豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體檢測(cè)用引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體檢測(cè)用引物和檢測(cè)試劑盒。所述檢測(cè)用引物為序列表SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：4，本發(fā)明還提供了豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明所選引物特異性強(qiáng)，且能同時(shí)檢測(cè)三種病原，節(jié)約成本、減少步驟，提高效率。本發(fā)明方法具有高特異性、高靈敏度，高效率、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體檢測(cè)用引物及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體檢測(cè)用引物及檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豬的附紅細(xì)胞體病主要引起仔豬發(fā)熱、貧血蒼白、黃疸和母豬流產(chǎn)等癥狀，常與其他豬病混合感染危害嚴(yán)重，防治十分困難。近年來(lái)研究表明感染豬的附紅細(xì)胞體的種類有兩種，豬附紅細(xì)胞體(Mycoplasma suis MS)和小附紅細(xì)胞體(Mycoplasma parvum MP),原來(lái)歸于立克茲氏體目質(zhì)體科，近年來(lái)根據(jù)16Sr RNA基因的序列分析和電鏡的觀察結(jié)果，將附紅細(xì)胞體劃分到支原體屬的嗜血支原體。我們?cè)诟郊t細(xì)胞體感染的豬體內(nèi)分離到第三種感染豬的新附紅細(xì)胞體病原，并在Genbank上公布了其16S rRNA和rnpB基因序列(登錄號(hào) JX489600 和 JX489603),暫定名為未定種附紅細(xì)胞體(Candidate mycoplasma haemosuisCMH)。由于嗜血支原體都不能夠純培養(yǎng)，對(duì)其研究造成很大的困難。目前臨床上主要依靠顯微鏡檢查鮮血壓片和姬姆薩染色片進(jìn)行診斷，這些方法存在滯后性和顯著的假陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)室診斷方法有檢測(cè)抗體的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和檢測(cè)病原的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)診斷方法，但現(xiàn)有的診斷方法主要針對(duì)的病原為豬附紅細(xì)胞體MS，對(duì)其他兩種病原體MP和CMH的診斷方法尚未有報(bào)道。同時(shí)根據(jù)我們的臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)浙江上海安徽等地區(qū)感染豬的附紅細(xì)胞體種類主要為MP而并非國(guó)內(nèi)外研究較多的MS。為了能夠明確這類病原的致病性和致病機(jī)理，亟需可以診斷三種病原的診斷方法。
[0003]本發(fā)明首次將P CR技術(shù)應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體檢測(cè)領(lǐng)域，提供了針對(duì)豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體檢測(cè)的特異性引物、試劑盒和檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的同時(shí)檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的核苷酸序列。
[0005]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的同時(shí)檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的檢測(cè)試劑盒。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明提供了檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體檢測(cè)引物，具體如下:
[0008]通過(guò)序列比較分析，根據(jù)豬附紅細(xì)胞體ZJ NBOl株16Sr RNA基因序列(GenBank登錄號(hào):KC907396)保守區(qū)199-582位置和小附紅細(xì)胞體ZJ JX9330株16Sr RNA基因序列(GenBank登錄號(hào):HQ489599)保守區(qū)198-581位置設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物:
[0009]I)MP 和 MS 正義引物(MF)[0010]5’ TAAATTAAAGGAGGCTGCCGMAAGGTG3’ (SEQ ID NO:1)；
[0011]2) MP 和 MS 反義引物(MR)
[0012]5’ TACGCCCAATAAATCCGGATAATGCTC3’ (SEQ ID NO:2)；
[0013]其中，M代表兼并堿基A或C ;
[0014]擴(kuò)增目的片段為384bp，擴(kuò)增到MS序列如序列表SEQ IDNO:5所示；
[0015]其中，21bp處M代表兼并堿基A或C。
[0016]擴(kuò)增到MP序列如序列表SEQ ID NO:6所示；
[0017]通過(guò)序列比較，根據(jù)未定種附紅細(xì)胞體CMH已公布的ZJ SXSYl 102株16Sr RNA基因序列(GenBank:JX489600)，在其保守區(qū)441-972位置設(shè)計(jì)一對(duì)引物:
[0018]3) CMH 正義引物(CMHF)
[0019]5’ AAACTCTGATGGTACCTCCTGAATAAGTGA3’ (SEQ ID NO:3)；
[0020]4) CMH 反義引物(CMHR) [0021]5’ CCTTCGCTGGGGATGTCAAACCT3’ (SEQ ID NO:4)；
[0022]擴(kuò)增目的基因大小為532bp,序列如序列表SEQ ID NO:7所不；
[0023]其中，490bp處M代表兼并堿基A或C。
[0024]本發(fā)明還提供了一種豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的檢測(cè)試劑盒，由以下組分組成:
[0025]1)DNA提取試劑；通?？梢允褂蒙虡I(yè)購(gòu)買的血液DNA提取試劑盒，例如杭州新景生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司的全血DNA提取試劑盒(Blood DNA Mini kit, Cat.N0.3001050)；
[0026]2)DNA標(biāo)準(zhǔn)品:含豬附紅細(xì)胞體靶基因的T載體質(zhì)粒和含未定種附紅細(xì)胞體靶基因的T載體質(zhì)粒；
[0027]3) PCR反應(yīng)液，其包括:PCR緩沖液，dNTP, Taq DNA聚合酶，檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體的正義引物、反義引物，檢測(cè)未定種附紅細(xì)胞體的正義引物、反義引物；
