一種用于植物寄生線蟲基因組dna微量提取的裂解液及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于植物寄生線蟲基因組DNA微量提取的裂解液及其應(yīng)用，其關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)為新發(fā)明的裂解液可直接用于植物寄生線蟲全基因組DNA的微量提取，無(wú)需切割、擠破、研磨、凍融線蟲，操作步驟更加簡(jiǎn)捷，最大程度地減少了DNA提取過(guò)程中樣品污染和損失的環(huán)節(jié)，提取效率和成功率顯著提高，有效地解決了以前植物寄生線蟲DNA微量提取過(guò)程中存在的效率低、穩(wěn)定性差、不易操作、步驟繁多等問(wèn)題。利用本發(fā)明中的方法提取獲得的線蟲DNA滿足植物寄生線蟲DNA條碼鑒定、RFLP酶切鑒定、特異引物PCR鑒定等分子檢測(cè)技術(shù)的需求，可在我國(guó)口岸及農(nóng)林部門檢疫鑒定工作中推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】—種用于植物寄生線蟲基因組DNA微量提取的裂解液及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物寄生線蟲檢疫鑒定領(lǐng)域，提供了一種用于植物寄生線蟲基因組DNA微量提取的裂解液及其應(yīng)用，具體而言，所述方法通過(guò)使用新的DNA提取裂解液，極大地簡(jiǎn)化了植物寄生線蟲基因組DNA提取程序，顯著提高了 DNA提取效率和成功率，有效地解決了以前植物寄生線蟲DNA微量提取過(guò)程中存在的效率低、穩(wěn)定性差、不易操作、步驟繁多等問(wèn)題，適用于口岸及農(nóng)林業(yè)相關(guān)檢疫鑒定實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的植物線蟲鑒定方法主要依賴于形態(tài)特征和形態(tài)測(cè)量值，要求鑒定者要有極為豐富的經(jīng)驗(yàn)和技巧。基于DNA的分子鑒定方法對(duì)鑒定者的要求相對(duì)較低，是形態(tài)鑒定的重要輔助手段，目前在線蟲的分類鑒定中應(yīng)用廣泛。線蟲分子鑒定的首要步驟是DNA的提取，通常來(lái)說(shuō)包括線蟲DNA大量提取和線蟲DNA微量提取兩種方法。而其中線蟲DNA微量提取方法因其需要線蟲量少、無(wú)需線蟲純化，同時(shí)具有簡(jiǎn)捷、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，因而在線蟲分子鑒定中備受青睞。
[0003]關(guān)于線蟲DNA微量提取方法有較多的研究報(bào)道。Barstead等(1991)和Williams等(1992)使用WLB裂解液成功提取了單條秀麗小桿線蟲的DNA，也是目前能夠追溯的最早建立的線蟲DNA微量提取方法。Stanton等(1998)以根結(jié)線蟲的二齡幼蟲為材料，系統(tǒng)比較了微波加熱法、水浴加熱法、蛋白酶裂解法、直接磨碎法和NaOH法提取線蟲DNA的效果，發(fā)現(xiàn)NaOH法提取成功 率可達(dá)81 %，直接磨碎法成功率為50%，其它方法效率較低。沈錫權(quán)等(2005)從單條固定海洋線蟲中提取得到基因組DNA，并用于18S rRNA基因PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)蛋白酶K法獲得的DNA比NaOH裂解法所獲得的更適合PCR擴(kuò)增。2011年，王江嶺等提出使用液氮替代-80 0C冰箱冷凍線蟲，進(jìn)一步提高了單條線蟲DNA提取的效率，可高效、穩(wěn)定的提取滑刃類線蟲的DNA，但提取短體線蟲時(shí)效果較差。王金成等(2012)對(duì)王江嶺等建立的方法進(jìn)行了再次改進(jìn)，解決了單條短體線蟲DNA微量提取問(wèn)題。
[0004]雖然線蟲DNA微量提取的方法很多，但大多數(shù)方法因操作復(fù)雜、步驟繁多或效率不高、穩(wěn)定性不夠等原因被淘汰，只有酶裂解法被廣泛應(yīng)用。但實(shí)踐表明，酶裂解法的效率和穩(wěn)定性仍然需要優(yōu)化提高，操作步驟需要進(jìn)一步簡(jiǎn)化，以適合更加多樣的線蟲DNA的提取。本研究以相對(duì)成熟的一種酶裂解法為基礎(chǔ)，對(duì)其關(guān)鍵試劑一裂解液的組份和濃度進(jìn)行了系統(tǒng)性的篩選和優(yōu)化，以提出一種更加高效、穩(wěn)定、廉價(jià)、簡(jiǎn)捷的線蟲DNA微量提取方法，為植物寄生線蟲的檢疫鑒定提供部分技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有植物寄生線蟲基因組DNA微量提取技術(shù)中存在的效率低、成功率低、步驟繁雜等缺陷，提供一種用于植物寄生線蟲基因組DNA微量提取的裂解液及其應(yīng)用，所述裂解液如下:[0006]所述裂解液的配方包含:
[0007]IOmM Tris-HCl (ρΗ8.3)，1.5mM MgCl2,60mM KCl，10mg/mL TritonX-100 (即曲拉通X-100)，0.2mM DTT (即二硫代蘇糖醇)和 300 μ g/mL Proteinase K(即蛋白酶 K)。
[0008]進(jìn)一步地，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N上述裂解液的制備方法，其特征在于:
[0009]所述裂解液由10 XPCR Buffer (含 15mM 的 Mg2+)、IOOmM 的 KCl 溶液、IOOmg/mL的TritonX-100溶液、3000 μ g/mL的Proteinase K溶液、ImM的DTT溶液和雙蒸水按1:1:1:1:2: 4的體積比混合配制而成。
[0010]進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及一種將上述裂解液用于植物寄生線蟲基因組DNA微量提取的應(yīng)用，其特征在于:
[0011]首先用雙蒸水將線蟲清洗干凈，然后挑取單條線蟲放入含5~20 μ L所述裂解液的PCR管中，最后56°C保溫0.5~4h，95°C加熱lOmin。經(jīng)上述步驟提取獲得的上清液即可用于分子實(shí)驗(yàn)。
[0012]優(yōu)選地，裂解液的使用量為10~15μ L，56°C保溫的時(shí)間為I~3h。
