一種中空容器內(nèi)表面微生物的取樣方法和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種中空容器內(nèi)表面微生物的取樣方法和檢測方法。本發(fā)明的取樣方法包括如下步驟：在無菌環(huán)境下，將無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液置于所測容器中，所述的無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的體積為所測容器額定容量的30％～35％；用無菌蓋將所測容器的口封住，振蕩所測容器，使所測容器內(nèi)水溶液充分涮洗到容器所有內(nèi)表面，并充分混勻，振蕩后所得溶液即為取樣的樣本液；所述的中空容器的口徑面積為小于或等于100平方厘米。本發(fā)明的中空容器內(nèi)表面微生物取樣及檢測方法操作簡單、能全面反映整個中空容器內(nèi)表面微生物污染狀況、成本低廉、方法適用范圍廣泛、利于工業(yè)化應(yīng)用。
【專利說明】-種中空容器內(nèi)表面微生物的取樣方法和檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中空容器內(nèi)表面微生物的取樣方法和檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 食品包裝的安全性直接影響著包裝內(nèi)食品的質(zhì)量。針對非在線生產(chǎn)的用于直接灌 裝的中空食品包裝而言，在存儲、運(yùn)輸過程中存在著被污染的風(fēng)險(xiǎn)，從而會影響食品的安全 性以及貨架期。
[0003] 目前我國關(guān)于一次性餐飲具微生物的取樣方法，基本參照《GB18006. 1-2009塑料 一次性餐飲具通用技術(shù)要求》。該標(biāo)準(zhǔn)適用于賓館、飯店、餐廳、食堂等餐飲企業(yè)的食（飲） 具，也適用于個體攤點(diǎn)的食（飲）具。一次性餐飲具定義為預(yù)期用餐或類似用途的餐具，包 括一次性使用的餐盒、盤、碟、刀、叉、筷子、碗、杯、罐、壺、吸管等，也包括有外托的一次性內(nèi) 襯餐具，但不包括無預(yù)期用餐目的或類似用途的食品包裝物如生鮮食品托盤、酸奶杯、果凍 杯等。GB18006. 1-2009中微生物指標(biāo)中的大腸菌群檢驗(yàn)是參照GB14934-94進(jìn)行的、霉菌計(jì) 數(shù)按GB/T4789. 15進(jìn)行。
[0004] 對于諸如酸奶桶等中空容器內(nèi)表面的微生物取樣方法，由于沒有相關(guān)的法律規(guī) 定，公立的第三方檢測機(jī)構(gòu)基本是按照《GB18006. 1-2009塑料一次性餐飲具通用技術(shù)要求》 中的發(fā)酵法進(jìn)行微生物取樣。該方法具體是將2. 0cmX2. 5cm滅菌濾紙片緊貼內(nèi)面各10張 (總面積50cm2)，經(jīng)lmin，按序取下濾紙片置入50mL滅菌水試管中，充分振蕩后，制成原液。 這樣的取樣方法，對于中空容器來說，操作起來不方便，給取樣造成困難。市場上也難以買 到現(xiàn)成的無菌濾紙片。工業(yè)上使用的中空容器大多是小口中空容器，取樣難度非常大。而 且，發(fā)酵法僅僅對容器局部進(jìn)行取樣，并不能全面地反映整個容器內(nèi)部的污染狀況，其結(jié)果 是片面的。相對于惡劣環(huán)境的下制造、運(yùn)輸及保存，在空氣凈化級別在10萬級及以上的環(huán) 境條件下，采用發(fā)酵法對中空容器進(jìn)行微生物取樣所帶來的片面性會更加嚴(yán)重。
[0005] 同樣，一些企業(yè)會使用膜過濾法進(jìn)行樣品微生物取樣和檢測。膜過濾法是用體積 為樣品容量1/3的無菌水涮洗容器內(nèi)表面，振蕩后取得樣本液，經(jīng)過抽真空閥，通過孔徑為 0. 45 μ m的濾膜，將水分抽掉，使微生物保留在濾膜上，并對濾膜片進(jìn)行培養(yǎng)，查看菌落數(shù)量 的方法。膜過濾法雖然精確，但該方法更適用于10萬級潔凈度及以上的環(huán)境條件下運(yùn)輸、 存儲的產(chǎn)品，對污染嚴(yán)重的樣品，菌落過多，會將濾膜堵塞，導(dǎo)致無法讀數(shù)，且其檢測所需的 設(shè)備、耗材等，價格都比較昂貴，不適合于工廠大規(guī)模的長期檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，為了克服現(xiàn)有的中空容器內(nèi)表面微生物取樣和 檢測方法操作困難、不能全面反映整個容器內(nèi)表面微生物污染狀況以及成本較高、方法適 用范圍有限、不利于工業(yè)化應(yīng)用的缺陷，而提供了一種中空容器內(nèi)表面微生物的取樣方法 和檢測方法。