一種桉樹焦枯病原菌的巢式pcr檢測(cè)試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桉樹焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法。本發(fā)明的試劑盒包括：(1)10×PCR?Buffer；(2)25mmol/L?Mg2+；(3)10mmol/L?dNTP；(4)引物：10mmol/L?BT-T1-S，10mmol/L?BT-CYLTUBIR-A，10mmol/L?BT-S-1，10mmol/L?BT-A-1；其中引物BT-T1-S的序列為5＇－AACATGCGTGAGATTGTAAGT－3＇，引物BT-CYLTUBIR-A的序列為5＇－AGTTGTCGGGACGGAAGAG－3＇，引物BT-S-1的序列為5＇－GGCTCCAAGAACTATGTGA－3＇，引物BT-A-1的序列為5＇－CCTAACCACGAATGTCAGT－3＇；(5)5U/μL?Tag聚合酶；(6)ddH2O。本發(fā)明能夠快速、準(zhǔn)確的對(duì)桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium?scoparium進(jìn)行分子鑒定和桉樹焦枯病的早期診斷，對(duì)控制桉樹焦枯病的檢疫及病害的防治具有意義重大。
【專利說明】—種桉樹焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種桉樹焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桉樹是世界著名的速生造林和用材林樹種，因其生長(zhǎng)快速、適生性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益明顯、材積材質(zhì)用途廣等特點(diǎn)而被世界各地的100多個(gè)國(guó)家廣泛引種種植。尤其在我國(guó)桉樹被大量引進(jìn)和推廣，桉樹種植區(qū)域日漸增加，橫跨淮河以南等十幾個(gè)省區(qū)，可見桉樹在我國(guó)林業(yè)經(jīng)濟(jì)建設(shè)中有著不可取代的地位。但是隨著桉樹種植密集度的增加,桉樹病害也隨之普及，尤其是以Cylindrocladium scoparium(桉樹焦枯病原菌)真菌引起的桉樹焦枯病危害居于首位。桉樹焦枯病主要危害1_4年生桉樹幼苗，以及成熟桉樹的葉片和枝梢,受到病原菌侵染的桉樹輕則出葉枯、枝枯或頂枯，大量落葉，使桉樹頂部形成掃帚狀，嚴(yán)重時(shí)整株枯死。感病初期，健康桉樹葉片出現(xiàn)針頭狀大小的水澤斑，病斑逐漸擴(kuò)大，組織壞死如被燒灼，邊緣有一赤褐色暈圈，多數(shù)病斑連結(jié)造成葉尖和葉緣干枯，病葉卷曲；感病后期病斑中部變灰褐色燙傷狀，多數(shù)病斑連接成大的枯死斑塊，直至全葉卷曲焦枯脫落；枝條染病，表皮層遍布近圓形或長(zhǎng)條形的小點(diǎn)，病部微縊縮，有縱裂縫，擴(kuò)大后若病斑環(huán)繞枝干，可造成枝干干枯死亡。此外,該病原菌寄主十分廣,主要有尾葉桉、巨桉、巨尾桉、赤桉、藍(lán)桉、大葉桉、檸檬桉、柳窿桉、窿緣桉、纖脈桉、雷林桉I號(hào)、雷林桉等幾十個(gè)重要的桉樹品種。除此之外，Cylindrocladium scoparium真菌還能侵害相思樹、丁香年、橡膠樹、番石槽、柑橘、南美番荔枝、杜鵑花、腰果樹和木薯等重要的園林經(jīng)濟(jì)和商品林樹種。因此，探求有效、快速的Cylindrocladium scoparium的檢測(cè)技術(shù)對(duì)桉樹焦枯病的防治具有重要的林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐意義。
[0003]目前，世界各國(guó)學(xué)者對(duì)桉樹焦枯病的研究主要集中在桉樹焦枯病病原菌的分類、生物學(xué)特性、生理生化指標(biāo)、病原菌孢子的形態(tài)特征、結(jié)構(gòu)、以及遺傳特性方面，對(duì)桉樹焦枯病原菌分子檢測(cè)的研究暫無報(bào)道。建立桉樹焦枯病原菌快速檢測(cè)體系對(duì)于有效檢測(cè)桉樹焦枯病的發(fā)生和防治迫在眉睫。
[0004]分子生物學(xué)診斷技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)取得巨大進(jìn)步的結(jié)晶，是在人們對(duì)基因的結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)和調(diào)控等生命本質(zhì)問題的認(rèn)識(shí)日益加深的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。近年來，分子生物學(xué)診斷技術(shù)的方法學(xué)研究取得了很大進(jìn)展，先后建立了限制性內(nèi)切酶酶譜分析、核酸分子雜交、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性連鎖分析等方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日漸成熟，PCR檢測(cè)技術(shù)也被越來越多的應(yīng)用到植物真菌、細(xì)菌、植原體、病毒、線蟲等多種病菌的鑒定和檢測(cè)中。然而常規(guī)的PCR檢測(cè)往往出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和假陽性的現(xiàn)象，以致于誤導(dǎo)人們對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的判定。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用兩對(duì)(而非一對(duì))PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物(因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異，很好的解決了常規(guī)PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)的問題。建立快速、靈敏的巢式PCR擴(kuò)增體系對(duì)于檢測(cè)桉樹焦枯病的林業(yè)診斷具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在檢測(cè)桉樹焦枯病原菌中存在的不足，提供了一種桉樹焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]—種桉樹焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒,其包括:
[0008](1) 10XPCR Buffer ；
[0009](2) 2Smmol /T, Mg2+ ；
[0010](3) IOmmo I/L dNTP ；
