一種用于砷污染土壤修復(fù)的菌株及其應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于砷污染土壤修復(fù)的菌株Brevibacterium?sp.YZ-1及其應(yīng)用方法，該菌株保藏號(hào)為CGMCC?No.8329；其對(duì)As(III)的耐受性達(dá)到1000mg/L以上，可以將濃度為100mg/L的As(III)溶液氧化75％以上。該菌株能使砷污染土壤的水溶態(tài)As(III)降低82.6％，有效態(tài)As(III)降低84.1％。極大地降低了環(huán)境中砷的毒性。研究表明本發(fā)明的菌株在環(huán)境砷污染治理方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種用于砷污染土壤修復(fù)的菌株及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于砷污染的土壤微生物修復(fù)領(lǐng)域，具體涉及一種砷污染土壤修復(fù)的菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)受砷污染嚴(yán)重的省份有新疆、內(nèi)蒙、青海、湖南、云南和廣西等。砷污染主要是因人為導(dǎo)致的，如金屬礦的開(kāi)采和冶煉、砷產(chǎn)品的加工與使用、煤的燃燒等。砷是一種劇毒類金屬，在自然環(huán)境中主要以亞砷酸鹽(As(III))和砷酸鹽(As( V ))的無(wú)機(jī)形式存在并通過(guò)微生物的氧化和還原相互轉(zhuǎn)化。As(III)不帶電可移動(dòng)性更強(qiáng)對(duì)生物體危害更大，As (III)比As ( V )毒性高約100倍，將As (III)氧化成As ( V )是一個(gè)解毒過(guò)程。
[0003]我國(guó)受砷污染迫害嚴(yán)重，迫切需要研究和發(fā)展一些經(jīng)濟(jì)高效的水土砷污染凈化技術(shù)。目前砷污染環(huán)境的修復(fù)有傳統(tǒng)的化學(xué)氧化、沉淀、離子交換、吸附等方法，這些方法有成本高，易帶來(lái)二次污染等缺點(diǎn)。后來(lái)出現(xiàn)了植物修復(fù)方法，如蜈蚣草可以通過(guò)根吸收高濃度的砷并富集在體內(nèi)，安全性高成本較低，但是周期太長(zhǎng)，也存在如何處置收割后植物的難題。
[0004]近些年新出現(xiàn)了微生物方法，如活性污泥法，微生物氧化法。隨著研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的As (III)氧化菌被發(fā)現(xiàn)。研究較多的典型菌株有Alcaligenes faeealis NCIB8687、Rhizobium sp.NT-26、Agrobacrerium tumefaciens5A> Herminiimonas arsenicoxvdansULPAsl、Thiomonas sp.3As,這些菌株都能夠?qū)⒍拘詮?qiáng)的As (III)氧化成毒性弱的As ( V )。迄今為止尚未有關(guān)于Brevibacterium sp.氧化As(III)的報(bào)道。本發(fā)明為砷污染微生物修復(fù)提供了新的微生物資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種新的砷氧化功能菌株及其用于砷污染土壤修復(fù)的應(yīng)用方法，該菌株具有將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷的功能，將該菌株用于砷污染土壤的治理，成本低，操作簡(jiǎn)單。
[0006]一種用于砷污染土壤修復(fù)的菌株，所述菌株為短桿菌(Brevibacterium sp.)YZ-1，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8329。
[0007]所述的用于砷污染土壤修復(fù)的菌株的應(yīng)用方法，將所述的菌株加入土壤中將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷。具體是將砷污染土壤破碎研磨加入Brevibacterium sp.YZ-1菌液,其菌液中細(xì)菌數(shù)量達(dá)到104~105個(gè)/ml。菌液添加量為土壤與菌液的體積比為lg:2mL，混合均勻，浸泡、攪拌，處理至少10天，過(guò)濾。
[0008] 本發(fā)明中篩選、分離、馴化該菌株的過(guò)程為:采集湖南省石門縣雄黃礦區(qū)砷污染土壤，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2~3天，取上部泥漿采用梯度稀釋法，涂布含lOOmg/LAs (III)的固體培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)3~4天，連續(xù)分離純化得到不同形態(tài)的單一菌落，用AgNO3溶液鑒定，菌落邊緣呈褐色，可初步斷定為砷氧化菌。挑取分離出的單菌落接種于含As (III)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，逐步提高As (III)濃度，從50~200mg/L進(jìn)行梯度馴化，每種培養(yǎng)基重復(fù)2次。檢測(cè)液體培養(yǎng)基中殘余As(III)含量，確定砷氧化能力最佳的菌株。