本發(fā)明的中空容器內(nèi)表面微生物取樣及檢測方法操作簡單、能全面反映整個 中空容器內(nèi)表面微生物污染狀況、成本低廉、方法適用范圍廣泛、利于工業(yè)化應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種中空容器內(nèi)表面微生物的取樣方法，其包括如下步驟：在無菌 環(huán)境下，將無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液置于所測容器中，所述的無菌生理鹽水或磷酸鹽 緩沖液的體積為所測容器額定容量的30%?35% ;用無菌蓋將所測容器的口封住，振蕩所 測容器，使所測容器內(nèi)水溶液充分涮洗到容器所有內(nèi)表面，并充分混勻，振蕩后所得溶液即 為取樣的樣本液；所述的中空容器的口徑面積為小于或等于1〇〇平方厘米。
[0008] 所述的無菌環(huán)境一般為無菌室中。
[0009] 所述的振蕩的方法可為本領(lǐng)域常規(guī)各種方法，可依據(jù)容器大小和重量選擇不同的 振蕩方法，優(yōu)選人工振蕩和機(jī)械振蕩。所述的機(jī)械振蕩優(yōu)選用搖床振蕩。
[0010] 所述的中空容器的口徑面積優(yōu)選小于或等于90平方厘米，更優(yōu)選小于或等于50 平方厘米，最優(yōu)選小于或等于20平方厘米。
[0011] 所述的中空容器的材質(zhì)優(yōu)選為塑料、玻璃、金屬或陶瓷，更優(yōu)選為塑料或玻璃。所 述的塑料優(yōu)選為聚乙烯、聚丙烯或聚對苯二甲酸乙二醇酯塑。
[0012] 所述的無菌生理鹽水優(yōu)選為0. 85%的無菌氯化鈉水溶液，百分比為氯化鈉質(zhì)量相 對于水溶液中水的質(zhì)量的質(zhì)量百分比。所述的無菌生理鹽水更優(yōu)選為按照《GB4789. 2-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》中無菌生理鹽水的配制方法進(jìn)行配制 所得的水溶液，所述的配制方法的步驟為：稱量8. 5g氯化鈉和1000mL蒸餾水，然后將兩者 混合溶解后于121°C高壓滅菌15min。
[0013] 所述的磷酸鹽緩沖液優(yōu)選為6. 8%的磷酸二氫鉀水溶液，且pH值為7. 2,百分比為 磷酸二氫鉀質(zhì)量相對于水溶液中水的質(zhì)量的質(zhì)量百分比。所述的磷酸鹽緩沖液更優(yōu)選為按 照《GB4789. 2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》中磷酸鹽緩沖液 的配制方法進(jìn)行配制所得的水溶液，所述的配制方法的步驟為：稱量34. 0g磷酸二氫鉀和 500mL蒸餾水，將兩者混合溶解后，用大約175mL的lmol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2， 用蒸饋水稀釋至l〇〇〇mL后，取其中1.25mL，用蒸饋水稀釋至1000mL，121°C高壓滅菌lmin。
[0014] 所述的取樣方法在進(jìn)行前優(yōu)選進(jìn)行以下預(yù)處理：當(dāng)所述的所測容器的外包裝有二 層以上時，在進(jìn)入所述的無菌環(huán)境之前，除去第一層外包裝；當(dāng)所述的所測容器的外包裝僅 為一層時，先用75%酒精消毒這層外包裝，然后在進(jìn)入所述的無菌環(huán)境之前，除去這層外包 裝。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種中空容器內(nèi)表面微生物的檢測方法，其包括如下步驟：
[0016] (1)、按照所述的中空容器內(nèi)表面微生物取樣方法進(jìn)行取樣，得樣本液；
[0017] (2)、用無菌吸管吸取步驟（1)中混勻的樣本液中的一部分或全部，放入培養(yǎng)皿中 進(jìn)行微生物培養(yǎng)，然后測定培養(yǎng)后的液體中微生物含量。
[0018] 所述的微生物培養(yǎng)的方法可為本領(lǐng)域常規(guī)的微生物培養(yǎng)的方法，一般可按照食品 安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789中各種微生物培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選按照《GB4789. 2-2010食品安 全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》、《GB4789. 3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微 生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中的第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法或《GB4789. 15-2010食品安全 國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行培養(yǎng)。
