一種石蠟包埋組織切片基因組dna提取試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒及其使用方法，包括脫蠟劑，二甲苯0.9~1.1份；脫蠟清洗劑，由95%乙醇1.8~2.2體積份，和75%乙醇0.9-1.1體積份組成；消化液0.28-0.32體積份，所述消化液由SDS、Tris-HCl、EDTA及蛋白酶K與水配制，消化液中各組分濃度分別為，SDS0.9-1.1%，Tris-HCl9~11mM、EDTA0.9-1.1mM，蛋白酶K90-110μg/ml；蛋白沉淀劑，所述蛋白沉淀劑為4MNH4AC溶液DNA沉淀劑，所述DNA沉淀劑為獨立包裝的3M醋酸鈉溶液、無水乙醇、70%乙醇。
【專利說明】—種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種核酸提取方法，具體上的涉及一種脫氧核糖核酸(DNA)的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]福爾馬林固定石臘包埋組織(formalinfixed and paraffin embedded tissues,FFPE，以下簡稱FFPE)切片是醫(yī)療機構(gòu)最常用的保存病理組織的方法。醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學(xué)研究的材料來源。由于新鮮標本難以得到，對已有病例進行回顧性研究時，只能從石蠟包埋組織中進行DNA提取，因此石蠟包埋組織就成為來源最豐富的珍貴資源。從FFPE樣品中分離出高純度高質(zhì)量的DNA是下游試驗順利進行的最基本前提。文獻中報道的提取方法主要有酚氯仿抽提法等，但該方法需使用有毒試劑，如苯酚、氯仿等，不利于實驗人員的身體健康，在酚氯法中，苯酚對皮膚有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)；而氯仿易揮發(fā)，能分解出有毒氣體，作用中樞神經(jīng)系統(tǒng)。吸入后對心、腎、肝有損害。異戊醇:吸入或經(jīng)皮膚吸收有麻醉作用，對皮膚和呼吸道有刺激，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，且采用酚氯法對石蠟包埋組織切片中的基因組DNA進行提取時，操作比較繁瑣而且耗時(進行蛋白質(zhì)消化孵育時需水浴3h以上至過夜)。因此迫切需要無毒且操作步驟簡單，提取時間段的提取試劑盒及提取方法。
[0003]有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種DNA提取試劑盒，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒及其使用方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒，其特征是所述試劑盒包括:
脫蠟劑，二甲苯0.9~1.1份；
脫蠟清洗劑，由95%乙醇1.8^2.2體積份，和75%乙醇0.9-1.1體積份組成；
消化液0.28-0.32體積份，所述消化液由SDS、Tris-HCl, EDTA及蛋白酶K與水配制，消化液中各組分濃度分別為，SDS 0.9-1.1%，Tris-HCl 9~I ImM、EDTA 0.9_1.1mM，蛋白酶K 90-110 μ g/ml ；
蛋白沉淀劑，所述蛋白沉淀劑為4M NH4AC溶液
DNA沉淀劑，所述DNA沉淀劑為獨立包裝的3M醋酸鈉溶液、無水乙醇、70%乙醇。
[0006]所述石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒，其特征是優(yōu)選:
所述脫蠟劑為二甲苯1份；
所述脫蠟清洗劑為95%乙醇2體積份，和75%乙醇I體積份；所述消化液為0.3體積份，所述消化液中各組分濃度分別為，SDS 1%，Tris-HCl1mM, EDTA ImM，蛋白酶 K 100 μ g/ml。
[0007]—種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取方法，其特征是采用所述的石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒，
