磁珠法提取細菌基因組dna的試劑盒及其提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種磁珠法提取細菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法，該試劑盒包括以下七種組分：緩沖液A、緩沖液B、緩沖液C、磁珠懸浮液D、緩沖液E、緩沖液F、緩沖液G，其中磁珠懸浮液D的組成為每200mmOl/L氯化鈉水溶液中含有50mg單分散Fe304@Si02-AEAPS納米磁珠；該試劑盒提取方法包括以下六個步驟：菌體重懸、裂解、沉淀核酸、磁珠吸附、洗滌、洗脫。本發(fā)明試劑盒采用高效的單分散納米磁珠并配合獨特的緩沖液系統(tǒng)，使得提取出來的細菌基因組DNA片段大、純度高、質量穩(wěn)定可靠，滿足后續(xù)實驗要求。
【專利說明】磁珠法提取細菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，涉及一種磁珠法提取細菌基因組DNA的試劑盒 及其提取方法。

【背景技術】
[0003] 在分子生物學技術中，無論是建立基因文庫、酶切、分子克隆還是全基因組關聯(lián)分 析，都需要從樣本中提取DNA模板。所提取的DNA濃度、純度以及一級結構的完整性直接影 響到后續(xù)研究，因此DNA的質量好壞是基因研究成敗的首要因素。
[0004] 在傳統(tǒng)DNA提取方法中，離心柱法和酚-氯仿法是最主要的兩種方法，其提取的 DNA雖質量較高，但檢測時間長、勞動強度大，最重要的是實驗過程中所使用的氯仿等有毒 試劑對操作者和生態(tài)環(huán)境都造成很大的傷害，而采用磁珠為載體的分離技術，無需離心，無 需接觸有毒試劑，且操作簡單方便，很容易實現自動化，短時間就能實現樣本DNA的快速、 高質量的提取，是未來高通量提取核酸發(fā)展的一個重要方向，具有傳統(tǒng)DNA提取方法無法 比擬的優(yōu)勢。
[0005] 目前，國外比較知名的生物技術公司，如Qiagen、Promega、Amresco等都相繼開發(fā) 出了磁珠法核酸提取試劑盒或磁珠法高通量核酸提取儀，他們的產品大都操作步驟簡單、 獲得的核酸質量高，片段完整，但價格昂貴；國內比較知名的生物技術公司，如天根、康為世 紀、金麥格等開發(fā)出的磁珠法核酸提取試劑盒，內置磁珠均為多分散磁珠，雖然磁響應速度 很快，但磁珠沉降速度也很快，由此導致磁珠與緩沖液作用不充分，這也成為制約其產品發(fā) 展的一個主要因素。因此，在國內開發(fā)內置磁珠為單分散磁珠并配合相應的緩沖液系統(tǒng)，使 獲得的DNA片段大、純度高、質量穩(wěn)定可靠，滿足后續(xù)實驗要求的磁珠法核酸提取產品已迫 在眉睫。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種采用磁珠法提取細菌基因組 DNA的試劑盒及其提取方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的：一種磁珠法提取細菌基因組DNA的試 劑盒，包括緩沖液A、緩沖液B、緩沖液C、磁珠懸浮液D、緩沖液E、緩沖液F、緩沖液G七種組 分； 所述緩沖液A終濃度組成為：20-50mm〇l/L葡萄糖、10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽（Tris-HCl)、5-20mm〇l/L乙二胺四乙酸（EDTA)，溶劑為高壓滅菌水（緩沖液A終 PH=8. 0-8. 5)； 所述緩沖液B終濃度組成為：15-25mg/ml蛋白酶K、l-5mol/L鹽酸胍、5-25mmol/L檸 檬酸鈉、1-2%曲拉通（Triton X-100)、0. 5-5mmol/L EDTA，溶劑為高壓滅菌水（緩沖液B終 PH=4. 0-5. 5)； 所述緩沖液C成分組成為：無水乙醇溶液； 所述緩沖液E終濃度組成為：l-5mol/L醋酸鈉，體積分數為20-40%無水乙醇，溶劑為 高壓滅菌水（緩沖液E終ΡΗ=4· 0-5. 5); 所述緩沖液 F 終濃度組成為：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L 0.5-5mmol/L EDTA、5-25mmol/L檸檬酸鈉和無水乙醇，0. 3-0. 7 L/L的無水乙醇，溶劑為高壓滅菌水（緩 沖液 F 終 ΡΗ=8· 0-8. 5); 所述緩沖液G終濃度組成為：10-30mmol/L Tris-HCl、0. 5-5mmol/L EDTA，溶劑為高壓 滅菌水（緩沖液G終ΡΗ=8· 0-8. 5)。
