性，并且農(nóng)藥帶來的污染問題也亟需解決。而實(shí)踐證明，利用水 稻自身所攜帶的抗病基因培育抗病品種，是最為有效環(huán)保的防治和控制稻瘟病害的方法。
[0004] 植物在長期抵御外界病蟲害的過程中演化出了"雙保險(xiǎn)"防御體系（Young et al. 2006)。第一層防御體系是通過細(xì)胞表面的受體識(shí)別一些保守的微生物來源的分子出發(fā)的 古老的、普遍的免疫反應(yīng)。而在第二層防御體系，植物通過具有特異性識(shí)別病原菌效應(yīng)分 子的抗病基因，來抵抗突破第一道防線的病原菌。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的不同，抗病基因主要包 括5種類型：NBS-LRR、RLK、RLP、STK及其他類型。含有抗病基因的抗性品種往往產(chǎn)量低、 品質(zhì)差，而高產(chǎn)或質(zhì)優(yōu)品種又無抗性，為了選育集高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)和多抗為一體的改良品種，人 們從很早就開始意識(shí)到抗病基因的重要性，傳統(tǒng)的方法培育抗病品種的方法，通常是將攜 帶有抗病基因的抗病品種與感病的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種雜交，然后不停的回交，達(dá)到將抗病基 因"引入"優(yōu)質(zhì)品種，得到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗病品種的目的。盡管這種方法十分有效，但是這種方 法費(fèi)事費(fèi)力，并且通過此種方法選育出來抗病品種只有往往由于周期較長，病菌進(jìn)化產(chǎn)生 新的株系而造成抗性的喪失。1986年由劍橋大學(xué)的Alan Coulson提出由劍橋大學(xué)的Alan Coulson提出圖位克隆方法大大解決了這個(gè)問題，圖位克隆是將目標(biāo)基因定位到染色體的 精確位置，并利用與之緊密連鎖的分子標(biāo)記以及染色體移步篩選到含有該目標(biāo)基因的亞克 隆，然后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。這種方法取得了很好的效果，在植物抗病 基因的克隆中起到了非常重要的作用，但因其周期長、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、分離和等位性檢測較難等 原因，不適合大量克隆抗病基因的需要。同時(shí)，因抗病基因獨(dú)特的遺傳方式，也使該方法的 應(yīng)用受到了很大的限制。以水稻抗稻瘟病基因?yàn)槔擃惢蛟诨蚪M中通常成簇（gene cluster)分布，在不同品種的同源染色體間的位置和結(jié)構(gòu)也多呈不對稱分布，等位關(guān)系不 明確，拷貝數(shù)變異大（Yang et al. 2007; Ding et al. 2007a; Sun et al. 2008; Li et al. 2010)。這些遺傳現(xiàn)象，大大增加了圖位克隆的難度，嚴(yán)重影響了抗病基因的克隆效率。 并且對于應(yīng)對像稻瘟病這種快速進(jìn)化的病菌依然存在著育種周期過長的問題。截止到目前 為止，僅有23個(gè)抗稻瘟病基因被克隆出來。
[0005] 而我們通過對植物抗病基因起源、進(jìn)化及結(jié)構(gòu)功能的研究，發(fā)現(xiàn)抗病基因主要為 一類含有LRR的基因，其中NBS-LRR類型是最大的抗病基因家族。而本發(fā)明就是根據(jù)抗病 基因的這一特征，利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)手段，根據(jù)抗病基因的遺傳進(jìn)化特征，篩選 潛在的抗病基因，快速、高效、大量的克隆候選基因，最終在水稻中得到具有水稻稻瘟病抗 性的基因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是，分離克隆水稻高抗品種中攜帶的稻瘟病抗性基因 RMg37及包含 調(diào)控這基因的啟動(dòng)子的DNA片段。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述稻瘟病抗性基因 RMg37所編碼的蛋白質(zhì)序列。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述抗性基因的載體。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)在制備抗稻瘟病菌藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明涉及克隆和鑒定一種包含RMg37基因的DNA片段，這些基因編碼的蛋白能 使水稻對稻瘟病菌所引起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應(yīng)。其中，所述片段分別如序列表SEQ ID NO: 1所示或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO: 1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO: 1所示序列的亞片段。這些DNA序列都編碼一種NBS-LRR類蛋白，其氨基酸序列分別如 SEQ ID NO: 2所示。所分離、克隆的RMg37抗性基因編碼NBS-LRR蛋白。他們的蛋白都包含 兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：NBS和LRR區(qū)域，RMg37蛋白的C-末端為5個(gè)LRR重復(fù)。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明提供的RMg37基因序列信息（SEQ ID NO: 1)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過 以下方法獲得與RMg37等同的基因：（1)通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得；（2)以RMg37基因片段為探 針篩選水稻或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；（3)根據(jù)RMg37基因序列信息設(shè)計(jì) 寡核苷酸引物，用PCR擴(kuò)增的方法從水稻或其它植物的基因組、mRNA和cDNA中獲?。唬?) 在RMg37基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；（5)用化學(xué)合成的方法獲得該基因。
