基于人骨髓瘤細(xì)胞株及人b淋巴細(xì)胞融合制備的全人抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了基于人骨髓瘤細(xì)胞株及人B淋巴細(xì)胞融合制備的全人抗體。臨床分離人骨髓瘤細(xì)胞株，篩查獲得不分泌抗體且增殖迅速的細(xì)胞株；進(jìn)而應(yīng)用8-氮鳥嘌呤和6-巰基鳥嘌呤誘導(dǎo)細(xì)胞株獲得對次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT)敏感性；進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞株對哇巴因以及聚乙二醇耐受。分離人外周血單個核細(xì)胞，抗原特異性活化B淋巴細(xì)胞，分化為漿細(xì)胞。應(yīng)用人骨髓瘤細(xì)胞株與漿細(xì)胞融合制備骨髓瘤細(xì)胞株生產(chǎn)全人抗體，具有重大的臨床應(yīng)用價值。
【專利說明】基于人骨髓瘤細(xì)胞株及人B淋巴細(xì)胞融合制備的全人抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，基于人骨髓瘤細(xì)胞株及人漿細(xì)胞融合制備全人抗 體。

【背景技術(shù)】
[0002] 治療性單克隆抗體具有廣泛的市場前景。目前的治療性單克隆抗體主要包括人鼠 嵌合抗體、人源化抗體以及全人抗體。人鼠嵌合抗體，應(yīng)用人免疫球蛋白的Fc端結(jié)合到小 鼠免疫球蛋白的Fab端，保留了抗體識別抗原表位的能力，同時降低了鼠源性Fc端的免疫 原性。在人源化抗體中，應(yīng)用鼠源性抗體Fab端的CDR替換人免疫球蛋白的CDR，進(jìn)一步降 低了治療性抗體的免疫原性。不同于人鼠嵌合抗體或者人源化抗體，全人抗體中所有的氨 基酸序列都來自人，從而可以更好的降低治療性抗體的免疫原性。目前全人化抗體的制備 主要依賴噬菌體肽庫展示技術(shù)，其不足之處在于缺少體內(nèi)的抗體親和力成熟過程，導(dǎo)致不 易獲得高親和力抗體。同時，噬菌體肽庫展示技術(shù)制備的全人抗體依賴于分子克隆和細(xì)胞 轉(zhuǎn)染技術(shù)，抗體產(chǎn)量有限，制備成本高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于開發(fā)高效低成本的全人抗體制備技術(shù)。參考鼠源單克隆抗體制 備，全人單克隆抗體制備的關(guān)鍵在于：（一）人骨髓瘤細(xì)胞的篩查與誘導(dǎo)；（二）分泌抗體的 漿細(xì)胞的抗原特異性活化與富集。
[0004] 2001年，英國劍橋大學(xué)A.卡帕斯博士參考小鼠骨髓瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)方案，從人骨髓 瘤細(xì)胞中成功制備Karpas 707。Karpas 707可以與EBV病毒轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞融合形成雜 交瘤細(xì)胞株，分泌全人抗體。Karpas 707誘導(dǎo)方案于2009年在中國獲得專利授權(quán)保護(hù)。
[0005] 不同于A.卡帕斯博士的方案，本發(fā)明（1)臨床分離人骨髓瘤細(xì)胞建立細(xì)胞系；（2) 應(yīng)用誘變劑N-甲基-Ν'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG)處理人骨髓瘤細(xì)胞系；（3)應(yīng)用8-氮 鳥嘌呤和6-巰基鳥嘌呤誘導(dǎo)細(xì)胞株獲得對次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷（HAT)敏感性；(4) 進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞株對哇巴因耐受；(5)誘導(dǎo)細(xì)胞株對聚乙二醇耐受。本發(fā)明中的誘導(dǎo)方案 能更有效的制備符合要求的人骨髓瘤細(xì)胞。
[0006] 抗原特異性漿細(xì)胞是產(chǎn)生特異性抗體的來源細(xì)胞。A.卡帕斯博士應(yīng)用EBV病毒非 特異性轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞。本發(fā)明（1)培養(yǎng)成熟樹突狀細(xì)胞；（2)負(fù)載特異性抗原；（3)特異 性活化T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞；（4) B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞；（5)富集漿細(xì)胞。本發(fā)明可 以更高效的獲得抗原特異性漿細(xì)胞，從而與人骨髓瘤細(xì)胞融合制備分泌單克隆抗體的雜交 瘤細(xì)胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 圖1MNNG誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞系突變
[0008] 圖2骨髓瘤細(xì)胞系對HAT敏感：在培養(yǎng)第5天，>90%骨髓瘤細(xì)胞死亡。
[0009] 圖3人骨髓瘤細(xì)胞WYZ-26的染色體型
[0010] 圖4Ficoll分離外周血單個核細(xì)胞PBMC [0011] 圖5.流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞純度
[0012] 圖6.單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞，細(xì)胞邊緣可見典型突起。
[0013] 圖 7. Western-blot 檢測漿細(xì)胞分泌 HBsAb