[0008] 所述磁珠懸浮液D成分組成為：每200mmol/L氯化鈉水溶液中含有50mg單分散 Fe3O4IgSiO2-AEAPS納米磁珠。單分散Fe3O 4IgSiO2-AEAPS納米磁珠通過以下步驟制備得到： (1) 溶劑熱法制備單分散的四氧化三鐵納米球； (2) 采用改進的StSber法，在四氧化三鐵納米球外包覆二氧化娃，得到單分散的Fe3O4O SiO 2納米球，具體為：稱取0. Ig步驟（1)制備得到的四氧化三鐵納米球，向其中依次加入 20ml去離子水、80ml無水乙醇和Iml質量分數為28%的氨水，超聲混合均勻后向混合液中 加入Iml正硅酸乙酯，室溫（20° C)下機械攪拌6小時；反應完畢后，將所得溶液離心，并依 次用去離子水和乙醇清洗3次，制得單分散的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球（Fe 3O4OSiO2 納米球)，將所得產物在60° C烘箱中干燥待用； (3) 使用硅烷偶聯(lián)劑氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷對步驟（2)獲得的Fe304@Si02進行 硅烷化處理，得到Fe 3O4IgSiO2-AEAPS ;具體為：稱取0. Ig步驟（2)得到的Fe304@Si02納米 球，加入到20ml二甲基甲酰胺中，超聲分散后得到溶液A ;將IOml的氨乙基氨丙基聚二甲 基硅氧烷和20ml的二甲基甲酰胺混合均勻后，加入一定量的丁二酸酐使得混合溶液pH值 維持在3. 9~4. 1，60° C下機械攪拌3小時，得到溶液B ;將溶液A、B混合后加入20ml去離 子水，在60° C下繼續(xù)機械攪拌5小時后，將所得溶液離心，并依次用去離子水和乙醇清洗 3次，制得單分散的硅烷化的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球（Fe304@Si02-AEAPS)。
[0009] 用試劑盒提取細菌基因組DNA的方法，包括如下步驟： (1)取細菌培養(yǎng)液1-1. 5ml置于2. Oml EP管中，12000 rpm離心l-3min，收集菌體，力口 入150-300ul緩沖液A ; 注意：若為革蘭氏陽性菌，需在加入150-300ul緩沖液A后繼續(xù)加入20 μ 1溶菌酶 (20mg/ml)進行破壁處理，抽打混勻或振蕩混勻后將EP管置于37° C水浴孵育lh，期間混 勻數次。
[0010] (2)向步驟（I)EP管中加入150-300U1緩沖液B，45-65° C水浴孵育5-10min ; (3) 向步驟（2)孵育后的EP管中加入150-300ul緩沖液C，混勻后靜置5-10min ; (4) 向步驟（3)靜置后的EP管中加入10-50ul磁珠懸浮液D，將EP管置于磁力架上， 靜置10-60s后去除液體； (5) 將步驟（4) EP管從磁力架上取下，加入200-600ul緩沖液E，混勻混勻后將EP管 置于磁力架上，靜置10-60S后去除液體，再將EP管從磁力架上取下，加入200-1000ul緩 沖液F,抽打混勻或振蕩混勻后將EP管置于磁力架上,靜置10-60s后去除液體,室溫靜置 5-10min ； (6)將步驟（5) EP管從磁力架上取下，加入50-100ul緩沖液G，混勻后將EP管置于 45-65° C水浴孵育5-10min，取出后將EP管置于磁力架上靜置10-60s后將上清液轉移至 收集管中，完成細菌DNA的提取。
[0011] 與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明公開的磁珠法提取細菌基因組 DNA的試劑盒及其提取方法，是一種簡單有效的核酸提取方法。本發(fā)明試劑盒中的單分散納 米磁珠，具有較均一的尺寸及形狀，在自制的緩沖液中沉降速度慢，便于磁珠與核酸充分接 觸，增大提取效率，我們在磁珠表面連接了可特異地與DNA發(fā)生作用的功能基團，具有可逆 吸附DNA的特性，再配以獨特的緩沖系統(tǒng)，使得本發(fā)明試劑盒在不需要任何有毒溶劑，不需 要反復離心、真空過濾或柱分離等步驟，僅僅是以核酸結合磁珠為基礎，便能達到提取出來 的細菌基因組DNA片段大、純度高、質量穩(wěn)定可靠，滿足后續(xù)實驗要求，大大減少了實驗對 工作人員的危害，以及降低了實驗設備的特殊要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1本發(fā)明的試劑盒提取的志賀菌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖2本發(fā)明的試劑盒提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0013] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明權利要求所限定的范圍構成進一步 的限定。