[0009]固體培養(yǎng)基組成為:15g/L的LB培養(yǎng)基、2g/L乳酸鈉、2g/L磷酸二氫鉀、2g/L的硫酸鎂和15g/L瓊脂，pH = 7~8。
[0010]液體培養(yǎng)基組成為:15g/L的LB培養(yǎng)基、2g/L乳酸鈉、2g/L磷酸二氫鉀、2g/L的硫酸鎂，pH = 7~8。
[0011]梯度馴化時(shí)As(III)濃度梯度分別為:50mg/L、80mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/
L0
[0012]本發(fā)明采集湖南省石門縣雄黃礦區(qū)砷污染土壤，經(jīng)過(guò)篩選、分離、馴化，得到一種具有氧化三價(jià)砷功能的菌株。經(jīng)16S rRNA基因鑒定為Brevibacterium sp.屬。
[0013]該菌株命名為短桿菌(Brevibacteriumsp.) YZ-1 ;
[0014]保藏日期:2013年10月12日；
[0015]保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；
[0016]保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)；
[0017]保藏號(hào):CGMCCN0.8329。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)勢(shì):
[0019]1.As (III)比As ( V )毒性高約100倍，As (III)不帶電可移動(dòng)性更強(qiáng)對(duì)生物體危害更大。本發(fā)明分離篩選得到的菌株Brevibacterium sp.YZ-1可以將As (III)氧化成As( V )，能將100mg/L的As (III)溶液氧化75%以上，極大地降低了環(huán)境中砷的危害。
[0020]2.本發(fā)明菌株是從經(jīng)歷了數(shù)十年的砷污染土壤中分離篩選得到的，對(duì)As(III)的耐受性達(dá)到1000mg/L以上。該菌株能使砷污染土壤中的水溶態(tài)As (III)降低80%，有效態(tài)As(III)降低84.1%。從現(xiàn)有研究表明該菌株有望在凈化砷污染方面發(fā)揮重大作用。
[0021]3.現(xiàn)有的砷氧化菌大多為嗜酸性菌和產(chǎn)酸菌。本發(fā)明菌株在氧化三價(jià)砷的同時(shí)會(huì)代謝產(chǎn)生的堿性物質(zhì)，菌液PH由初始值7~8增加到10左右。該菌株的產(chǎn)堿特性更利于修復(fù)砷污染土壤。該菌株代謝產(chǎn)生的堿性物質(zhì)可增加土壤中砷的移動(dòng)性，利于土壤固相中的As (III)移動(dòng)到液相中，便于菌株氧化土壤中的As (III)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1:本發(fā)明菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析樹；
[0023]圖2:本發(fā)明菌株形態(tài)圖；
[0024]圖3:本發(fā)明菌株氧化As (III)的氧化效果圖；
[0025]圖4:本發(fā)明菌株對(duì)As(III)的耐受性；
[0026]圖5:本發(fā)明菌株處理砷污染土壤中As(III)的效果圖。
【具體實(shí)施方式】:
[0027]以下通過(guò)實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，而非限制本發(fā)明。
[0028]實(shí)施例1:本發(fā)明菌株的分離純化及馴化
[0029]采集湖南省石門縣雄黃礦區(qū)砷污染土壤,取5g 土壤于50mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，取ImL上部泥漿按梯度稀釋法稀釋成10_5、10'10'用移液槍從10_6、10_7稀釋液中分別取0.1mL涂布含100mg/LAs(III)的固體培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)3~4天。固體培養(yǎng)基組成為:15g/L的LB培養(yǎng)基、2g/L乳酸鈉、2g/L磷酸二氫鉀、2g/L的硫酸鎂和15g/L瓊月旨，pH = 7~8。用無(wú)菌接種針挑取不同形態(tài)的菌落，劃線接種于100mg/L As(III)的固體培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)3天。連續(xù)分離純化3次以上，得到不同形態(tài)的單一菌落。