[0011](4)引物:10mmol/L BT-T1-S，10mmol/L BT-CYLTUBIR-A，10mmol/L BT-S-1，IOmmoI/L BT-A-1 ;其中引物 BT-T1-S 的序列為 5 ; — AACATGCGTGAGATTGTAAGT - 3 ;，引物BT-CYLTUBIR-A 的序列為 5 ' - AGTTGTCGGGACGGAAGAG - 3 ;，引物 BT-S-1 的序列為 5 '—GGCTCCAAGAACTATGTGA - 3 ;，引物 BT-A-1 的序列為 5 ; — CCTAACCACGAATGTCAGT - 3 ;；
[0012](5) 5U/μ L Tag 聚合酶；
[0013](6) ddH20。
[0014]所述的巢式PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其步驟如下:
[0015](1)提取純培養(yǎng)菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA ；
[0016](2)第一輪 PCR 反應(yīng)
[0017]第一輪PCR擴(kuò)增體系50 μ L:10XPCR Buffer 5.0 μ L，25mmol/L Mg2+ 3 μ L，IOmmol/L dNTP 1.5 μ L，IOmmoI/L BT-Tl-S 1.5 μ L，IOmmoI/L BT-CYLTUBIR-A 1.5 μ L，5U/ μ L Tag 聚合酶0.3 μ L，ddH20 33.2 μ L，加純菌或植物組織基因組DNA提取液4.0 μ L，組成反應(yīng)混合液；
[0018]第一輪PCR反應(yīng)條件為:94°C熱啟動(dòng)5min ;94°C變性45s，58°C退火45s，72°C延伸40s，循環(huán) 32 次；72°C延伸 8min ；
[0019](3)第二輪 PCR 反應(yīng)
[0020]第二輪PCR擴(kuò)增體系50 μ L:10XPCR Buffer 5.0 μ L，25mmol/L Mg2+ 3 μ L，IOmmol/L dNTP 1.5 μ L，IOmmoI/L BT-S-1 1.5 μ L，1OmmoI/L BT-A-1 1.5 μ L，5U/ μ L Tag 聚合酶
0.3 μ L，ddH20 33.2 μ L，第一輪PCR反應(yīng)后產(chǎn)物稀釋20倍取4.0 μ L ;
[0021]第二輪PCR反應(yīng)條件為:94°C熱啟動(dòng)4min ;94°C變性45s，57°C退火50s，72°C延伸45s，重復(fù)循環(huán)33次；最后72°C延伸IOmin ；
[0022](4) PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè):第二輪擴(kuò)增結(jié)束后取5.0 μ L PCR產(chǎn)物上樣于含0.5 μ g/mL EB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V/cm、時(shí)間為30min，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照；如果檢測(cè)到分子量為148bp的片段，則判定所述菌株中或植株組織樣中存在桉樹焦枯病原菌 Cylindrocladium scoparium。
[0023]本發(fā)明的有益效果為:
[0024](1）本發(fā)明提供了用于桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium巢式PCR檢測(cè)的特異性引物BT-S-1/BT-A-1，以及含有特異性引物的試劑盒。本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確的對(duì)桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium進(jìn)行分子鑒定和桉樹焦枯病的早期診斷,對(duì)控制桉樹焦枯病的檢疫及病害的防治具有意義重大。
[0025](2)本發(fā)明利用beta-tubulin gene序列分析技術(shù),設(shè)計(jì)巢式PCR檢測(cè)引物。該方法可以克服常規(guī)PCR檢測(cè)的穩(wěn)定性差、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，同時(shí)提高了病害檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為其它病害的分子檢測(cè)提供技術(shù)參考，特別對(duì)于ITS區(qū)同源性高難以區(qū)分的種屬真菌的鑒定和檢測(cè)提供參考依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)巢式PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)圖。
[0027]圖2為已知供試菌常規(guī)PCR的BT-S-1/BT-A-1特異性擴(kuò)增結(jié)果；圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量大小DL2000Marker，泳道1_22是引物BT-S-1/BT-A-1直接對(duì)表1中所對(duì)應(yīng)的供試菌株DNA溶液PCR擴(kuò)增，CK為陰性對(duì)照。
[0028]圖3為第一輪PCR通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果；圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量大小DL2000Marker，泳道1_22是通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A對(duì)表1中所對(duì)應(yīng)的供試菌株DNA溶液PCR擴(kuò)增，CK為陰性對(duì)照。
[0029]圖4為beta-tubul ingene區(qū)特異性引物巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量大小DL2000Marker，泳道1_22是引物BT-S-1/BT-A-1對(duì)表1中所對(duì)應(yīng)的供試菌株DNA溶液巢式PCR擴(kuò)增，CK為陰性對(duì)照。
[0030]圖5為巢式PCR靈敏度 檢測(cè)結(jié)果；圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量大小DL2000Marker，泳道1-9的桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium基因組DNA濃度分別為50ng/ μ L、5ng/μ L、500pg/μ L、50pg/μ L、5pg/μ L、500fg/μ L、50fg/μ L、5fg/μ L、500ag/μ L。
