Pfp基因在控制水稻苗期耐熱性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種提高水稻苗期耐熱性的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應(yīng)用，通過對水稻苗期耐熱相關(guān)基因PFP進行克隆，構(gòu)建該基因的過表達載體，并通過基因槍法獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株，轉(zhuǎn)基因植株與對照相比，苗期耐熱性得到提高。本發(fā)明的編碼基因?qū)μ岣咚灸蜔嵝约跋嚓P(guān)性狀的改良具有重要的理論及實際意義。對數(shù)個代表性地方水稻品種的耐熱表型和耐熱基因PFP基因型的相關(guān)性分析表明，該基因的基因型與品種的耐熱表型存在顯著相關(guān)性。進一步研究還表明，耐熱基因PFP在鹽和低溫脅迫下基因表達上調(diào)，在PEG干旱脅迫條件下基因表達下調(diào)。為深入分析該基因的功能、表達奠定了基礎(chǔ)，為闡明水稻耐熱的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了支撐。
【專利說明】PFP基因在控制水稻苗期耐熱性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及通過克隆及功能驗證得到一種與水稻苗期耐熱性相關(guān)的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物生長過程中經(jīng)常會遭受高溫、干旱等各種逆境的脅迫，在很大程度上降低其產(chǎn)量并限制其種植區(qū)域。隨著全球環(huán)境的變化加劇和人口的增長，對糧食的需求的壓力越來越大，迫切需要培育在各種逆境下生長的作物。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，對植物適應(yīng)逆境機制的研究從生理水平步入分子水平，研究的目的不僅在于從分子水平上解釋植物適應(yīng)逆境的機制，而且希望獲得各種抗逆基因，用于作物的遺傳工程抗逆育種。
[0003]水稻是世界上最重要的糧食作物之一。日本和國際水稻所較早地開展了耐熱水稻品種選育的研究。日本學者Satake等曾進行過耐熱品種的篩選以及耐熱性的數(shù)量遺傳分析，發(fā)現(xiàn)水稻對高溫的耐性具有品種特異性；我國學者徐云碧等也報道不同品種耐熱性差異較大。這些研究表明，遺傳因素是決定水稻品種間耐熱性差異的主要原因。近年來，隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了一些利用分子標記對水稻耐熱性進行數(shù)量性狀基因座(Quantitative trai t loci, QTL)定位研究的報道。
[0004]隨著全球氣候的變暖，水稻耐熱相關(guān)基因的挖掘和耐熱水稻品種選育已成為水稻遺傳育種方向的重要課題。但是，目前鮮有關(guān)于水稻耐熱基因克隆及其在水稻育種中應(yīng)用的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種提高水稻苗期耐熱性的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應(yīng)用。 申請人:利用基因芯片，對熱敏感的野生稻滲入系YIL106和耐熱的輪回親本特青在高溫處理后的基因表達譜進行分析，結(jié)合QTL定位結(jié)果和生物信息學方法，利用野生稻滲入系群體對QTL定位區(qū)域內(nèi)的差異表達基因進行分析和驗證，篩選出與水稻苗期耐熱性相關(guān)的基因L0C_0s01gl9020,該基因?qū)儆谶^氧化物酶家族類(Peroxidase familyprotein)基因，命名為PFP，該基因的⑶S核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，序列長度為1044bp，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，氨基酸序列為347個。
[0006]本發(fā)明對控制水稻苗期耐熱基因PFP進行克隆，將其編碼區(qū)構(gòu)建過表達載體，并通過基因槍法導入水稻苗細胞、組織或器官，獲得轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因植株的表型檢測表明，其苗期耐熱在一定程度上得到提高，本發(fā)明克隆的水稻苗期耐熱基因為水稻耐熱品種選育提供了新的基因資源。
[0007]以下將對本發(fā)明作進一步說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是PFP基因在HL106與特青中基因編碼蛋白比較圖，下劃線處表示兩者之間的編碼蛋白差異。
