H9和n2亞型禽流感病毒二重rt-pcr檢測(cè)試劑盒及其引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有兩對(duì)特異性引物。實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)檢測(cè)H9亞型禽流感病毒和N2亞型禽流感病毒，具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明用于檢測(cè)禽流感病毒是否為H9亞型和/或N2亞型，可節(jié)省確定病毒HA和NA亞型的時(shí)間和成本。
【專利說(shuō)明】H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其引物組
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其引物組。
【背景技術(shù)】
[0002]禽流感病毒(Avian Influenza virus, AIV)屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒屬，A型流感病毒,能夠引起禽類的感染和疾病。其中,H9亞型禽流感雖然屬于低致病性禽流感，但可造成蛋雞的產(chǎn)蛋量嚴(yán)重下降，肉雞和青年雞的復(fù)合型呼吸道疾病和死淘率升高，給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該亞型流感病毒一直在我國(guó)的一些主要養(yǎng)禽地區(qū)傳播和流行并形成地方流行性疾病，其發(fā)病率占總禽流感發(fā)病率的90%以上，成為影響我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要AIV亞型。不僅如此，H9亞型AIV還可以感染人、豬等哺乳動(dòng)物，具有重要的公共衛(wèi)生意義。N2亞型是能導(dǎo)致禽類感染AIV的常見NA亞型，在中國(guó)主要是H9N2亞型。
[0003]當(dāng)前對(duì)于H9N2亞型AIV的診斷，仍然主要是利用傳統(tǒng)的病原學(xué)分離鑒定與血清學(xué)試驗(yàn)，但是這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)和敏感性差等局限性，并且不能同時(shí)檢測(cè)出H9亞型及N2亞型AIV。二重及多重RT-PCR可同時(shí)檢測(cè)不同病原體(或不同亞型病原體)，實(shí)現(xiàn)了高效率、低時(shí)耗，在臨床上具有較高的應(yīng)用價(jià)值，而且由于其具有特異性好及敏感性高的優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其引物組，以便于快速高效的檢測(cè)禽流感病毒是否為H9亞型和/或N2亞型。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組，包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物I和2 (檢測(cè)H9)、引物3和4 (檢測(cè)N2)，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列。
[0006]引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1:1: 0.6-1: 0.6-1。
[0007]引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1:1: 0.6: 0.6。
[0008]上述H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)弓丨物組在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，PCR擴(kuò)增的退火溫度為54.(TC -60.(TC。
[0009]PCR擴(kuò)增的退火溫度為57°C。
[0010]H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括引物組、PCR緩沖液和水；
[0011]引物組包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列，其濃度均為25 μ mol/L，在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為 0.1 μ mol/L-0.5 μ mol/L、0.1 μ mol/L-0.5 μ mol/L ；[0012]PCR 緩沖液為 2 X Taq PCR Mix。
[0013]引物I和2、引物3和4在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.5 μ mol/L、0.3 μ mol/L0
[0014]上述H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，PCR擴(kuò)增的退火溫度為54.(TC -60.(TC。
[0015]PCR擴(kuò)增的退火溫度為57°C。
[0016]針對(duì)目前缺乏對(duì)H9亞型禽流感病毒和N2亞型禽流感病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和診斷的有效可靠的技術(shù)，發(fā)明人研究設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，據(jù)此建立了 H9和N2亞型禽流感病毒的二重RT-PCR檢測(cè)方法，并制備了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)檢測(cè)H9亞型禽流感病毒和N2亞型禽流感病毒，具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明用于檢測(cè)禽流感病毒是否為H9亞型和/或N2亞型，可節(jié)省確定病毒HA和NA亞型的時(shí)間和成本。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是二重RT-PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中:M.標(biāo)準(zhǔn)DLlOOOMarker ；1.H9N2 亞型 AIV cDNA ；2.HlNl 亞型 AIV cDNA ；3.H1N2 亞型 AIV cDNA ；4.H3N2 亞型 AIV cDNA ；5.H3N6 亞型 AIV cDNA ；6.H3N8 亞型 AIV cDNA ；7.H4N2 亞型 AIV cDNA ；8.H4N6 亞型 AIV cDNA ；9.H5N2 亞型 A IV cDNA ；10.H6N2 亞型 AIV cDNA ；11.H6N6 亞型 AIV cDNA ；12.H7N2 亞型 AIVcDNA；13.新城疫病毒cDNA;14.雞傳染性支氣管炎病毒cDNA ; 15.雞傳染性喉氣管炎病毒cDNA ；16.雞霉形體DNA ；17.禽呼腸孤病毒cDNA ；18.陰性對(duì)照。
[0018]圖2是二重RT-PCR檢測(cè)不同H9N2毒株的擴(kuò)增效果，圖中:Μ.標(biāo)準(zhǔn)DLlOOOMarker，1-20.20 株 H9N2AIVs。
[0019]圖3是二重RT-PCR的靈敏性試驗(yàn)電泳圖，圖中:M.標(biāo)準(zhǔn)DLlOOOMarker，1-8分別為 10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、lfg 的 H9N2 型 AIV cDNA，9.陰性對(duì)照。
[0020]圖4是應(yīng)用本發(fā)明二重RT-PCR的部分臨床樣品(編號(hào)1_20)檢測(cè)結(jié)果電泳圖，圖中:M.標(biāo)準(zhǔn) DLlOOOMarker ;1，7，9，20.N2 亞型 AIV 陽(yáng)性產(chǎn)物；11，14，16.H9N2 亞型 AIV 陽(yáng)性產(chǎn)物；2，3，4，5，6，8，10，12，13，15，17，18，19.陰性產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。具體所用材料和試劑如下:
[0022]Hl亞型禽流感病毒記載在“利用RT-LAMP可視化檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)Hl亞型禽流感病毒及N1、N2亞型的分型”，病毒學(xué)報(bào)，2013，29⑵:154-159，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0023]H3 亞型禽流感病毒記載在 “Visual detection of H3subtype avian influenzaviruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplificationassay” Virology Journal, 2011, 5 ;8:337,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0024]H4亞型禽流感病毒記載在“H4亞型家養(yǎng)水禽流感病毒分離株的表面膜蛋白基因的序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析”，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37 (12)，1334-1339，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0025]H5亞型禽流感病毒記載在“H5亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測(cè)技術(shù)的建立”，南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，02:323-327，H5亞型AIV RNA為美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)禽病診斷研
究室惠贈(zèng)；
[0026]H6亞型禽流感病毒記載在“H6亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立”，畜牧與獸醫(yī)，2012，44(11)，12-16，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0027]H7亞型禽流感病毒記載在“H5和H7亞型禽流感病毒多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)及鑒別方法的建立”，中國(guó)獸醫(yī)科技，2005, 35 (6)，437-440，H7亞型AIV RNA為美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)禽病診斷研究室惠贈(zèng)；
[0028]H9亞型禽流感病毒記載在“多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)鑒別H9亞型禽流感病毒方法的建立”，中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，(09):858-860，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0029]新城疫病毒記載在“禽流感和新城疫病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法的建立”，生物技術(shù)通訊，2008，19 (3) 410-413，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0030]傳染性支氣管炎病毒記載在“應(yīng)用多重反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)雞新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的研究”，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22(2)，126-130，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0031]傳染性喉氣管炎病毒記載在“傳染性喉氣管炎病毒疫苗的研究進(jìn)展”，中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2006，33 (2)，41-44，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得
[0032]雞毒霉形體記載在“用SDS-PAGE分析雞毒霉形體廣西分離株的結(jié)構(gòu)蛋白”，中國(guó)獸醫(yī)科技，2003，33 (2)，41-43，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0033]禽呼腸孤病毒記載在“禽呼腸孤病毒廣西分離株σ 3基因的克隆和表達(dá)”，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，27 (3)，167-170，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0034]DL1000DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑、pMD18T vector試劑盒均購(gòu)自大連寶生物公司；2 X Taq PCR Mix(ASlll_12)、DNA/RNA提取試劑盒，凝膠回收試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0035]實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)與合成
[0036]根據(jù)GenBank中H9亞型AIV的HA基因與N2亞型AIV的NA基因的保守序列，采用利用DNAStar軟件進(jìn)行多序列比對(duì),在保守區(qū)用primer5.0設(shè)計(jì)引物。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。(表1)。
[0037]表1引物信息
[0038]
【權(quán)利要求】
1.H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組，其特征在于包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1:1: 0.6-1: 0.6-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1:1: 0.6: 0.6。
4.權(quán)利要求2所述H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為54.(TC -60.(TC。
5.權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為57°C。
6.一種H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括引物組、PCR緩沖液和水； 所述引物組包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列，其濃度均為25 μ mol/L，在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為 0.1 μ mol/L-0.5 μ mol/L、0.1 μ mol/L-0.5 μ mol/L ； 所述PCR緩沖液為2 X Taq PCR Mix。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述引物I和2、引物3和4在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.5 μ mol/L、0.3 μ mol/L0
8.權(quán)利要求7所述H9和N2亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為54.(TC -60.(TC。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為57°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004859SQ201410274728
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】謝芝勛, 徐倩, 謝麗基, 鄧顯文, 謝志勤, 羅思思, 黃莉, 黃嬌玲, 曾婷婷 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所