[0019] 所述的測定的方法可為本領(lǐng)域常規(guī)的微生物測定的方法，一般可按照食品安全國 家標(biāo)準(zhǔn)GB4789中各種微生物測定方法進(jìn)行測定，優(yōu)選按照《GB4789. 2-2010食品安全國家 標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》、《GB4789. 3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué) 檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中的第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法或《GB4789. 15-2010食品安全國家標(biāo) 準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行測定。
[0020] 所述的一部分的體積量優(yōu)選為lmL。
[0021] 所述的微生物含量的計(jì)量單位的換算可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，一般按照以下 步驟進(jìn)行：先計(jì)算所述的樣本液中的一部分或全部在樣本液總量中所占的體積百分比，然 后用所述的微生物含量除以該體積百分比的數(shù)值，得出的數(shù)值再除以所測容器內(nèi)表面積的 數(shù)值，即可得到所測容器的單位面積的微生物含量。
[0022] 所述的內(nèi)表面積的數(shù)值可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得，一般由所測容器的生產(chǎn)廠商 提供。
[0023] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0024] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0025] 本發(fā)明的取樣方法和檢測方法適用于無在線殺菌設(shè)施、非在線吹灌一體機(jī)以及從 成型到灌裝需經(jīng)過運(yùn)輸?shù)臈l件下所制造、存儲和使用的一次性食品包裝類中空容器的內(nèi)表 面微生物取樣和檢測。本發(fā)明的取樣方法和檢測方法普適性好，取樣和檢測對象既可以為 潔凈度不高的惡劣環(huán)境下的中空容器，也可以是潔凈度高的環(huán)境下的中空容器。
[0026] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明的中空容器內(nèi)表面微生物取樣及檢測方法操 作簡單、能全面反映整個中空容器內(nèi)表面微生物污染狀況、成本低廉、方法適用范圍廣泛、 利于工業(yè)化應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0028] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，0. 85%無菌生理鹽水的配制方法為：稱取8. 5g氯 化鈉溶于l〇〇〇mL蒸饋水中，121°C高壓滅菌15min。
[0029] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的原料包括：5. 0g胰蛋白胨、 2. 5g酵母浸膏、1. 0g葡萄糖、15. 0g瓊脂和1000mL蒸饋水，其配制方法為：將上述原料混 合，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7. 0±0. 2,分裝于試管或錐形瓶中，121°C高壓滅菌15min。
[0030] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA)的原料包括：7. 0g 蛋白胨、3. 0g酵母膏、10. 0g乳糖、5. 0g氯化鈉、1. 5g膽鹽或3號膽鹽、0. 03g中性紅、0. 002g 結(jié)晶紫、15?18g瓊脂和1000mL蒸餾水，其配制方法為：將上述成分混合并溶解，靜置幾分 鐘，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH至7. 4±0. 1，煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45°C?50°C傾注平板，使用 前臨時制備，不得超過3h。