[0014] 實施例1，單分散Fe3O4IgSiO2-AEAPS納米磁珠的制備。
[0015] (1)采用溶劑熱法制備單分散的四氧化三鐵納米球，具體制備過程如下：分別稱取 2. Og醋酸鈉和0. 25g三氯化鐵六水合物，加入到50ml乙二醇溶液中，磁力攪拌1小時后將 體系轉移到反應釜中，100° C下反應10小時。反應完畢后，將所得黑色溶液離心，并依次 用去離子水和乙醇清洗3次，制得單分散的四氧化三鐵納米球（Fe 3O4),將所得產物在60° C 烘箱中干燥待用； (2)采用改進的St^ber法制備單分散的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球，具體制備過 程如下：稱取0. Ig步驟（1)制備得到的四氧化三鐵納米球，向其中依次加入20ml去離子 水、80ml無水乙醇和Iml質量分數為28%的氨水，超聲混合均勻后向混合液中加入Iml正娃 酸乙酯，室溫下機械攪拌6小時。反應完畢后，將所得黑色溶液離心，并依次用去離子水和 乙醇清洗3次，制得單分散的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球（Fe 3O4IgSiO2),將所得產物在 60° C烘箱中干燥待用。
[0016] (3)稱取0· Ig步驟（2)得到的Fe3O4OSiO2納米球，加入到20ml二甲基甲酰胺中， 超聲分散后得到溶液A ;將IOml的氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷和20ml的二甲基甲酰胺 混合均勻后，加入一定量的丁二酸酐使得混合溶液PH值維持在3. 9~4. 1，60° C下機械攪拌 3小時，得到溶液B ;將溶液A、B混合后加入20ml去離子水，在60° C下繼續(xù)機械攪拌5小 時后，將所得黑色溶液離心，并依次用去離子水和乙醇清洗3次，制得單分散的硅烷化的二 氧化硅包覆四氧化三鐵納米球（Fe 304@Si02-AEAPS)，將所得產物在60° C烘箱中干燥。
[0017] 實施例2 :應用實施例。
[0018] (1)取新鮮志賀菌培養(yǎng)液Iml置于2.0ml EP管中，12000 rpm Imin離心，收集菌 體，加入200ul緩沖液A，抽打混勻，使菌體重懸； (2) 向步驟（I)EP管中加入200ul緩沖液B，56° C水浴，孵育IOmin ; (3) 向步驟（2)孵育后的EP管中加入200ul緩沖液C，抽打混勻，室溫靜置3min ; (4) 向步驟（3)靜置后的EP管中加入30ul磁珠懸浮液D，抽打混勻，將EP管置于磁力 架上，靜置30s，待磁珠完全吸附時小心去除液體； (5) 將步驟（4) EP管從磁力架上取下，加入500ul緩沖液E，抽打混勻后將EP管置于 磁力架上，靜置30s，待磁珠完全吸附時小心去除液體，再將EP管從磁力架上取下，加入 IOOOul緩沖液F，抽打混勻后將EP管置于磁力架上，靜置30s，待磁珠完全吸附時小心去除 液體，室溫靜置IOmin ; (6) 將步驟（5) EP管從磁力架上取下，加入50ul緩沖液G，抽打混勻后將EP管置于 56° C水浴，孵育5min，取出后將EP管置于磁力架上靜置30s，待磁珠完全吸附時小心將 DNA溶液轉移至收集管中，置于-20° C保存?zhèn)溆谩?br> [0019] 將所提取的基因組DNA經NanoDrop (ND-1000)檢測提取DNA的濃度和純度，其中 DNA純度用0D260/0D280的比值來衡量(一般認為純DNA 0D260/0D280的比值介于1. 8-2. 0 之間)，每個樣本做兩次平行檢測，檢測結果如表1所示。
[0020] 表 1

【權利要求】
1. 一種磁珠法提取細菌基因組DNA的試劑盒，其特征在于：其包括緩沖液A、緩沖液B、 緩沖液C、磁珠懸浮液D、緩沖液E、緩沖液F、緩沖液G七種組分； 所述緩沖液A終濃度組成為：20-50mm〇l/L葡萄糖、10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽（Tris-HCl)、5-20mm〇l/L乙二胺四乙酸（EDTA)，溶劑為高壓滅菌水（緩沖液A終 PH=8. 0-8. 5)； 所述緩沖液B終濃度組成為：15-25mg/ml蛋白酶K、l-5mol/L鹽酸胍、5-25mmol/L檸 檬酸鈉、1-2%曲拉通（Triton X-100)、0. 5-5mmol/L EDTA，溶劑為高壓滅菌水（緩沖液B終 PH=4. 0-5. 