步驟如下:
1)脫蠟:包埋組織切片刮下置于離心管中，加脫蠟劑渦旋混勻，53~56度孵育iTllmin，11000~13000印111離心4~6111；[11,棄上清；
2)清洗:向步驟I)離心管中的加入脫蠟清洗劑中的一半體積的95%乙醇，混勻室溫放置9-1 lmin, 11000~13000rpm離心4~6min,棄掉上清,再分別用另一半體積的95%乙醇和脫蠟清洗劑中的75%乙醇洗脫，棄掉上清，在36~38°C晾干沉淀；
3)消化:向步驟2)得到的沉淀中加所述消化液，于搖床55~57度，180r/min震蕩孵育 0.9~1.1h ；
4)蛋白沉淀:將步驟3)樣品在冰上冷卻，然后加入作為蛋白沉淀劑的4MNH4AC,并充分混勻，11000~13000rpm離心4~6min 5)DNA沉淀:取步驟4)上清液加入DNA沉淀劑中的3M醋酸鈉溶液至醋酸鈉終濃度為
0.3M，，加入2倍體積-20°C預(yù)冷的DNA沉淀劑中的無水乙醇，4°C 13000rpm離心5min。棄上清，加入-200C預(yù)冷的DNA沉淀劑中的70%乙醇洗滌沉淀，4°C 13000rpm離心5min，棄上清，得到DNA。
[0008]6) DNA洗脫:將步驟5)得到的DNA室溫干燥15min，用洗脫緩沖液溶解DNA，放在-20°C或_80°C長期保存。
[0009]本發(fā)明中所述95%乙醇、75%乙醇，70%乙醇中的百分比含量均為體積百分含量。
[0010]本發(fā)明還提供了一種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒，優(yōu)化了脫蠟劑及脫蠟清洗劑的配方以及脫蠟步驟的工藝，能夠代替現(xiàn)有的酚氯仿法提取DNA，與酚氯仿法相t匕，本發(fā)明提供的試劑盒避免了毒性較大的苯酚、氯仿等試劑的使用，減少了對實驗操作者健康的威脅和對環(huán)境的污染，且提供的消化液中優(yōu)選了配方，在采用較低濃度的蛋白酶K情況下即可實現(xiàn)良好消化效果，節(jié)約了蛋白酶K等昂貴試劑的使用。此外，本發(fā)明還提供了一種采用所述試劑盒進行石蠟包埋組織切片基因組DNA提取的方法，優(yōu)化了采用消化液進行消化時的孵育方法，經(jīng)過本發(fā)明提供脫蠟劑及脫蠟清洗劑處理過的試樣，在采用消化液進行消化時，可以采用搖床震蕩孵育的方法，較傳統(tǒng)的孵育方法(水浴3h以上至過夜)節(jié)省了時間，提高了工作的效率，震蕩孵育時僅需要Ih即可消化完全，而采用本發(fā)明提供試劑盒及其使用方法在避免了使用高毒性有機溶劑，減少了昂貴的蛋白酶K用量，且能夠采用震蕩孵育大幅度節(jié)省操作時間的情況下，提取得到的DNA達到了與酚氯仿法同樣質(zhì)量，能夠用于PCR擴增及后續(xù)的分析等用途。

【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0012]實施例1石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒的組配脫蠟劑，二甲苯1.0mL;脫蠟清洗劑，由95%乙醇2.0mL, 75%乙醇1.0mL組成；
消化液300 μ L，由SDS、Tris-HCl, EDTA及蛋白酶K與水配制，消化液中各組分濃度分別為，SDS 1% (m/v), Tris-HCl 1mM, EDTA 1.0mM，蛋白酶 K 100yg/mL。
[0013]蛋白沉淀劑，4M NH4AC溶液
DNA沉淀劑，獨立包裝的3M醋酸鈉溶液、無水乙醇、70%乙醇。
[0014]實施例2 —種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取方法，采用實施例1中提供的試劑盒
樣品類型:石臘切片一.實驗步驟
1.脫蠟:包埋組織切片刮下置于1.5ml離心管中，加脫蠟劑(1.0ml 二甲苯)渦旋混勻，55度孵育lOmin, 12000rpm離心5min,棄上清。
[0015]2.洗掉二甲苯:加脫蠟清洗劑中的一半體積的95%乙醇(1.0ml95%乙醇)混勻室溫放置lOmin, 12000rpm離心5min,棄掉上清,再分別用另一半體積的95%乙醇(1.0mL)和脫蠟清洗劑中的75%乙醇(1.0mL)洗脫，棄掉上清。在37度晾干沉淀。