[0031] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，煌綠乳糖膽鹽（BGLB)肉湯的原料包括：10. 0g蛋 白胨、10. 0g乳糖、200mL牛膽粉（oxgall或oxbile)溶液、13. 3mL0. 1%煌綠水溶液和800mL 蒸餾水，其配制方法為：將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL(將 20. 0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7. 0?7. 5)，用蒸餾水稀釋到975mL，調(diào) 節(jié)pH至7. 2±0. 1，再加入0. 1%煌綠水溶液13. 3mL，用蒸餾水補(bǔ)足到lOOOmL，用棉花過濾 后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL，12rC高壓滅菌15min。
[0032] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂的原料包括：300g馬鈴薯 (去皮切塊）、20. 0g葡萄糖、20. 0g瓊脂、0. lg氯霉素和1000mL蒸餾水，其配制方法為：將馬 鈴薯去皮切塊，加 l〇〇〇mL蒸饋水，煮沸l(wèi)Omin?20min，用紗布過濾，補(bǔ)加蒸饋水至lOOOmL， 加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝后，121°C滅菌20min，傾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉 素加入培養(yǎng)基中。
[0033] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，用到的膜過濾裝置，其生產(chǎn)商為Sartorius AG，型 號為 PL5832-NF300,功率為 166MPa。
[0034] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，用到的微孔濾膜，其孔徑為0.45 μ m，直徑為 50mm，其供應(yīng)商為上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠。
[0035] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，針對每個樣本液或固體樣本，菌落總數(shù)的測定按 照以下步驟進(jìn)行：若樣本為樣本液的，從樣本液中取2個lmL分別加入到2個無菌培養(yǎng)皿 內(nèi)，若樣本為固體樣本的，直接將該固體樣本放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)；同時，吸取2個lmLO. 85% 無菌生理鹽水分別加入到2個無菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照；及時將15mL?20mL冷卻至46°C 的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46°C ±1°C恒溫水浴箱中保溫）傾注于上述各培養(yǎng)皿 中，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其混合均勻；待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36°C ± 1°C培養(yǎng)48h±2h，如 果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄 層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL)，凝固后翻轉(zhuǎn)平板，然后36°C ±1°C培養(yǎng)48h±2h ;最后對培養(yǎng)后的 菌落計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄菌落數(shù)量，并計(jì)算出2個非 空白對照的培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)量的平均值，若任一空白對照培養(yǎng)皿上有菌落生長，則此次檢 測結(jié)果無效；