[0009]圖2是本發(fā)明的PFP基因的過表達載體酶切驗證電泳圖。
[0010]其中:0為Marker ; 1-2為Kpn和Spe I雙酶切，為陽性克隆。
[0011]圖3是利用潮霉素引物序列進行PCR篩選PFP轉(zhuǎn)基因植株的電泳圖。
[0012]其中:0為Marker ;1_9為陽性轉(zhuǎn)化植株；10_12為水，陰性對照。
[0013]圖4是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株和對照中花17高溫處理后的表型比較圖。
[0014]其中:A為中花17，B為轉(zhuǎn)基因植株。
[0015]圖5是PFP基因分別受NaCl、4°C低溫、PEG和ABA處理后的表達情況。
[0016]其中，A表示NaCl，B表示4°C低溫，C表示PEG，D表示ΑΒΑ。
【具體實施方式】
[0017]1.實驗材料
[0018]野生稻熱敏感滲入系HL106 (PFP基因型同野生稻)、耐熱輪回親本特青、77個地方水稻品種。實驗中所用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq Plus酶等購自TAKARA公司，PCR所使用的PCR Buffer、dNTP、TRIzol RNA提取試劑盒、大腸桿菌(E.coli)T0P10購自天根生物工程公司，反轉(zhuǎn)錄酶購自六合通公司，基因芯片實驗中所用試劑盒購自Qiagen公司，實驗中所使用的各種引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成，各種序列分析由北京六合華大基因科技公司進行測序。
[0019]2.PFP基因序列及耐熱相關(guān)性分析
[0020]PFP基因序列的擴增和測序分析
[0021]為了獲得PFP基因序列全長編碼序列并驗證PFP基因在野生稻熱敏感滲入系YIL106和耐熱輪回親本特青之間的基因組水平上是否存在差異，首先依據(jù)已公布的日本晴和9311的DNA序列設(shè)計引物:正向引物為5 ' -GGCGGATCCATGAGGCTGTCGGTGGCCATCC-3'(見 SEQ ID N0.3)，反向引物為 5' -GGCGGTACCTTAGTACAAGTGGTTGATGGCG-3'(見SEQ ID N0.4)，以HL106和特青兩個材料的苗期cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系共 20 μ 1:2 μ I 模板、0.2 μ I Taq plus (2.5U/μ I)、2 μ I Taq plus buffer (2x) > I μ IdNTPs (2.5mM)、2μ I primer、12.8 μ I ddH20 ;擴增程序:94 °C 5min ；94°C 30s, 58 °C 30s,72°C lmin, 35cycles ;72°C延伸 IOmin0
[0022]PCR產(chǎn)物通過I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送北京六合華大基因科技公司對基因組測序和Blast分析。結(jié)果表明，熱敏感滲入系HL106和耐熱親本特青擴增產(chǎn)物長均為1044bp，但兩者存在一個編碼蛋白差異(見圖1)。
[0023]PFP基因與耐熱性相關(guān)分析
[0024]選取77個代表性地方水稻品種進行了苗期耐熱性鑒定，種子用3%的次氯酸鈉消毒20min，清洗后，室溫浸種2d，30°C催芽2d，將出芽整齊的種子播種于管底剪去的96孔PCR塑料板，放到裝有Yoshida培養(yǎng)液的塑料盒子中培養(yǎng)，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換取營養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為12h光照(28°C )/12h黑暗(26°C )，濕度70%。42°C處理兩葉一心幼苗，記錄各品種的耐熱表型，選取表型非常確定的17個品種為熱敏感品種(S)，16個品種為耐熱品種(R)。對這33個表型非常確定的品種分別提取基因組DNA，對目的基因PFP進行PCR擴增(引物和PCR程序、條件同上)、測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在耐熱品種中這兩個基因的序列大部分同特青相同，而熱敏感品種的基因序列大部分與YIL106 —致。通過對這33個水稻品種的耐熱表型和基因型的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)PFP基因與苗期耐熱性存在顯著相關(guān)性相關(guān)系數(shù)R值為0.610。
[0025]3.PFP基因目的片段的擴增
