一種細(xì)粒棘球蚴檢測試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種細(xì)粒棘球蚴檢測試劑盒，由無菌去離子水、PCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、GoldViewDNA染料、溴酚藍(lán)上樣緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品組成，PCR反應(yīng)液由PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物組成。本發(fā)明試劑盒即可快速、準(zhǔn)確地檢測出被檢標(biāo)本中的細(xì)粒棘球蚴DNA，也可用于細(xì)粒棘球蚴感染的分子流行病學(xué)調(diào)查及療效監(jiān)測。本試劑盒的模板DNA制備步驟簡單費用低，尤其是大規(guī)模檢測時，不僅省時省力而且節(jié)省了大量的試劑和耗材，提高了工作效率。本試劑盒是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的一種敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測方法，提高檢測準(zhǔn)確率，降低假陽性率，可在檢測細(xì)粒棘球蚴這種食源性寄生蟲中的應(yīng)用。
【專利說明】一種細(xì)粒棘球蚴檢測試劑盒及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及一種檢測細(xì)粒棘球蚴這種食源性寄生蟲的試劑盒，可 以對感染細(xì)粒棘球蚴的標(biāo)本進(jìn)行鑒別檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 棘球蚴病，俗稱包蟲病，是由帶科棘球?qū)俚募?xì)粒棘球絳蟲阪 的幼蟲寄生于人、牛、羊、豬等動物的肝臟、肺、腦、脾等多種臟器引起的疾病。
[0003] 棘球蚴病呈世界性分布，導(dǎo)致全球性的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)問題，受到人們的普遍關(guān) 注。細(xì)粒棘球蚴能感染牛、羊、豬、馬、駱駝等家畜以及多種野生動物和人。細(xì)粒棘球蚴對動 物機(jī)體的危害主要是對臟器的機(jī)械性壓迫作用和毒素作用，導(dǎo)致臟器萎縮、機(jī)能障礙。動物 的臨床癥狀隨寄生部位和感染數(shù)量的不同差異明顯，輕度感染或初期癥狀均不明顯。由于 蚴體生長力強(qiáng)，體積大，不僅壓迫周圍組織使之萎縮和功能障礙，還易造成繼發(fā)感染，如果 蚴體包囊破裂，可引起過敏反應(yīng)，往往造成動物嚴(yán)重的病癥，甚至死亡。棘球蚴病的癥狀和 體征千變?nèi)f化，靠臨床診斷有一定的困難，常引起忽視或誤診，從而延誤救治時機(jī)而引起嚴(yán) 重?fù)p失，所以準(zhǔn)確診斷棘球蚴病并及時治療是控制該病比較有效的方法。
[0004] 對棘球蚴病的防治中，避免吞食含有細(xì)粒棘球蚴的內(nèi)臟是最有效的預(yù)防措施。因 此，要控制棘球蚴病的流行必須嚴(yán)格控制食源性寄生蟲病在畜禽中流行，把好屠宰檢疫關(guān)。 然而，目前食品安全衛(wèi)生問題非常嚴(yán)峻，但屠宰檢疫技術(shù)卻相當(dāng)落后，極易造成漏檢。這嚴(yán) 重影響了肉品質(zhì)量，同時也給消費者的健康造成巨大威脅。因此，對棘球蚴病建立一種操作 簡單、快速、敏感、特異的檢測方法勢在必行。PCR方法是一種操作簡單、敏感性高、特異性強(qiáng) 的分子生物學(xué)檢測方法，它可以在一個反應(yīng)體系中擴(kuò)增DNA樣本的目的基因片段，特別適 用于感染的大量臨床樣本的快速診斷。因此，建立細(xì)粒棘球蚴PCR快速檢測方法，可為臨床 上防治該病提供科學(xué)依據(jù)，而且對提高動物疫病的檢測、監(jiān)控水平，保障動物源性食品安全 具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)粒棘球蚴檢測試劑盒，該試劑盒由無菌去離子水、PCR 反應(yīng)液、DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚藍(lán)上樣緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品組成。 PCR反應(yīng)液由PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物組成。
[0006] 檢測用引物分別為檢測細(xì)粒棘球蚴的上游引物和下游引物共2條， 細(xì)粒棘球蚴上游引物（SEQ ID No :1) :5' -CGTTTGTTGCGTTAGGGTG-3'， 細(xì)粒棘球蚴下游引物（SEQ ID No :2) :5' -AACCACGAGCGTCAACCTG-3'。
[0007] 標(biāo)準(zhǔn)品為細(xì)粒棘球蝴(及的重組質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQ ID No :3 所示。
[0008] 對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陽性對照為有細(xì)粒棘球蚴DNA片段的DNA 樣品，陰性對照為無細(xì)粒棘球蚴DNA的DNA樣品。
[0009] 本試劑盒保存于-20 °C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述試劑盒在檢測細(xì)粒棘球蚴這種食源性寄生蟲中 的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明試劑盒使用方法： 每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品用無菌去離子水稀釋為60 ng/μ 1。