[0036] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，針對每個樣本液或固體樣本，大腸菌群的測定按 照以下步驟進(jìn)行：若樣本為樣本液的，從樣本液中取2個lmL分別加入到2個無菌培養(yǎng)皿 內(nèi)，若樣本為固體樣本的，直接將該固體樣本放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)；同時，吸取2個lmLO. 85% 無菌生理鹽水分別加入到2個無菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照；及時將15mL?20mL冷至46°C的 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA)傾注于上述培養(yǎng)皿中，小心旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)基與樣本液 充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL?4mLVRBA覆蓋平板表層，翻轉(zhuǎn)平板，置于36°C ± 1°C培 養(yǎng)18h?24h ;選取菌落數(shù)在15CFU?150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可 疑大腸菌群菌落，兩者之和記為每個培養(yǎng)皿上的原始平板菌落數(shù)，典型菌落為紫紅色，菌落 周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為〇. 5_或更大；從VRBA平板上挑取10個不同類型的 典型和可疑菌落，分別移種于煌綠乳糖膽鹽（BGLB)肉湯管內(nèi)，36°C ±1°C培養(yǎng)24h?48h， 觀察產(chǎn)氣情況，凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性；經(jīng)證實(shí)為大腸菌群陽性的 試管比例（比如，若這10個試管中，有6個證實(shí)為陽性，則該比例為6/10)乘以每個培養(yǎng)皿 上的原始平板菌落數(shù)，即為該培養(yǎng)皿所對應(yīng)的該lmL樣本液的大腸菌群數(shù)，并計(jì)算出2個非 空白對照的培養(yǎng)皿內(nèi)大腸菌群數(shù)的平均值，若任一空白對照培養(yǎng)皿上有大腸菌群生長，則 此次檢測結(jié)果無效；
[0037] 以下各實(shí)施例和對比實(shí)施例中，針對每個樣本液或固體樣本，霉菌和酵母的測定 按照以下步驟進(jìn)行：若樣本為樣本液的，從樣本液中取2個lmL分別加入到2個無菌培養(yǎng)皿 內(nèi)，若樣本為固體樣本的，直接將該固體樣本放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)；同時，吸取2個lmLO. 85 % 無菌生理鹽水分別加入到2個無菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照；及時將15mL?20mL冷卻至46°C 的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基（可放置于46°C ±1°C恒溫水浴箱中保溫）傾 注于上述培養(yǎng)皿內(nèi)，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其混合均勻，待瓊脂凝固后，將平板倒置，28°C ± 1°C培 養(yǎng)5d ;最后對培養(yǎng)后的菌落計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察，必要時用放大鏡，記錄菌落數(shù)量，根據(jù)菌 落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母數(shù)，并計(jì)算出2個非空白對照的培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)量的平均值， 若任一空白對照培養(yǎng)皿上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效；
[0038] 效果實(shí)施例1和2中的樣品瓶，其外帶生產(chǎn)外包裝，總數(shù)為50個，為外觀、形狀、大 小和材質(zhì)均相同的容器，均由浙江金石包裝有限公司生產(chǎn)和提供。樣品瓶的材料為聚乙烯， 容量為1500mL，瓶口直徑32mm，且內(nèi)表面積為656cm 2,容量為1500mL的不規(guī)則形狀的塑料 瓶，其內(nèi)表面積的數(shù)據(jù)由浙江金石包裝有限公司提供，其外包裝的材料為食品級塑料薄膜 (主要為PP和PE)。樣品瓶在檢測前不撕毀生產(chǎn)外包裝，存放于常溫室內(nèi)。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0041] 1)、樣品瓶預(yù)處理：將10個帶有外包裝的樣品瓶整包取，并除去第一層外包裝（僅 一層外包裝的不用除去外包裝且用75%酒精消毒外包），再進(jìn)入到無菌室檢測（這樣可以 避免外包裝上面的異物污染無菌室），進(jìn)入無菌室后，除去樣品瓶的所有外包裝；