[0026]從YIL106cDNA模板中擴增出帶有酶切位點的目標基因的⑶S序列。用qRT_PCR的方法擴增目標基因，RT-PCR 條件為-MV 5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 45s, 35cycles,72°C 延伸 IOmin ;反應(yīng)體系為 10μ 1，包括:4μ I cDNA 模板(2ng/μ I)、5 μ I SYBR GreenI(1000x)及1μ 14mM引物。并在PCR引物中引入合適的限制性內(nèi)切酶Kpn I和Spe I酶切位點，引物序列:正向引物為 5' -GGCGGATCCATGAGGCTGTCGGTGGCCATCC-3'(見 SEQ IDN0.5)、反向引物為 5 ' -GGCGGTACCTTAGTACAAGTGGTTGATGGCG-3 '(見 SEQ ID N0.6)，從YIL106的cDNA模板中擴增出帶有酶切位點的目標基因的CDS序列。
[0027]4.PFP基因過量表達載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化
[0028]酶切上步驟中PCR產(chǎn)物，酶切反應(yīng)體系如下:目的片段10 μ 1、10XBuffer2 μ 1、限制性內(nèi)切酶Kpn I和Spe I各I μ 1，將該體系補水至20 μ 1，37°C過夜。紫外燈下割取目標長度的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)?；厥蘸筮B接到PMD18-T克隆載體上，通用引物Ml3測序，挑選序列完全正確的克隆，酶切回收。
[0029]為了提高目的基因在中花17中的表達，本研究特選用強啟動子——super35Spromotor來調(diào)控候選基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達。目的片段的酶切回收后(見圖2)，進行回收的目標片段與過表達載體PCAMBIA1301連接。目的片段和載體比例為9:1，首先9111目的片段和Iul載體混合，55°C放置5min，然后加入IOul高效連接酶solution〗，16°C反應(yīng)40min，然后轉(zhuǎn)化，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化采用熱激轉(zhuǎn)化法，具體操作如下:從_80°C冰箱中取出所需感受態(tài)細胞(T0P10)，置冰上緩緩解凍；超凈工作臺上將感受態(tài)細胞均勻分到滅菌的離心管中(每管50 μ I)，并加入連結(jié)產(chǎn)物10μ 1，輕輕搖勻，冰上靜置30min ;42°C水浴熱激90s,迅速置冰上2min ;于超凈工作臺上向離心管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37°C振蕩培養(yǎng)45min (220rpm);室溫下4000g離心2min，棄掉900 μ I上清液，將剩余上清液重新懸浮菌體，加入40 μ I x-gal和16μ1 IPTG，混勻，用涂布器將其均勻涂到LB固體培養(yǎng)基平板上(含Amp)，放置30min ;倒置平板于37°C恒溫箱中培養(yǎng)過夜。
[0030]提取過表達載體pCAMBIAl301-Ubi質(zhì)粒，采用基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到粳稻受體材料品種“中花17”，其中基因槍轉(zhuǎn)化采用Bio-Rad公司生產(chǎn)的roS-1000/He基因槍，打槍后先將愈傷組織在不含篩選劑的培養(yǎng)基中恢復生長一周，再轉(zhuǎn)入含50mg/L潮霉素的繼代培養(yǎng)基中篩選30d左右，挑取抗性突起，再在含50mg/L潮霉素的繼代培養(yǎng)基中篩選30d左右，在預分化培養(yǎng)基(50mg/L潮霉素)光照培養(yǎng)20d左右，在分化培養(yǎng)基中(50mg/L潮霉素)中分化，最后在含50mg/L潮霉素的壯苗培養(yǎng)基中(三角瓶)繼續(xù)篩選30d左右，再轉(zhuǎn)到含壯苗培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)30-40d，然后移栽到土壤。
[0031]5.轉(zhuǎn)PFP基因植株檢測和表型分析
[0032]采用PCR擴增潮霉素抗性基因(HYG)片段，檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株?？剐曰?HYG)檢測引物為:HYG-F5 ' -TACTTCTACACAGCCATC-3 '(見 SEQ ID N0.7)和HYG-R5' -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3'(見 SEQ ID N0.8)，得到 9 株陽性轉(zhuǎn)基因植株(見圖