[0013]本申請(qǐng)的裂解液適用于多種植物線蟲的基因組DNA微量提取，特別地，適用于穿刺短體線蟲(Pratylenchus penetrans)、斯氏短體線蟲(Pratylenchus scribneri) >松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)、擬松材線蟲(B.mucronatus)、水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi)。 [0014]所述雙蒸水即為經(jīng)過(guò)兩次蒸餾的無(wú)菌水，其通常用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0015]所述裂解液配制所需試劑中的10XPCR Buffer (含15mM的Mg2+)和ProteinaseK(即蛋白酶K)均為TAKARA公司生產(chǎn)，產(chǎn)品貨號(hào)分別為R001B和9033 ;所述裂解液中的KCl(即氯化鉀)為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)，分析純，批號(hào)為2013408 ;所述裂解液中的TritonX-100 (即曲拉通-100)和DTT (即二硫代蘇糖醇)均為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品貨號(hào)分別為12023和11175。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進(jìn)步在于:本發(fā)明的裂解液可直接用于植物寄生線蟲全基因組DNA的微量提取，無(wú)需切割、擠破、研磨、凍融線蟲，操作步驟更加簡(jiǎn)捷，最大程度地減少了 DNA提取過(guò)程中樣品污染和損失的環(huán)節(jié)，提取效率和成功率顯著提高，有效地解決了以前植物寄生線蟲DNA微量提取過(guò)程中存在的效率低、穩(wěn)定性差、不易操作、步驟繁多等問(wèn)題。利用本發(fā)明的裂解液提取獲得的線蟲DNA滿足植物寄生線蟲DNA條碼鑒定、RFLP酶切鑒定、特異引物PCR鑒定等分子檢測(cè)技術(shù)的需求。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1使用裂解液I提取的線蟲DNA樣品用于核糖體ITS區(qū)PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0018]圖2使用裂解液2提取的線蟲DNA樣品用于核糖體ITS區(qū)PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0019]圖3使用裂解液3提取的線蟲DNA樣品用于核糖體ITS區(qū)PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0020]圖4使用裂解液4提取的線蟲DNA樣品用于核糖體ITS區(qū)PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0021]圖中各字母含義如下:泳道1-4:南京水稻干尖線蟲；泳道5-8:擬松材線蟲；泳道9-12:松材線蟲；泳道13-16:穿刺短體線蟲；泳道17-20:斯氏短體線蟲。
【具體實(shí)施方式】[0022]為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點(diǎn)及功效，茲舉以下實(shí)施例，并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如下:
[0023]標(biāo)本來(lái)源
[0024]本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了 5個(gè)線蟲群體，其中包括I個(gè)穿刺短體線蟲群體,I個(gè)斯氏短體線蟲群體，I個(gè)松材線蟲群體，I個(gè)擬松材線蟲群體，I個(gè)水稻干尖線蟲群體。詳情見(jiàn)下表:
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種用于植物寄生線蟲基因組DNA微量提取的裂解液，其特征在于，所述裂解液的配方包含:
IOmM Tris-HCl (pH8.3)，1.5mM MgCl2, 60mM KCl, 10mg/mL TritonX-100,0.2mM DTT 和300 μ g/mL Proteinase K0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裂解液的制備方法，其特征在于: 所述裂解液由 10XPCR Buffer、IOOmM 的 KCl 溶液、100mg/mL 的 TritonX-1OO 溶液、3000 μ g/mL 的 Proteinase K 溶液、ImM 的 DTT 溶液和雙蒸水按 1:1:1:1: 2: 4 的體積比混合配制而成，所述IOXPCRBuffer含15mM的Mg2+。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裂解液用于植物寄生線蟲基因組DNA微量提取的應(yīng)用，其特征在于: 首先用雙蒸水將線蟲清洗干凈，然后挑取單條線蟲放入含5~20 μ L所述裂解液的PCR管中，最后56°C保溫0.5~4h，95°C加熱lOmin。經(jīng)上述步驟提取獲得的上清液即可用于分子實(shí)驗(yàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，其特征在于，裂解液的使用量為10~15μL，56°C保溫的時(shí)間為I~3h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，其特征在于，所述植物寄生線蟲為穿刺短體線蟲(Pratylenchus penetrans)、斯氏短體線蟲(Pratylenchus scribneri)、松材線蟲(Bursaphelenchu s xylophilus)、擬松材線蟲(B.mucronatus)、水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004748SQ201410257794
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】王金成, 顧建鋒, 林宇, 張?jiān)＞? 馮潔, 陳先鋒, 黃國(guó)明 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心