[0028]優(yōu)選使用=IXPCR緩沖液，檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體的正義引物
0.2 μ M、反義引物0.2 μ M和未定種附紅細(xì)胞體正義引物0.2 μ M、反義引物0.2 μ M，Taq DNA聚合酶1U，dNTP ；
[0029]所述Taq DNA聚合酶為TakaRa Taq?，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)DROOlA0所述引物均委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。
[0030]4)陰性對(duì)照:DEPC水；
[0031]5)DEPC水；lmL x2管，自來(lái)水兩次蒸餾，經(jīng)過(guò)Millipore純水儀純化，電阻率大于18.0ΜΩ.CM。
[0032]6)電泳觀察結(jié)果:5 μ L PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察結(jié)
果O
[0033]其中，檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體的正義引物為序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列；檢測(cè)未定種附紅細(xì)胞體的正義引物為序列表SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ IDNo:4所示的核苷酸序列。
[0034]本發(fā)明還提供了一種豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的檢測(cè)試劑盒的使用方法:[0035]1.樣品采集、運(yùn)送及制備
[0036]具蒼白貧血發(fā)熱等癥狀的病豬，采集抗凝血l_2mL，置于4°C保鮮盒中，運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。-4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0037]2.DNA 提取
[0038]按照全血DNA提取試劑盒試劑盒提供的方法提取病原DNA，具體方法如下:
[0039](I)取300 μ I緩沖液LI移入到1.5ml離心管中；
[0040](2)加入400 μ I全血，在漩渦振蕩器上混勻(30s)；
[0041](3)加入300 μ I緩沖液L2，劇烈搖晃離心管3-5次，在漩渦振蕩器上混勻(30s)；
[0042](4) 13000rpm 離心 2min ；
[0043](5)將步驟4中的上清液倒入到核酸純化柱中，蓋上管蓋，置于2mL收集管中，12000rpm 離心 30s ；
[0044](6)棄去收集管中的濾液，把柱子放置回收集管，在柱子中加入500 μ L緩沖液WA，蓋上管蓋，12000rpm離心30s ；
[0045](7)棄去收集 管中的濾液，把柱子放置回收集管，在柱子中加入600 μ L緩沖液WB，蓋上管蓋，12000rpm離心30s ；
[0046](8)棄去收集管中的濾液，把柱子放置回收集管，HOOOrpm離心Imin ；
[0047](9)棄去收集管，把柱子放進(jìn)一個(gè)潔凈的1.5ml離心管中，加入100 μ 156°C溫育的緩沖液TE，蓋上管蓋，室溫放置lmin，12000rpm離心lmin，1.5ml離心管中即為病原DNA，可立即用于PCR反應(yīng)，或者_(dá)20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0048]3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR:
[0049]200 μ I PCR反應(yīng)管，設(shè)置陰性對(duì)照管和陽(yáng)性對(duì)照管，其余為樣品檢測(cè)管。
[0050]反應(yīng)體系為25 μ L,見(jiàn)表1:
[0051]表1
【權(quán)利要求】
1.一組檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的核苷酸引物，其特征在于，所述核苷酸引物為序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4，其中序列SEQ ID NO:1和SEQID NO:2分別為檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分別為檢測(cè)未定種附紅細(xì)胞體的正義引物和反義引物。
2.一種豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，由以下組分組成: 1)DNA提取試劑； 2)DNA標(biāo)準(zhǔn)品； 3)PCR反應(yīng)液，其包括:PCR緩沖液，dNTP,Taq DNA聚合酶，檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體的正義引物、反義引物，檢 測(cè)未定種附紅細(xì)胞體的正義引物、反義引物； 4)陰性對(duì)照:DEPC水；
5)DEPC 水； 其中，檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體的正義引物為序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列；檢測(cè)未定種附紅細(xì)胞體的正義引物為序列表SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ IDNo:4所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑為DNA提取試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品包括豬附紅細(xì)胞體靶基因的T載體質(zhì)粒和未定種附紅細(xì)胞體靶基因的T載體質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬附紅細(xì)胞體、小附紅細(xì)胞體和未定種附紅細(xì)胞體的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括I X PCR緩沖液，檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體的正義引物0.2 μ M、反義引物0.2 μ M，檢測(cè)未定種附紅細(xì)胞體的正義引物0.2 μ M、反義引物 0.2 μ Μ, Taq DNA 聚合酶 IU，dNTP。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104004847SQ201410253400
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】付媛, 石團(tuán)員, 方維煥, 徐麗華, 袁秀芳, 李軍星, 盧福莊, 張雪娟, 舒琦艷, 魏巍, 周永學(xué) 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院