水稻斑馬葉突變基因zebra15及其編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻斑馬葉突變基因ZEBRA15及其編碼的蛋白和應(yīng)用，水稻斑馬葉突變基因ZEBRA15的核苷酸序列如SEQ?ID?No.12所示，氨基酸序列如SEQ?ID?No.13所示，與野生型相比水稻斑馬葉突變基因ZEBRA15在第3個外顯子上第64堿基由G轉(zhuǎn)換為A，并導(dǎo)致第22位的編碼氨基酸由甘氨酸變異為天冬氨酸，該基因突變后的水稻zebra15突變體在苗期至分蘗期間，當(dāng)出現(xiàn)氣溫在短時期內(nèi)驟降驟升時，植株的葉片表現(xiàn)是斑馬葉性狀，通過雜交發(fā)現(xiàn)該性狀為隱性性狀，因此能夠利用此性狀選育新品種和種子純度鑒定，對水稻的遺傳育種具有重要意義。
【專利說明】水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15及其編碼的蛋白和應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,還涉及該基因 編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（Orvza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有近半數(shù)的人 口以稻米為主食。雜交水稻的種植，顯著提高了水稻的產(chǎn)量，從以前的每畝200-300斤，到 現(xiàn)在的每畝800斤，與第二次綠色革命一起差不多解決了全球的糧食危機，為保障國家乃 至世界糧食安全作出了巨大貢獻。然而種子純度是制約雜交稻發(fā)揮更大作用的重要制約因 子。近年來因雜交水稻種子不純而給農(nóng)民造成的損失越來越嚴重。這一問題已引起政府、 專家的高度重視。兩系法雜交水稻的種子生產(chǎn)，近幾年均出現(xiàn)過重大損失。1999年湖南曾 因遭遇低溫造成2萬畝制種大部分失敗，損失超過千萬元。2002年長江流域8月份的低溫， 又嚴重損害了兩系雜交稻種子生產(chǎn)。但是鑒定雜種種子純度一直沒有理想的技術(shù)方法已成 為我國種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因素。利用苗期標記性狀進行作物雜種一代新品種選育和種子 純度鑒定，能在苗期通過觀察標記性狀的存在或消失與否來識別真假雜種，從而達到能及 早識別剔除雜種或非雜種株、實現(xiàn)親本和雜交種種子純度雙重排雜、加強種子質(zhì)量監(jiān)督、大 大降低種子鑒定費用、保證田間品種純度、增產(chǎn)節(jié)支等目的。該項技術(shù)直觀準確，簡便快速， 具有一般的異地種植鑒定和DNA分子標記鑒定技術(shù)無法比擬的優(yōu)越性。近年來在作物育種 及種子純度鑒定上的研究應(yīng)用也越來越受到重視。前人已做了大量的工作，也取得了可喜 的成績，成功選育了一些帶標記的不育系，如紫葉標記不育系紫S、白化轉(zhuǎn)綠型葉色標記不 育系玉兔S和NHR111SA。但由于多數(shù)苗期標記性狀單系本身性狀不優(yōu)良、常導(dǎo)致其它重要 農(nóng)藝性狀顯著降低，利用時都需要進行一個雜交轉(zhuǎn)育過程以克服不良性狀的遺傳累贅，實 現(xiàn)優(yōu)異性狀的聚合，這個過程往往非常困難，都要通過大量長期的轉(zhuǎn)育才能實現(xiàn)。因而，發(fā) 現(xiàn)一些穩(wěn)定遺傳、葉色變異對其它性狀尤其產(chǎn)量、品質(zhì)性狀沒有顯著影響的葉色突變非常 重要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,該基因為苗 期標記性狀，并且對其他主要農(nóng)藝性狀無顯著影響，為水稻轉(zhuǎn)基因研究提供有力的工具，促 進雜交稻育種研究；本發(fā)明的目的之二在于提供水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15編碼的蛋白 質(zhì)；本發(fā)明的目的之三在于提供水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15的應(yīng)用。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用甲基磺酸乙酯（EMS)誘變自育優(yōu)良恢復(fù)系縉恢10 號獲得一個遺傳穩(wěn)定的水稻"斑馬葉"突變體，在遺傳分析和基因定位的基礎(chǔ)上，先通過 基因預(yù)測、同源搜索及基因序列差異比較，初步確定了水稻斑馬葉突變性狀為ZEBRA15隱 形基因控制，ZEBRA15為類受體蛋白激酶（0s05gl2680)。