[0042] 2)、樣品內(nèi)表面微生物取樣：
[0043] 在無菌室內(nèi)，將步驟1)中的每個樣品瓶分別進(jìn)行以下操作：將樣品瓶中傾注體積 為500ml的0.85%無菌生理鹽水，用無菌蓋將樣品瓶的口封住，用手振蕩樣品瓶，使樣品 瓶內(nèi)水溶液充分涮洗到樣品瓶所有內(nèi)表面，并充分混勻，振蕩后所得溶液即為取樣的樣本 液；
[0044] 3)、樣本液中微生物培養(yǎng)和測定：將步驟2)中的10個樣本液進(jìn)行三種微生物培養(yǎng) 和測定，分別為：菌落總數(shù)的測定、大腸菌群的測定以及霉菌和酵母的測定，每個樣本液的 每種測定均得到一個平均值；
[0045] 4)、將步驟3)中得到的每個平均值乘以其所對應(yīng)的步驟2)中的樣本液原始體積 (單位為mL)的數(shù)值后，除以樣品容器的內(nèi)表面積的數(shù)值（單位為cm 2)，所得數(shù)值填入表1 的"檢出值"欄中，并求算表1中每行"檢出值"的平均值，檢測結(jié)果見表1。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0048] 1)、樣品瓶預(yù)處理：將10個帶有外包裝的樣品瓶整包取，并除去第一層外包裝（僅 一層外包裝的不用除去外包裝且用75%酒精消毒外包），再進(jìn)入到無菌室檢測（這樣可以 避免外包裝上面的異物污染無菌室），進(jìn)入無菌室后，除去樣品瓶的所有外包裝；然后將未 經(jīng)過殺菌處理的生鮮牛奶倒入樣品瓶中，振蕩使牛奶充分接觸到樣品瓶所有內(nèi)表面，以此 來對樣品瓶進(jìn)行人為污染，達(dá)到模擬潔凈度不高的惡劣環(huán)境下的樣品瓶的目的；然后將這 些牛奶從樣品瓶中倒出；
[0049] 2)、樣品內(nèi)表面微生物取樣：
[0050] 在無菌室內(nèi)，將步驟1)中的每個樣品瓶分別進(jìn)行以下操作：將樣品瓶中傾注體積 為500ml的0.85%無菌生理鹽水，用無菌蓋將樣品瓶的口封住，用手振蕩樣品瓶，使樣品 瓶內(nèi)水溶液充分涮洗到樣品瓶所有內(nèi)表面，并充分混勻，振蕩后所得溶液即為取樣的樣本 液；
[0051] 3)、樣本液中微生物培養(yǎng)和測定：將步驟2)中的10個樣本液進(jìn)行三種微生物培養(yǎng) 和測定，分別為：菌落總數(shù)的測定、大腸菌群的測定以及霉菌和酵母的測定，每個樣本液的 每種測定均得到一個平均值；
[0052] 4)、將步驟3)中得到的每個平均值乘以其所對應(yīng)的步驟2)中的樣本液原始體積 (單位為mL)的數(shù)值后，除以樣品容器的內(nèi)表面積的數(shù)值（單位為cm 2)，所得數(shù)值填入表1 的"檢出值"欄中，并求算表1中每行"檢出值"的平均值，檢測結(jié)果見表1。
[0053] 對比實(shí)施例1發(fā)酵法
[0054] 發(fā)酵法的實(shí)驗(yàn)步驟：
[0055] 1)、樣品瓶預(yù)處理：將10個帶有外包裝的樣品瓶整包取，并除去第一層外包裝（僅 一層外包裝的不用除去外包裝且用75%酒精消毒外包），再進(jìn)入到無菌室檢測（這樣可以 避免外包裝上面的異物污染無菌室），進(jìn)入無菌室后，除去樣品瓶的所有外包裝
[0056] 2)、樣品內(nèi)表面微生物取樣：
[0057] 在無菌室內(nèi)，將步驟1)中的每個樣品瓶分別進(jìn)行以下操作：將10個 2. 0cmX2. 5cm滅菌濾紙片緊貼樣品瓶內(nèi)表面（每個樣品瓶貼10個，即總面積50cm2)，經(jīng) lmin，按序取下濾紙片置入50mL0. 85%無菌生理鹽水試管中，用手充分振蕩并混勻后，即得 樣本液；
[0058] 3)、樣本液中微生物培養(yǎng)和測定：將步驟2)中的10個樣本液進(jìn)行三種微生物培養(yǎng) 和測定，分別為：菌落總數(shù)的測定、大腸菌群的測定以及霉菌和酵母的測定，每個樣本液的 每種測定均得到一個平均值；
[0059] 4)、將步驟3)中得到的每個平均值乘以其所對應(yīng)的步驟2)中的樣本液原始體積 (單位為mL)的數(shù)值后，除以樣品容器的內(nèi)表面積的數(shù)值（單位為cm 2)，所得數(shù)值填入表2 的"檢出值"欄中，并求算表2中每行"檢出值"的平均值，檢測結(jié)果見表2。
[0060] 對比實(shí)施例2膜過濾法
[0061] 膜過濾法的實(shí)驗(yàn)步驟：
[0062] 1)、樣品瓶預(yù)處理：將10個帶有外包裝的樣品瓶整包取，并除去第一層外包裝（僅 一層外包裝的不用除去外包裝且用75%酒精消毒外包），再進(jìn)入到無菌室檢測（這樣可以 避免外包裝上面的異物污染無菌室），進(jìn)入無菌室后，除去樣品瓶的所有外包裝；