[0012] 1. PCR反應(yīng)管制備：總體積為25 μ 1，PCR反應(yīng)液于冰上融化及制備PCR反應(yīng)管。 依次取PCR反應(yīng)液22. 8 μ 1，7? DNA聚合酶0· 2 μ 1，濃度60 ng/ μ 1的樣品DNA (待檢測 樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品）2 μ 1于PCR反應(yīng)管中混合。用手指輕彈制備好的 PCR反應(yīng)管或用微量移液器吹打混勻，瞬時高速離心2 s。
[0013] 2.擴(kuò)增檢測：把PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，設(shè)置反應(yīng)條件為：95 °C預(yù)變性5 min， 94 °C變性45 s、59 °C退火45 s、72 °C延伸60 s共30個循環(huán)，72 °C延伸8min，4 °C保存。
[0014] 3.檢測結(jié)果判定：將1 g瓊脂糖溶于100 ml的0. 5 XTBE電泳緩沖液中，然后加入 5 μ 1 GoldView DNA染料，混勻后煮沸，傾倒凝膠板。凝膠冷卻凝固后，將PCR產(chǎn)物8 μ 1與 適量上樣緩沖液混合，加入凝膠孔中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠置于紫外燈下觀察、拍 照。標(biāo)準(zhǔn)品孔和陽性對照孔均有目的條帶而陰性對照孔無任何條帶說明PCR反應(yīng)檢測成 功。被檢樣本孔出現(xiàn)的電泳條帶與標(biāo)準(zhǔn)品孔、陽性對照孔相應(yīng)條帶大小一致則判定為陽性， 反之則為陰性。
[0015] 本發(fā)明提供了一種細(xì)粒棘球蚴單重PCR檢測試劑盒，其優(yōu)點是一個反應(yīng)即可快 速、準(zhǔn)確地檢測出被檢標(biāo)本中的細(xì)粒棘球蚴DNA，也可用于細(xì)粒棘球蚴感染的分子流行病學(xué) 調(diào)查及療效監(jiān)測。本方法的模板DNA制備步驟簡單費用低，尤其是用于大量樣品的大規(guī)模 檢測時，不僅省時省力而且節(jié)省了大量的試劑和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分 子生物學(xué)基礎(chǔ)上的一種敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測方法，大大提高了檢測準(zhǔn)確率，降低了假 陽性率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是細(xì)粒棘球蚴標(biāo)準(zhǔn)品的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。
[0017] 圖2是細(xì)粒棘球蚴陽性樣本的PCR檢測結(jié)果。
[0018] 圖3是本發(fā)明對采集的部分標(biāo)本檢測結(jié)果。

【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明 目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0020] 實施例一 本發(fā)明提供一種細(xì)粒棘球蚴檢測試劑盒，該試劑盒由無菌去離子水、PCR反應(yīng)液、 DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚藍(lán)上樣緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品組成。 PCR反應(yīng)液有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物組成。
[0021] 檢測用引物分別為檢測細(xì)粒棘球蚴的上游引物和下游引物共2條(表1): 表：u.!

【權(quán)利要求】
1. 一種細(xì)粒棘球蚴檢測試劑盒，其特征在于，由無菌去離子水、PCR反應(yīng)液、DNA聚 合酶、GoldView DNA染料、溴酚藍(lán)上樣緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品組成，其特征在于，PCR反應(yīng)液 由PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物組成，檢測用引物分別為 ： 細(xì)粒棘球蚴上游引物：5'-CGTTTGTTGCGTTAGGGTG-3'， 細(xì)粒棘球蚴下游引物：5'-AACCACGAGCGTCAACCTG-3'， 標(biāo)準(zhǔn)品為細(xì)粒棘球蝴(凡的重組質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQ IDNo :3所示， 對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陽性對照為有細(xì)粒棘球蚴DNA片段的DNA樣品，陰性 對照為無細(xì)粒棘球蚴DNA的DNA樣品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)粒棘球蚴檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒保存于-20 °C，盡量減少反復(fù)凍融。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒在檢測細(xì)粒棘球蚴中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104059973SQ201410268876
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】杜愛芳, 俞穎超, 卓洵輝, 陽毅敏 申請人:浙江大學(xué)