隨后，本發(fā)明以水稻斑馬葉突變 體zebral5為材料，克隆了水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,具有如SEQ ID No. 12所示的核 苷酸序列，開放閱讀框為2028bp，由8個外顯子組成，編碼675個氨基酸，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 13所示。與野生型縉恢10號相比，突變基因 ZEBRA15在第3個外顯子上第64 堿基有G-A的轉(zhuǎn)換，并導(dǎo)致第22位的編碼氨基酸序列發(fā)生甘氨酸（Glycine)到天冬氨酸 (L-Aspartic-acid)的變異，突變位點位于催化域PKc。植物類受體蛋白激酶（RLK)是植物 體內(nèi)信號分子的重要受體，已被證明參與植物生長發(fā)育及對環(huán)境刺激應(yīng)答反應(yīng)等多種信號 的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在植物生命活動中發(fā)揮著多種重要的生物學(xué)功能。當(dāng)植物受到脅迫時，RLK能 識別和接受生物或非生物刺激的信號物，通過可逆磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，誘導(dǎo)防御反應(yīng)。
[0005] 然后，然后構(gòu)建功能互補載體并轉(zhuǎn)化zebral5突變體（G95)。經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植 株葉片變綠，完全恢復(fù)為野生型葉型。進一步確定水稻斑馬葉性狀由ZEBRA15基因突變引 起，因此水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15能夠用于在水稻斑馬葉性狀的分子育種。
[0006] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,該基因為 苗期標記性狀，對其他主要農(nóng)藝性狀無顯著影響，為水稻遺傳育種研究提供了有力的工具， 為選育純種不育系奠定基礎(chǔ)。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0008] 圖1為水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15基因的遺傳和物理圖譜（A為ZEBRA15的初 定位區(qū)間在第5染色體長臂SSR標記RM3322和RM6082間；B為將ZEBRA15基因精細定位 在標記nSSR516與nSSR502間25kb的范圍內(nèi)；C為所在區(qū)域BAC克??；D為突變體ZEBRA15 的候選基因0sl0g40960. 1的結(jié)構(gòu)及突變位置）。
[0009] 圖2為水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定（其 中1泳道為PLAS5000DNA Marker，2泳道為野生型縉恢10號的RT-PCR產(chǎn)物，3泳道為突變 體 zebral5 的 RT-PCR 產(chǎn)物）。
[〇〇1〇] 圖3為水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15編碼蛋白類受體蛋白激酶的氨基酸序列結(jié)構(gòu) 域分析。
[0011] 圖4為ZEBRA15基因編碼蛋白的進化樹分析結(jié)果。
[0012] 圖5為互補重組載體構(gòu)建圖。
[0013] 圖6為ZEBRA15突變體互補表型分析，其中wt為野生型，zebral5為斑馬葉突變 體，c-zebral5為斑馬葉突變體zebral5轉(zhuǎn)野生型ZEBRA15基因陽性植株。 【具體實施方式】
[0014] 以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0015] 本發(fā)明實施例中使用的材料：野生型水稻材料縉恢10號（wt)和斑馬葉突變體 (zebral5)，均由本實驗室培育；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA聚合 酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體、Trizol試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì) 粒提取試劑盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DL5,000DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；DNA Marker III購自天根生化科技（北京）有限公司；氨節(jié)青霉素（Ampicillin，Amp)和卡拉 霉素（Kanamycin，Kan)為Sigma公司產(chǎn)品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術(shù)有 限公司完成；其它化學(xué)試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大腸桿菌DH5 α、農(nóng)桿菌 LBA4404由本實驗室保存。