[0016]3.消化:加消化液(300 μ L)于搖床56度，180r/min震蕩孵育lh。
[0017]4.蛋白沉淀:將樣品在冰上冷卻，然后加入200ul作為蛋白沉淀劑的4M NH4AC,并充分混勻，12000rpm離心5min
5.DNA沉淀:取上清液加入DNA沉淀劑中的3M醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)至醋酸鈉終濃度為
0.3M，加入2倍體積的DNA沉淀劑中的無水乙醇(_20°C預(yù)冷)，4°C 13000rpm離心5min。棄上清，加入1ml DNA沉淀劑中的70%乙醇(_20°C預(yù)冷)洗滌沉淀，4°C 13000rpm離心5min，得到DNA。
[0018]6.DNA洗脫:將步驟5得到的DNA室溫干燥15min，用洗脫緩沖液溶解DNA，放在-20°C或_80°C長期保存。
[0019]二.實驗結(jié)果
1.DNA純度=260/280比值在1.8左右。
[0020]2.后續(xù)實驗:提取出的DNA進行一些PCR擴增實驗，選了 EGFR和KRAS兩個基因做參考，與采用酚氯仿法得到的DNA相比，用于PCR擴增的效果基本相當(dāng)，能夠滿足后續(xù)分析的要求。
[0021]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取試劑盒，其特征是所述試劑盒包括: 脫蠟劑，二甲苯0.9~1.1份； 脫蠟清洗劑，由95%乙醇1.8^2.2體積份，和75%乙醇0.9-1.1體積份組成， 消化液0.28-0.32體積份，所述消化液由SDS、Tris-HCl, EDTA及蛋白酶K與水配制，消化液中各組分濃度分別為，SDS 0.9-1.1%，Tris-HCl 9~llmM、EDTA 0.9_1.1mM，蛋白酶K 90^110 μ g/ml ； 蛋白沉淀劑，所述蛋白沉淀劑為4M NH4AC溶液 DNA沉淀劑，所述DNA沉淀劑為獨立包裝的3M醋酸鈉溶液、無水乙醇、70%乙醇。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是: 所述脫蠟劑為二甲苯1份； 所述脫蠟清洗劑為95%乙醇2體積份，和75%乙醇I體積份； 所述消化液為0.3體積份，所述消化液中各組分濃度分別為，SDS 1%，Tris-HCl1mM, EDTA ImM，蛋白酶 K 100μg/ml。
3.一種石蠟包埋組織切片基因組DNA提取方法，其特征是采用如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒， 步驟如下: 1)脫蠟:包埋組織切片刮下置于離心管中，加脫蠟劑渦旋混勻，53~56度孵育iTllmin，11000~13000印111離心4~6min,棄上清； 2)清洗:向步驟I)離心管中的加入脫蠟清洗劑中的一半體積的95%乙醇，混勻室溫放置9-1 lmin, 11000~13000rpm離心4~6min,棄掉上清,再分別用另一半體積的95%乙醇和脫蠟清洗劑中的75%乙醇洗脫，棄掉上清，在36~38°C晾干沉淀； 3)消化:向步驟2)得到的沉淀中加所述消化液，于搖床55~57度，180r/min震蕩孵育 0.9~1.1h ； 4)蛋白沉淀:將步驟3)樣品在冰上冷卻，然后加入作為蛋白沉淀劑的4MNH4AC,并充分混勻，11000~13000rpm離心4~6min ； 5)DNA沉淀:取步驟4)上清液加入DNA沉淀劑中的3M醋酸鈉溶液至醋酸鈉終濃度.0.3M，，加入2倍體積_20°C預(yù)冷的無水乙醇，4°C 13000rpm離心5min;棄上清，加入-20°C預(yù)冷的Iml 70%乙醇洗漆沉淀，4°C 13000rpm離心5min,棄上清,得到DNA ； 6)DNA洗脫:將步驟5)得到的DNA室溫干燥15min，用洗脫緩沖液溶解DNA，放在_20°C或-80°C長期保存。
【文檔編號】C12N15/10GK104164418SQ201410292019
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】張丹丹, 葉樺, 陸慶宇, 閻賀, 張廣春 申請人:北京圣谷同創(chuàng)科技發(fā)展有限公司