[0013] 本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因 RMg37具有重要的應(yīng)用價(jià)值。將所述的RMg37基因 序列用任何一種轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入水稻或其他植物細(xì)胞，可獲得表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因抗病品 種，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對所述基因或其調(diào)控 序列適當(dāng)修飾，也可以用其它啟動(dòng)子取代所述基因原有的啟動(dòng)子，從而拓寬抗譜或增強(qiáng)抗 性。
[0014] 本發(fā)明具有如下有益效果：將克隆的抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)入感病的植物中，有助于獲 得新的抗病植物?？寺〉目共』蚰茉诓煌奈锓N間轉(zhuǎn)移并利用，從而能夠克服傳統(tǒng)抗病 育種中遠(yuǎn)緣雜交的困難。此外，可以用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中累加多個(gè)抗病基因，縮短育種周 期。本發(fā)明還能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用上述DNA片段獲得的抗病轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子， 以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種子?？梢杂?有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他植株。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明流程示意圖。圖IA :抗稻瘟病候選位點(diǎn)的確定；圖IB-E :抗稻瘟病 基因的分離與克??；圖IF-G :抗稻瘟病基因的遺傳轉(zhuǎn)化；圖IH :轉(zhuǎn)化體的鑒定。
[0017] 圖2為稻瘟病抗性基因 RMg37的轉(zhuǎn)化體的潮霉素抗性基因和CaMV 35S啟動(dòng)子的 PCR檢測電泳圖；圖IA為CaMV 35S啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道1-6為轉(zhuǎn)化體的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道8為受體新2號的非轉(zhuǎn) 化體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖IB為潮霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，泳道1-6為轉(zhuǎn)化體的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道8為受體新2號的非轉(zhuǎn) 化體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018] 圖3為轉(zhuǎn)化有RMg37基因植株抗性鑒定圖。圖3A :對照植株新2號的抗性鑒定圖； 圖3B :稻瘟病抗性基因 RMg37的轉(zhuǎn)化植株的抗性鑒定圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 水稻抗稻癌病候選基因的確定：以水稻全基因組測序品種93-11和日本晴為基 礎(chǔ)，首先鑒定基因組中所有的NBS-LRR類型的抗病基因，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在此基礎(chǔ)上， 我們選取了 20個(gè)候選的抗稻瘟病基因位點(diǎn)，通過引物設(shè)計(jì)、在抗稻瘟病的水稻品種中進(jìn)行 長片段PCR、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因、抗性鑒定等過程，最后通過10個(gè)來源于中國大陸分布所有 水稻主產(chǎn)區(qū)的稻瘟病菌系統(tǒng)鑒定，鑒定出1個(gè)具有特異性抗性的抗稻瘟病基因。
[0020] 下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0021] 實(shí)施例1稻瘟病抗性基因 RMg37的克隆、載體構(gòu)建、抗病植株鑒定 本實(shí)施例的試驗(yàn)流程如圖1所示。