[0031]圖6為常規(guī)PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果；圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量大小DL2000Marker，泳道1-6的桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium基因組DNA濃度分別為50ng/ μ L、5ng/μ L、500pg/μ L、50pg/μ L、5pg/μ L、500fg/μ L0
[0032]圖7為桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium巢式PCR檢測(cè)流程。
[0033]圖8為引物BT-S-1/BT-A-1田間檢測(cè)桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium);圖中，M:DL2000marker ;1_7:BT-T1-S/BT_CYLTUBIR-A第一輪擴(kuò)增結(jié)果；8_14:巢氏PCR第二輪擴(kuò)增結(jié)果，15-21:常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果；22:陽性對(duì)照(Cylindrocladiumscoparium);其中1，8，15為新枯死組織；2，9，16為典型發(fā)病組織；3，10，17感染初發(fā)病組織；4，11，18為感染未發(fā)病組織；5，12，19病株殘?bào)w；6，13，20為健康組織；7，14，21為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0035]實(shí)施例1
[0036]圖1為桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)巢式PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)圖。
[0037]主要試劑:DNA提取試劑盒及回收試劑盒均購自天根生化科技公司，引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序交由上海生工生物工程公司完成。[0038]1、桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)快速分子檢測(cè)的PCR引物的設(shè)
計(jì)供試菌株來源、名稱、寄主、數(shù)量等信息詳見表1。
[0039]表1桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)及其它參試菌株
【權(quán)利要求】
1.一種桉樹焦枯病原菌的巢式PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其包括:
(1)IOXPCR Buffer ；
(2)2Smmol /I, Mg2+ ；
(3)IOmmo I/L dNTP ；
(4)引物:IOmmo I /L BT-T1-S，I Ommo I/L BT-CYLTUBIR-A，I Ommo I /L BT-S-1，I Ommo I /L BT-A-1 ;其中引物 BT-Tl-S 的序列為 5 ' — AACATGCGTGAGATTGTAAGT - 3 ;，引物BT-CYLTUBIR-A 的序列為 5 ; — AGTTGTCGGGACGGAAGAG — 3 ;，引物 BT-S-1 的序列為 5 ;—GGCTCCAAGAACTATGTGA - 3 ;，引物 BT-A-1 的序列為 5 ; — CCTAACCACGAATGTCAGT - 3 ;；
(5)5U/ μ L Tag 聚合酶；
(6)ddH20。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巢式PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征是，其步驟如下: (1)提取純培養(yǎng)菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA； (2)第一輪PCR反應(yīng)
第一輪 PCR 擴(kuò)增體系 50 μ L: 10 X PCR Buffer 5.0 μ L, 25mmol/L Mg2+3 μ L, IOmmoI/LdNTP 1.5 μ L，I Ommo I/L BT-Tl-S 1.5 μ L，I Ommo I/L BT-CYLTUB IR-A 1.5 μ L，5U/ μ L Tag 聚合酶0.3 μ L，ddH20 33.2 μ L，加純菌或植物組織基因組DNA提取液4.0 μ L，組成反應(yīng)混合液； 第一輪PCR反應(yīng)條件為:94°C熱啟動(dòng)5min ;94°C變性45s，58°C退火45s，72°C延伸40s，循環(huán)32次；72°C延伸8min ； (3)第二輪PCR反應(yīng)
第二輪 PCR 擴(kuò)增體系 50 μ L: 10 X PCR Buffe r 5.0 μ L，25mmol/LMg2+ 3 μ L, IOmmol/L dNTP 1.5 μ L，IOmmoI/L BT-S-1 1.5 μ L，IOmmoI/L BT-A-1 1.5 μ L，5U/ μ L Tag 聚合酶0.3 μ L，ddH20 33.2 μ L，第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋20倍后取4.0 μ L ; 第二輪PCR反應(yīng)條件為:94°C熱啟動(dòng)4min ;94°C變性45s，57°C退火50s，72°C延伸45s，重復(fù)循環(huán)33次；最后72°C延伸IOmin ； (4)PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè):第二輪擴(kuò)增結(jié)束后取5.0yL PCR產(chǎn)物上樣于含0.5 μ g/mL EB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V/cm、時(shí)間為30min，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照；如果檢測(cè)到分子量為148bp的片段，則判定所述菌株中或植株組織樣中存在桉樹焦枯病原菌 Cylindrocladium scoparium。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104017886SQ201410274443
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】朱天輝, 張靜, 朱涵明月, 李姝江, 譙天敏, 韓珊, 王淋敏, 張麗娜 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)