[0014] 其中1. HBsAg疫苗接種者血漿，2. B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清，3.漿細(xì)胞培養(yǎng)上清，4.骨 髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清
[0015] 圖8WYZ-26與人漿細(xì)胞融合可以制備骨髓瘤細(xì)胞，分泌全人抗體：雜交瘤瘤細(xì)胞 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)上清，純化IgG，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，可見重鏈和輕鏈兩條 帶

【具體實(shí)施方式】
[0016] 一 ·人骨髓瘤細(xì)胞分離、誘導(dǎo)和篩查
[0017] (一）臨床分離人骨髓瘤細(xì)胞建立細(xì)胞系；
[0018] 多發(fā)性骨髓瘤，其腫瘤細(xì)胞起源于骨髓中的漿細(xì)胞，屬于B淋巴細(xì)胞瘤。其臨床特 征是骨髓漿細(xì)胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈（M蛋白）過度生成，極少數(shù)患者 是不產(chǎn)生Μ蛋白的未分泌型。臨床采集未分泌型多發(fā)性骨髓瘤患者外周血標(biāo)本，應(yīng)用完全 培養(yǎng)基（1640+10% FCS)培養(yǎng)，每周換液一次，經(jīng)半年傳代，可見細(xì)胞集落形成，細(xì)胞增殖迅 速，有限稀釋法獲得單個細(xì)胞克隆，保存在_8〇°C。
[0019] (二）應(yīng)用誘變劑N-甲基-Ν'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG)處理人骨髓瘤細(xì)胞 系；
[0020] 收集對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞系，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在完全培養(yǎng)基中細(xì) 胞生長到匯合度在70 %時，加入MNNG (終濃度分別為0. 5ug/ml、lug/ml、2ug/ml、4ug/ml); 24h后臺盼藍(lán)染色計數(shù)細(xì)胞存活率，選取存活率約50%的濃度作為MNNG最終濃度（圖1)。 然后換用不含MNNG的完全培養(yǎng)基傳代三次，使突變穩(wěn)定。
[0021] (三）應(yīng)用8-氮鳥嘌呤和6-巰基鳥嘌呤誘導(dǎo)細(xì)胞株；
[0022] 在T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)經(jīng)MNNG誘導(dǎo)突變的骨髓瘤細(xì)胞株，應(yīng)用8-氮鳥嘌 呤誘導(dǎo)，初始濃度設(shè)置為lug/ml，逐漸增加到3ug/ml，漸進(jìn)至10ug/ml，最終至30ug/ ml，傳代培養(yǎng)三次。進(jìn)而，加入6-巰基鳥嘌呤（10ug/ml)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，傳代三次，誘 導(dǎo)細(xì)胞缺乏次黃噪呤鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Hypoxanthineguanine Phosporibosyl Transferase, HGPRT)，從而對HAT敏感。將細(xì)胞移入HAT細(xì)胞培養(yǎng)液中，檢測細(xì)胞對HAT的 敏感性（圖2)。細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量至10 8 ;凍存部分細(xì)胞株。
[0023] (四）誘導(dǎo)細(xì)胞株對哇巴因耐受；
[0024] 在T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)對HAT敏感的骨髓瘤細(xì)胞株，應(yīng)用哇巴因誘導(dǎo)，初始濃 度為0. 01ug/ml ;傳代細(xì)胞，喹巴因逐漸增到0. 03ug/ml,使骨髓瘤細(xì)胞株耐受喹巴因。細(xì)胞 擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量至1〇8 ;凍存部分細(xì)胞株。
[0025] (五）誘導(dǎo)細(xì)胞株對聚乙二醇耐受
[0026] 在T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)對HAT敏感和喹巴因耐受的骨髓瘤細(xì)胞株，應(yīng)用聚乙二 醇（PEG 4000)誘導(dǎo)耐受；PEG 4000初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，細(xì)胞傳代細(xì)后，PEG 4000逐漸增到 5 %，10 %，20 %至50 %，使骨髓瘤細(xì)胞株耐受PEG。細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量至108 ;凍存部分細(xì)胞 株。
[0027] 細(xì)胞株命名為WYZ-26。經(jīng)染色體分型分析顯示：4倍體染色體型，編碼免疫球蛋白 的第2號染色體、第14號染色體和第22號染色體也是4倍體（圖3)。
[0028] 二.人漿細(xì)胞抗原特異性活化和富集 [0029](一）培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞；