3)，并獲得T1代植株。[0033]轉(zhuǎn)PFP基因植株和對照中花17植株長至兩葉一心時進行42°C高溫處理，觀察耐熱表型。由圖4可以看出，高溫處理后中花17第二和第三片葉一半以上葉片枯黃，而轉(zhuǎn)基因植株第二和第三片葉只有葉尖枯黃，大部分葉片仍持綠色?？梢钥闯?，PFP基因超表達植株與對照中花17相比耐熱性增強。但轉(zhuǎn)基因植株的每個系的耐熱表型均存在一定程度的分離。
[0034]6.PFP基因受NaCl、低溫、PEG和ABA脅迫處理表達情況分析
[0035]為了研究PFP基因是否受鹽脅迫(NaCl)、低溫、干旱(PEG)、和ABA脅迫的誘導，本研究分別用200mM NaCl、4°C低溫、30% PEG和100 μ M ABA處理HL106和特青兩葉一心期的幼苗，處理0h、lh、8h和24h時取樣，提取RNA反轉(zhuǎn)錄后進行了 RT-PCR分析(引物序列:HYG-F5' -AGTCCTGCTGGACAAGTCGT-3'(見 SEQ ID N0.9)和 HYG-R5' -TAGATGAGGATGTCGGAGCA-3丨(見SEQ ID N0.10))。葉片總RNA提取方法參考Sambrook等的方法，選用水稻的18S基因作為內(nèi)標基因(引物序列為18S-F5' -GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3'(見SEQ IDN0.11)和 18S-R5' -GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'(見 SEQ ID N0.12))進行 PCR 擴增。反應(yīng)體系為 10 μ 1，包括:4μ I cDNA 模板(2ng/μ 1)、5μ I SYBR Green I(1000x)及 I μ 14mM引物。擴增程序如下(利用MJ檢測系統(tǒng))-M0C 5min ；94°C 15s，58°C 15s，72°C 20s, readplate85°C ls，40cycles ；72°C 5min ；65°C _95°C每隔 0.3°C作熔解曲線。手工設(shè)定熒光閾值，確定特定熒光閾值下各樣品的Ct值，采用2_Λ 計算方法分析不同樣品間相對表達量的聞低。 [0036]根據(jù)定量PCR結(jié)果，由圖5可以看出，經(jīng)NaCl處理后，PFP基因在特青中的表達量與未處理時相比，在處理Ih時顯著上升，隨后下降，基因在HL106中的表達量相對較低；低溫處理后，該基因在YIL106的表達量變化不大，在特青中的表達量略有上升；4°C處理后的表達量下降；ABA處理24h后上調(diào)明顯?？梢?，PFP基因受鹽和低溫處理上調(diào)表達，受PEG處理下調(diào)表達。
[0037]本發(fā)明克隆了水稻苗期耐熱相關(guān)基因PFP，構(gòu)建了該基因的過表達載體，獲得了轉(zhuǎn)基因的后代，對轉(zhuǎn)基因植株的表型檢測表明其苗期耐熱在一定程度上得到提高。進一步研究還表明，耐熱基因PFP在鹽和低溫脅迫下基因表達上調(diào)，在PEG干旱脅迫條件基因表達下調(diào)。這為深入分析該基因的功能、表達奠定了基礎(chǔ)，為闡明水稻耐熱的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了支撐。
【權(quán)利要求】
1.一種提高水稻苗期耐熱性的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應(yīng)用，其中，該基因編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
2.一種提高水稻苗期耐熱性的基因PFP在水稻苗期耐熱性遺傳改良中的應(yīng)用，其中，該基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。
3.如權(quán)利 要求1或2所述的應(yīng)用，其中，將所述水稻苗期耐熱基因PFP導入水稻苗細胞、組織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的水稻苗細胞、組織或器官進行培育，得到耐熱性提高的轉(zhuǎn)基因水稻苗。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述水稻苗期耐熱基因PFP通過過表達載體導入水稻苗細胞、組織或器官。
【文檔編號】C12N9/08GK103981196SQ201410256699
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】雷東陽 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學