[0063] 2)、樣品內(nèi)表面微生物取樣：
[0064] 在無菌室內(nèi)，將步驟1)中的每個樣品瓶分別進(jìn)行以下操作：將樣品瓶中傾注體積 為500mL的0. 85%無菌生理鹽水，用無菌蓋將樣品瓶的口封住，用手振蕩樣品瓶，使樣品瓶 內(nèi)水溶液充分涮洗到樣品瓶所有內(nèi)表面，并充分混勻；打開抽濾真空泵，用火焰將膜過濾裝 置的抽濾口滅菌，并用0. 85 %無菌生理鹽水冷卻；將孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜平整地覆 蓋滿抽濾口，將樣本液倒入抽濾口，使樣本液全部通過微孔濾膜；用無菌鑷子將微孔濾膜取 下，即為固體樣本取樣完成；
[0065] 3)、樣本液中微生物培養(yǎng)和測定：將步驟2)中的10個固體樣本進(jìn)行三種微生物培 養(yǎng)和測定，分別為：菌落總數(shù)的測定、大腸菌群的測定以及霉菌和酵母的測定，每個樣本液 的每種測定均得到一個平均值；
[0066] 4)、將步驟3)中得到的每個平均值除以樣品容器的內(nèi)表面積的數(shù)值（單位為 cm2)，所得數(shù)值填入表3的"檢出值"欄中，并求算表3中每行"檢出值"的平均值，檢測結(jié)果 見表3。
[0067] 對比實(shí)施例3膜過濾法
[0068] 膜過濾法的實(shí)驗(yàn)步驟：
[0069] 1)、樣品瓶預(yù)處理：將10個帶有外包裝的樣品瓶整包取，并除去第一層外包裝（僅 一層外包裝的不用除去外包裝且用75%酒精消毒外包），再進(jìn)入到無菌室檢測（這樣可以 避免外包裝上面的異物污染無菌室），進(jìn)入無菌室后，除去樣品瓶的所有外包裝；然后將未 經(jīng)過殺菌處理的生鮮牛奶倒入樣品瓶中，振蕩使牛奶充分接觸到樣品瓶所有內(nèi)表面，以此 來對樣品瓶進(jìn)行人為污染，達(dá)到模擬潔凈度不高的惡劣環(huán)境下的樣品瓶的目的；然后將這 些牛奶從樣品瓶中倒出；
[0070] 2)、樣品內(nèi)表面微生物取樣：
[0071] 在無菌室內(nèi)，將步驟1)中的每個樣品瓶分別進(jìn)行以下操作：將樣品瓶中傾注體積 為500mL的0. 85%無菌生理鹽水，用無菌蓋將樣品瓶的口封住，用手振蕩樣品瓶，使樣品瓶 內(nèi)水溶液充分涮洗到樣品瓶所有內(nèi)表面，并充分混勻；打開抽濾真空泵，用火焰將膜過濾裝 置的抽濾口滅菌，并用0. 85 %無菌生理鹽水冷卻；將孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜平整地覆 蓋滿抽濾口，將樣本液倒入抽濾口，使樣本液全部通過微孔濾膜；用無菌鑷子將微孔濾膜取 下，即為固體樣本取樣完成；
[0072] 3)、樣本液中微生物培養(yǎng)和測定：將步驟2)中的10個固體樣本進(jìn)行三種微生物培 養(yǎng)和測定，分別為：菌落總數(shù)的測定、大腸菌群的測定以及霉菌和酵母的測定，每個樣本液 的每種測定均得到一個平均值；
[0073] 4)、將步驟3)中得到的每個平均值除以樣品容器的內(nèi)表面積的數(shù)值（單位為 cm2)，所得數(shù)值填入表3的"檢出值"欄中，并求算表3中每行"檢出值"的平均值，檢測結(jié)果 見表3。
[0074] 效果實(shí)施例1
[0075] 按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行樣品瓶內(nèi)表面微生物取樣和檢測的結(jié)果見表1。按照對 比實(shí)施例1的方法進(jìn)行樣品瓶內(nèi)表面微生物取樣和檢測的結(jié)果見表2。按照對比實(shí)施例2 的方法進(jìn)行樣品瓶內(nèi)表面微生物取樣和檢測的結(jié)果見表3。
[0076] 表1、按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行樣品瓶內(nèi)表面微生物取樣和檢測的結(jié)果
[0077]

【權(quán)利要求】
1. 一種中空容器內(nèi)表面微生物的取樣方法，其特征在于，包括如下步驟：在無菌環(huán)境 下，將無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液置于所測容器中，所述的無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖 液的體積為所測容器額定容量的30%?35% ;用無菌蓋將所測容器的口封住，振蕩所測容 器，使所測容器內(nèi)水溶液充分涮洗到容器所有內(nèi)表面，并充分混勻，振蕩后所得溶液即為取 樣的樣本液；所述的中空容器的口徑面積為小于或等于100平方厘米。