5)； 所述緩沖液C成分組成為：無水乙醇溶液； 所述緩沖液E終濃度組成為：l-5mol/L醋酸鈉，體積分數為20-40%無水乙醇，溶劑為 高壓滅菌水（緩沖液E終ΡΗ=4· 0-5. 5); 所述緩沖液 F 終濃度組成為：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L 0.5-5mmol/L EDTA、5-25mmol/L檸檬酸鈉和無水乙醇，0. 3-0. 7 L/L的無水乙醇，溶劑為高壓滅菌水（緩 沖液 F 終 ΡΗ=8· 0-8. 5); 所述緩沖液G終濃度組成為：10-30mmol/L Tris-HCl、0. 5-5mmol/L EDTA，溶劑為高壓 滅菌水（緩沖液G終ΡΗ=8· 0-8. 5); 所述磁珠懸浮液D成分組成為：每200mmol/L氯化鈉水溶液中含有50mg單分散Fe3O4O SiO2-AEAPS納米磁珠。
2. 根據權利要求1所述的磁珠法提取細菌基因組DNA的試劑盒，其特征在于，所述單分 散Fe3O4IgSiO 2-AEAPS納米磁珠通過以下步驟制備得到： (1) 溶劑熱法制備單分散的四氧化三鐵納米球； (2) 采用改進的StSber法，在四氧化三鐵納米球外包覆二氧化娃，得到單分散的Fe3O4O SiO 2納米球，具體為：稱取0. Ig步驟（1)制備得到的四氧化三鐵納米球，向其中依次加入 20ml去離子水、80ml無水乙醇和Iml質量分數為28%的氨水，超聲混合均勻后向混合液中 加入Iml正硅酸乙酯，室溫（20° C)下機械攪拌6小時；反應完畢后，將所得溶液離心，并依 次用去離子水和乙醇清洗3次，制得單分散的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球（Fe 3O4OSiO2 納米球)，將所得產物在60° C烘箱中干燥待用； (3) 使用硅烷偶聯(lián)劑氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷對步驟（2)獲得的Fe304@Si02進行 硅烷化處理，得到Fe 3O4IgSiO2-AEAPS ;具體為：稱取0. Ig步驟（2)得到的Fe3O4OSiO2納米球， 加入到20ml二甲基甲酰胺中，超聲分散后得到溶液A ;將IOml的氨乙基氨丙基聚二甲基硅 氧烷和20ml的二甲基甲酰胺混合均勻后，加入一定量的丁二酸酐使得混合溶液pH值維持 在3.9~4. 1，60° C下機械攪拌3小時，得到溶液B ;將溶液A、B混合后加入20ml去離子水， 在60° C下繼續(xù)機械攪拌5小時后，將所得溶液離心，并依次用去離子水和乙醇清洗3次， 制得單分散的硅烷化的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球（Fe 304@Si02_AEAPS)。
3. -種權利要求1所述的試劑盒提取細菌基因組DNA的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 取待測細菌培養(yǎng)液l_1.5ml置于2. Oml EP管中，12000 rpm離心l-3min，收集菌 體，加入150-300ul緩沖液A ; (2) 向步驟（I)EP管中加入150-300ul緩沖液B，45-65° C水浴孵育5-10min ; (3) 向步驟（2)孵育后的EP管中加入150-300ul緩沖液C，混勻后靜置5-10min ; (4) 向步驟（3)靜置后的EP管中加入10-50ul磁珠懸浮液D，將EP管置于磁力架上， 靜置10-60s后去除液體； (5) 將步驟（4) EP管從磁力架上取下，加入200-600ul緩沖液E，混勻混勻后將EP管 置于磁力架上，靜置10-60S后去除液體，再將EP管從磁力架上取下，加入200-1000ul緩 沖液F,抽打混勻或振蕩混勻后將EP管置于磁力架上,靜置10-60s后去除液體,室溫靜置 5-10min ； (6) 將步驟（5) EP管從磁力架上取下，加入50-100ul緩沖液G，混勻后將EP管置于 45-65° C水浴孵育5-10min，取出后將EP管置于磁力架上靜置10-60s后將上清液轉移至 收集管中，完成細菌DNA的提取。
【文檔編號】C12N15/10GK104212793SQ201410388366
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權日:2014年8月8日
【發(fā)明者】郝榮章, 宋宏彬, 李楊, 趙榮濤, 許金坤, 盧曉, 董世彪, 邱少富, 王勇, 賈雷立, 李鵬, 謝靖, 王立貴, 吳志豪 申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所