[0030] 抽取志愿者外周血，應(yīng)用密度梯度離心法Ficoll分離外周血單個核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cells，PBMC);應(yīng)用免疫磁珠分選單核細(xì)胞；應(yīng)用 GM-CSF/IL-4方案誘導(dǎo)單核細(xì)胞分為化樹突狀細(xì)胞。
[0031] Ficoll 分離分離 PBMC :
[0032] (1)抽取志愿者靜脈血10ml，肝素抗凝
[0033] (2)取50ml離心管，加入10ml全血和10ml生理鹽水，混勻
[0034] (3)取兩支15ml離心管，分別加入5ml Ficoll
[0035] (4)在Ficoll界面緩慢加入10ml倍比稀釋的外周血
[0036] (5) 2000rpm 離心 30min
[0037] (6) 15ml離心管中的液體分為四層（圖4):血漿層（含血小板）、單個核細(xì)胞層、 Ficoll層（含粒細(xì)胞）和細(xì)胞沉淀（含紅細(xì)胞和粒細(xì)胞）；吸取單個核細(xì)胞層
[0038] (7)應(yīng)用RMPI 1640+1% FCS稀釋單個核細(xì)胞層
[0039] (8) lOOOrpm 離心 10min
[0040] (9)棄上清，應(yīng)用RMPI 1640+1 % FCS重懸細(xì)胞，獲得PBMC
[0041] 磁珠分選分選單核細(xì)胞：
[0042] (1)計數(shù) PBMC
[0043] (2) 300g*10min 離心，調(diào)整細(xì)胞濃度至 l*107/80ul
[0044] (3)加入 20ul CD14 免疫磁珠（DS130-050-201)
[0045] (4)4。(：孵育1511^11
[0046] (5)加入 1ml 緩沖液（PBS，含 0· 5% BSA，2mM EDTA)，300g*10min 離心
[0047] (6)去上清，加入緩沖液，總體積500ul，細(xì)胞至多為1*108
[0048] (7)加500ul緩沖液至分選柱MS，靜置平衡柱體，置于磁鐵和磁架中
[0049] (8)加入500ul細(xì)胞懸液至柱體上方
[0050] (9)棄去濾過液
[0051] (10)加入500ul緩沖液至分選柱MS
[0052] (11)棄去濾過液，反復(fù)3次
[0053] (12)使分選柱脫離磁鐵和磁架
[0054] (13)加入1000ul緩沖液至分選柱MS
[0055] (14)應(yīng)用注射器強(qiáng)力推注緩沖液，收集
[0056] (15) 300g*10min 離心，獲得 CD14+ 單核細(xì)胞
[0057] (16)可選：應(yīng)用Anti-CD14-FITC(#130-080-701)標(biāo)記分選細(xì)胞，檢測細(xì)胞純度 (圖5)
[0058] 單核細(xì)胞分為為樹突狀細(xì)胞
[0059] (1)接種單核細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，l*106/ml，2ml
[0060] (2)加入 GM-CSF/IL-4,工作濃度 2〇ng/ml
[0061] (3)細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4天，單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞（圖6)
[0062](二）負(fù)載特異性抗原；
[0063] 以生產(chǎn)乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)全人抗體為例，志愿者是乙肝疫苗接種 者，特異性抗原是HBsAg。在樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的第五天，加入HBsAg(lug/ml);第六天，加入 TNF-a (20ng/ml)，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟；在第七天，收獲負(fù)載特異性抗原HBsAg的成熟樹 突狀細(xì)胞，計數(shù)。
[0064] (三）特異性活化T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞；
[0065] 抽取志愿者靜脈血，如上分離PBMC (含有T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞）；應(yīng)用將負(fù)載特異 性抗原HBsAg的成熟樹突狀細(xì)胞與PBMC共同培養(yǎng)（DC:PBMC = 1:10)，樹突狀細(xì)胞提呈抗原 特異性活化T淋巴細(xì)胞；在輔助性T細(xì)胞的作用下，HBsAg特異性活化B淋巴細(xì)胞。
[0066] (1)計數(shù) DC 和 PBMC
[0067] (2)接種DC (1*106)與PBMC (1*107)至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)體積2ml
[0068] (3)細(xì)胞培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)
[0069] (4)第3天，半量更換新鮮培養(yǎng)液
[0070] (5)第5天，半量更換新鮮培養(yǎng)液 [0071](四）B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞；
[0072] 在培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子雞尾酒，分為四個步驟，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化為分泌IgG 的漿細(xì)胞。同時，檢測培養(yǎng)上清中特異性抗體HBsAb。