2. 如權(quán)利要求1所述的取樣方法，其特征在于，所述的振蕩的方法為人工振蕩和機(jī)械 振蕩； 和/或，所述的中空容器的口徑面積為小于或等于90平方厘米； 和/或，所述的中空容器的材質(zhì)為塑料、玻璃、金屬或陶瓷； 和/或，所述的取樣方法在進(jìn)行前進(jìn)行以下預(yù)處理：當(dāng)所述的所測容器的外包裝有二 層以上時，在進(jìn)入所述的無菌環(huán)境之前，除去第一層外包裝；當(dāng)所述的所測容器的外包裝僅 為一層時，先用75%酒精消毒這層外包裝，然后在進(jìn)入所述的無菌環(huán)境之前，除去這層外包 裝。
3. 如權(quán)利要求2所述的取樣方法，其特征在于，所述的機(jī)械振蕩為用搖床振蕩； 和/或，所述的中空容器的口徑面積為小于或等于50平方厘米； 和/或，所述的中空容器的材質(zhì)為塑料或玻璃。
4. 如權(quán)利要求3所述的取樣方法，其特征在于，所述的中空容器的口徑面積為小于或 等于20平方厘米； 和/或，所述的塑料為聚乙烯、聚丙烯或聚對苯二甲酸乙二醇酯。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的取樣方法，其特征在于，所述的無菌生理鹽水為 0. 85%的無菌氯化鈉水溶液，百分比為氯化鈉質(zhì)量相對于水溶液中水的質(zhì)量的質(zhì)量百分 比。
6. 如權(quán)利要求5所述的取樣方法，其特征在于，所述的無菌生理鹽水的配制方法的步 驟為：稱量8. 5g氯化鈉和1000mL蒸餾水，然后將兩者混合溶解后于121°C高壓滅菌15min。
7. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的取樣方法，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液為 6. 8%的磷酸二氫鉀水溶液，且pH值為7. 2,百分比為磷酸二氫鉀質(zhì)量相對于水溶液中水的 質(zhì)量的質(zhì)量百分比。
8. 如權(quán)利要求7所述的取樣方法，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液的配制方法的步 驟為：稱量34. 0g磷酸二氫鉀和500mL蒸餾水，將兩者混合溶解后，用大約175mL的lmol/L 氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2,用蒸餾水稀釋至1000mL后，取其中1. 25mL，用蒸餾水稀釋 至 1000mL，121°C 高壓滅菌 15min。
9. 一種中空容器內(nèi)表面微生物的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 、按照如權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的中空容器內(nèi)表面微生物取樣方法進(jìn)行取 樣，得樣本液； (2) 、用無菌吸管吸取步驟（1)中混勻的樣本液中的一部分或全部，放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行 微生物培養(yǎng)，然后測定培養(yǎng)后的液體中微生物含量。
10. 如權(quán)利要求9中所述的檢測方法，其特征在于，所述的微生物培養(yǎng)的方法按照 《GB4789. 2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》、《GB4789. 3-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中的第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法或 《GB4789. 15-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行培養(yǎng)； 和/或，所述的測定的方法按照《GB4789. 2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》、《GB4789. 3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中的 第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法或《GB4789. 15-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉 菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行測定； 和/或，所述的一部分的體積量為lmL。
【文檔編號】C12Q1/04GK104059962SQ201410336455
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】張薇蓉, 高圣君, 劉向紅 申請人:光明乳業(yè)股份有限公司