[0016] 實施例1、水稻斑馬葉突變體zebral5的獲得和形態(tài)學(xué)觀察 [〇〇17] 利用甲基磺酸乙酯（EMS)誘變自育優(yōu)良恢復(fù)縉恢10號獲得一個遺傳穩(wěn)定的水稻 "斑馬葉"突變體，命名為zebral5。水稻"斑馬葉"突變體zebral5,在苗期至分蘗期間，當(dāng) 出現(xiàn)氣溫在短時期內(nèi)驟降驟升時（即V型變化），植株的葉片即會出現(xiàn)有規(guī)律的垂直于葉脈 的淡黃色（嚴重時為白色）與綠色相間的斑馬紋，葉鞘部分表現(xiàn)為正常綠色。待溫度穩(wěn)定回 升一段時間后，該表型即會緩慢恢復(fù)為正常綠色。當(dāng)溫度反復(fù)出現(xiàn)這種V型變化時，"斑馬 紋"突變表型會反復(fù)出現(xiàn)。表明突變體 zebral5可能主要響應(yīng)極端溫、光變化，進而影響光 保護系統(tǒng)而形成斑馬葉。該性狀經(jīng)過多代觀察，表現(xiàn)穩(wěn)定遺傳，并且其他主要農(nóng)藝性狀（如 產(chǎn)量、品質(zhì)性狀）沒有顯著降低。
[0018] 實施例2、突變zebral5基因遺傳分析與定位
[0019] 以zebra-15突變體為父本，秈稻品種西農(nóng)lA(XinonglA)為母本雜交獲得Fi代植 株葉片全部表現(xiàn)為正常綠色，然后通過自交獲得4350株F 2代群體中，依據(jù)斑馬葉性狀分離 出了突變?nèi)~片和正常葉片兩種表型，分離出1054株突變單株，其余為正常株，可以看出正 常株與突變株符合3 :1的分離比例，表明該突變性狀由一對隱性單基因控制。
[0020] 初步定位：選取均勻分布于水稻12條染色體上的480對SSR引物，在親本 zebra-15和西農(nóng)1A間檢測多態(tài)性，其中有98對SSR引物顯示多態(tài)性。用這98對引物在正常 和突變基因池中進行基因連鎖分析，篩選與基因 Zebra-15連鎖的SSR標記，發(fā)現(xiàn)Zebra-15 與第5染色體短臂上標記RM3322和RM6082連鎖。用連鎖標記RM3322和RM6082分析150 株隱性突變單株，結(jié)果顯示，基因 Zebra-15與標記RM3322和RM6082之間的遺傳距離分別 為 19. 6cM 和 6. OcM (圖 1A)。
[0021] 精細定位：根據(jù)已公布的秈稻品種93-11序列，在標記RM3322和RM6082間進一步 篩選和開發(fā)了 36對SSR引物，其中有4對在親本間表現(xiàn)多態(tài)性（表1)。用這4對引物分析所 有1054株突變單株，結(jié)果表明：標記nSSR511、nSSR516、nSSR502和RM169與基因 Zebra-15 之間的遺傳距離分別為8. 6cM、0. lcM、l. OcM和1. OcM(圖1B)。最終Zebra-15被定位在標 記nSSR516和nSSR502之間約258kb (此為93-11序列上的長度，日本晴上為288kb)的范 圍內(nèi)，此區(qū)間包括三個BAC克?。篈C108498、AC137001和AC146716(圖1C)。
[0022] 表1、4對具有多態(tài)性的SSR標記序列
[0023]
【權(quán)利要求】
1. 水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示。
2. 權(quán)利要求1所述水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于：氨基酸 序列如SEQ ID No. 13所示。
3. 權(quán)利要求1所述水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15在水稻斑馬葉性狀的分子育種中的應(yīng) 用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述水稻為縉恢10號。
【文檔編號】C12N15/82GK104087603SQ201410319603
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】趙芳明, 何光華, 施軍瓊, 王秋實, 桑賢春, 凌英華, 李云峰, 王楠, 楊正林 申請人:西南大學(xué)