[0022] 1、抗稻瘟病候選位點(diǎn)RMg37的確定：（1)以單基因形式存在，在日本晴和93-11中 各有1個(gè)相近的拷貝；（2)在其LRR區(qū)域，特別是xxLxLxx區(qū)域具有較高的Ka/Ks值； 2、稻瘟病抗性基因 RMg37的分離與克?。豪霉矓?shù)據(jù)庫測序品種日本晴 (Nipponbare)和93-11為參考序列，設(shè)計(jì)引物（引物兩端皆帶有酶切位點(diǎn)BamHI)。引物序 列參見序列表，正向引物序列如SEQ ID NO:4所示；反向引物序列如SEQ ID NO:5所示。
[0023] 以抗病水稻品種Tadukan，Tet印，MH63為模板，利用長片段PCR技術(shù)（Long-PCR) 擴(kuò)增候選基因片段。PCR程序如下：95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C復(fù)性45秒， 68 °C延伸6分鐘，共35個(gè)循環(huán)，隨后72 °C保溫10分鐘，最后KTC恒溫。隨后對PCR產(chǎn)物進(jìn) 行割膠回收。
[0024] 3、候選抗性基因與基礎(chǔ)載體的連接：用限制性內(nèi)切酶BamHI，同時(shí)酶切PCR產(chǎn) 物與基礎(chǔ)載體質(zhì)粒，并純化。在T4連接酶的作用下，將候選基因片段連入基礎(chǔ)載體 PCAMBIA1300。
[0025] 4、候選抗性基因的遺傳轉(zhuǎn)化：將攜有候選基因的雙功能載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將候選基因轉(zhuǎn)化到水稻普感品種新2號，TP309和C〇39中。最 后一共獲得20株獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。
[0026] 5、PCR分子檢測：以轉(zhuǎn)化體DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟 動(dòng)子的特異性引物對其進(jìn)行PCR反應(yīng)。潮霉素抗性基因的引物序列參加序列表，正向引物 序列如SEQ ID N0:6;反向引物序列如SEQ ID NOJtjCaMVSSS啟動(dòng)子的引物序列參加序列 表，正向引物序列如SEQ ID NO:8;反向引物序列如SEQ ID NO:9。
[0027] 6、轉(zhuǎn)化體的抗性鑒定：選擇10個(gè)來源地不同，區(qū)別力好的獨(dú)立稻瘟病菌生理小種 作為檢測的病原菌種。利用稻瘟病菌小種接種感染T2代轉(zhuǎn)基因植株和對照品種，篩選抗病 性改變的轉(zhuǎn)化體?？剐澡b定結(jié)果顯示候選基因 RMg37在普感品種新2號的遺傳背景下，對 2個(gè)病原菌株都顯示不同程度的抗性，表明候選基因 RMg37具有特異性抗性且被成功克隆 (圖2和圖3)。
[0028] 7、稻瘟病抗性基因 RMg37的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析：采用步移法對RMg37的 DNA序列進(jìn)行了測序。RMg37基因 DNA長度為3394bp，含有1個(gè)開放讀碼框，1個(gè)外顯子，無 內(nèi)含子。RMg37碼的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。RMg37基因編碼1個(gè)由933個(gè)氨基酸 殘基組成的蛋白多肽。RMg37蛋白屬于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端為5個(gè)LRR重復(fù)。
【權(quán)利要求】
1. 一種水稻抗稻瘟病基因 RMg37,其核苷酸序列為如SEQ ID N0:1所示的DNA序列，或 者其核苷酸序列是與SEQ ID NO: 1所示的DNA序列在相似度上>95%相似的DNA序列，或 其核苷酸序列的功能相當(dāng)于SEQ ID NO: 1所示DNA序列的亞片段，或者如SEQ ID NO: 1所 示的DNA序列經(jīng)過替換、缺失或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序 列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基因序列編碼的蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或SEQ ID NO:2 所示的序列經(jīng)過替換、缺失、或添加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。
4. 一種調(diào)控如權(quán)利要求1所述水稻抗稻瘟病基因 RMg37的啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻抗稻瘟病基因 RMg37,其特征為含有調(diào)控水稻抗稻 瘟病基因 RMg37的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
6. 含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)化載體。
7. 含有權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)化載體的宿主細(xì)胞根癌農(nóng)桿菌EHA105。
8. 含有權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因植物。
9. 權(quán)利要求1所述的基因在抗稻瘟病水稻育種中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求2所述蛋白在制備抗稻瘟病菌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/113GK104293801SQ201410461812
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】田大成, 司偉娜, 張小輝, 楊四海 申請人:南京大學(xué)