[0073] (1)第一個步驟：在第7天起，更換新鮮完全培養(yǎng)基中，加入CpG(10mg/ml)和 sCD40L (50ng/ml)，培養(yǎng)三天
[0074] (2)第二個步驟：更換新鮮完全培養(yǎng)基，加入IL-2(20U/ml)、IL-10(50ng/ml)和 IL-15 (10ng/ml)，培養(yǎng)五天
[0075] (3)第三個步驟：更換新鮮完全培養(yǎng)基，加入IL-6 (50ng/ml)、IL-15 (10ng/ml)和 IFN-a (500U/ml)，培養(yǎng)三天
[0076] (4)第四個步驟：更換新鮮完全培養(yǎng)基，加入11^-6(10叩/1111)和4?1?幾(200叩/1111)， 培養(yǎng)7天
[0077] (5)可選：收集培養(yǎng)上清，應(yīng)用Western-blot檢測特異性抗體HBsAb (圖7)
[0078](五）富集漿細(xì)胞
[0079] 在培養(yǎng)的第10天，應(yīng)用免疫磁珠純化漿細(xì)胞，獲得高表達(dá)⑶138的漿細(xì)胞。
[0080] (1)細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至l*107/80ul
[0081] (2)加入 20ul Anti-CD138 免疫磁珠（DS130-051-301)
[0082] (3)4。(：孵育1511^11
[0083] (4)加入 1ml 緩沖液（PBS，含 0· 5% BSA，2mM EDTA)，300g*10min 離心
[0084] (5)去上清，加入緩沖液，總體積500ul，細(xì)胞至多為1*108
[0085] (6)加500ul緩沖液至分選柱MS，靜置平衡柱體，置于磁鐵和磁架中
[0086] (7)加入500ul細(xì)胞懸液至柱體上方
[0087] (8)棄去濾過液
[0088] (9)加入500ul緩沖液至分選柱MS
[0089] (10)棄去濾過液，反復(fù)3次
[0090] (11)使分選柱脫離磁鐵和磁架
[0091] (12)加入lOOOul緩沖液至分選柱MS
[0092] (13)應(yīng)用注射器強(qiáng)力推注緩沖液，收集
[0093] (14) 300g*10min 離心，獲得 CD138+ 漿細(xì)胞
[0094] (15)可選：應(yīng)用Anti-CD138-PE(#130-081-301))標(biāo)記分選細(xì)胞，檢測細(xì)胞純度。
[0095] 三.人雜交瘤細(xì)胞制備及抗體純化
[0096] (1)培養(yǎng)人骨髓瘤細(xì)胞株WYZ-26
[0097] (2)培養(yǎng)特異性分泌HBsAb的人漿細(xì)胞
[0098] (3)應(yīng)用PEG融合人骨髓瘤細(xì)胞株與人漿細(xì)胞
[0099] (4)篩選獲得高分泌的雜交瘤細(xì)胞株
[0100] (5)應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞株
[0101] (6)收獲培養(yǎng)上清，純化抗體（圖8)，抗體定量，保存。
【權(quán)利要求】
1. 可以用于制備穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞的人骨髓瘤細(xì)胞系，其中所述骨髓瘤細(xì)胞系稱為 WYZ-26。
2. -種制備人雜交瘤細(xì)胞的方法，其特征在于方法包括將權(quán)利要求1所述的人骨髓瘤 細(xì)胞系WYZ-26與漿細(xì)胞融合的步驟。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于包括下列步驟：a)篩查人骨髓瘤細(xì)胞系； b)人工誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞系；c)選擇骨髓瘤細(xì)胞系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于a)步驟包括：i)篩查選擇增殖迅速的人骨 髓瘤細(xì)胞系；ii)篩查選擇不產(chǎn)生抗體的人骨髓瘤細(xì)胞系；b)步驟包括：i)8-氮鳥嘌呤和 6_巰基鳥嘌呤誘導(dǎo)細(xì)胞株獲得對次黃嘌呤、氨基喋呤和者胸苷（HAT)敏感性；ii)進(jìn)一步誘 導(dǎo)細(xì)胞株對哇巴因耐受；iii)誘導(dǎo)細(xì)胞株對聚乙二醇耐受；c)步驟包括：i)篩選能與楽細(xì) 胞高效融合的骨髓瘤細(xì)胞；ii)篩選能高效分泌人抗體的雜交瘤細(xì)胞；iii)篩選染色體型 穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2?4中任一項所述的方法，其特征在于所述漿細(xì)胞是來自主動或者 被動免疫志愿者的B淋巴細(xì)胞抗原特異性分化后的抗體分泌細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述B淋巴細(xì)胞是i)外周血B淋巴細(xì)胞； 2)抗原特異性激活的淋巴細(xì)胞；ii)通流式細(xì)胞儀等分選富集的淋巴細(xì)胞。
7. -種人雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系通過權(quán)利要求2-6中任一項所述的方法制 得。
8. -種全人單克隆抗體，由權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞系制得。
9. 權(quán)利要求8的全人單克隆抗體可以用于制備治療或預(yù)防疾病的藥物。
【文檔編號】C12N5/22GK104195110SQ201410459164
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】張明順, 王云生, 楊永林, 高峰 申請人:張明順