[0030]用2mLl %的AgNO3溶液漫過(guò)培養(yǎng)基平板，菌落邊緣呈褐色，初步斷定為抗砷氧化菌。挑取初步篩選出的抗砷氧化菌單菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接，逐步提高As (III)濃度進(jìn)行梯度馴化，從50mg/L、80mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L,每種培養(yǎng)基重復(fù)2次。檢測(cè)液體培養(yǎng)基中殘余As (III)含量，確定砷氧化能力最佳的菌株。
[0031]實(shí)施例2:本發(fā)明菌株生物學(xué)鑒定及形態(tài)特征
[0032]采用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒對(duì)菌株的基因組DNA進(jìn)行提取，然后采用16SrRNA基因通用引物對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。
[0033]利用16S rRNA基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌株與Brevibacteriumyomogidense 聚在一族，相似度達(dá)到 99%,與 Brevibacterium sp.JC4316S rRNA 基因相似度達(dá)到100%,命名為Brevibacterium sp.YZ-1。該菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析樹如圖1所示。
[0034]該菌株菌體為桿狀，屬于短桿菌。該菌株的掃描電鏡圖，見(jiàn)圖2。
[0035]實(shí)施例3:本發(fā)明菌株對(duì)As (III)的氧化效率和耐受性
[0036]用接種環(huán)挑取已純化的菌落于IOOmL滅菌的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24h。然后移取5mL菌液接種到As (III)濃度分別為50mg/L、100mg/L的50mL的滅菌培養(yǎng)基中，于30°C，振蕩培養(yǎng)72h。期間，分別在培養(yǎng)24、36及7211，測(cè)定其殘余的48(111)含量。濃度為IOOmg/L的As(III)溶液被氧化了 75%以上，濃度為501^/1的48(111)溶液基本被完全氧化。如圖3所示。
[0037]以相同接種量分別接種于含As (III) 200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1500mg/L液體培養(yǎng)基中30°C振蕩培養(yǎng)24h，用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在600nm處測(cè)定吸光度值0D600。該菌株對(duì)As(III)的耐受性達(dá)到1000mg/L以上。結(jié)果如圖4所示。
[0038]實(shí)施例4:砷污染土壤修復(fù)試驗(yàn)
[0039] 湖南石門砷污染土壤破碎研磨過(guò)18目篩，稱取100g土壤，按土液比(g:mL)為1:2加入培養(yǎng)基菌液，混合均勻，浸泡并適當(dāng)攪拌，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天后，抽濾，測(cè)定土壤中水溶態(tài)和有效態(tài)As (III)的濃度。土壤的水溶態(tài)As(III)由原來(lái)的16.46mg/kg降低至2.86mg/kg, 土壤的有效態(tài)As (III)由原來(lái)的84.33mg/kg降低至13.47mg/kg,水溶態(tài)As(III)降低了 82.6%，有效態(tài)As(III)降低了 84.1% (如圖5所示)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于砷污染土壤修復(fù)的菌株，其特征在于，所述菌株為短桿菌(Brevibacteriumsp.) YZ-1，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8329。
2.權(quán)利要求1所述的用于砷污染土壤修復(fù)的菌株的應(yīng)用方法，其特征在于，將所述的菌株加入土壤中將三價(jià)砷氧化為五價(jià)砷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于砷污染土壤修復(fù)的菌株的應(yīng)用方法，其特征在于，將砷污染土壤破碎研磨加入Brevibacterium sp.YZ-1菌液，其菌液中細(xì)菌數(shù)量達(dá)到IO4~IO5個(gè)/ml，菌液添加量為土壤與菌液的體積比為lg:2mL，混合均勻，浸泡、攪拌，處理至少10天，過(guò)濾。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104004691SQ201410266798
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】楊志輝, 柴立元, 廖映平, 閔小波, 劉琳, 姚文斌 申請(qǐng)人:中南大學(xué)