用于檢測rs7597593位點和rs1344706位點的核苷酸的物質(zhì)的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測ZNF804A基因中的rs7597593位點和rs1344706位點的核苷酸的物質(zhì)的新用途。本發(fā)明要求保護用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rs1344706位點的核苷酸的物質(zhì)在制備用于評估海洛因成癮風(fēng)險性的試劑盒中的應(yīng)用。將rs7597593位點和rs1344706位點的聯(lián)合基因型分為風(fēng)險基因型、中間基因型和保護基因型。基于rs7597593位點和rs1344706位點的聯(lián)合基因型，風(fēng)險基因型的受試者海洛因成癮風(fēng)險性高，保護基因型的受試者海洛因成癮風(fēng)險性低。本發(fā)明有助于預(yù)防海洛因成癮疾病、對海洛因成癮者疾病進程的預(yù)測及評估、對海洛因成癮者進行有效的干預(yù)、開發(fā)新的針對海洛因成癮者的藥物，具有重大的應(yīng)用價值。
【專利說明】用于檢測rs7597593位點和rs1344706位點的核苷酸的物
質(zhì)的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及用于檢測ZNF804A基因中的rs7597593位點和rs 1344706位點的核苷酸的物質(zhì)的新用途，具體來說為用于檢測ZNF804A基因中的rs7597593位點和rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)在制備用于評估海洛因成癮風(fēng)險性和/或海洛因成癮者的沖動抉擇行為損害程度以和/或海洛因成癮者大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積的試劑盒的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]物質(zhì)成癮也稱物質(zhì)依賴，是指長期濫用某種物質(zhì)后,心理上與軀體上產(chǎn)生的一種強烈而不能克制的尋覓該種物質(zhì)的狀態(tài)，以期體驗重復(fù)使用該物質(zhì)所產(chǎn)生的欣快感，同時避免戒斷所引起的軀體不適。物質(zhì)成癮性疾病是一種反復(fù)發(fā)作的以強迫性覓藥和攝藥行為主要特征的慢性復(fù)發(fā)性腦病。
[0003]物質(zhì)成癮者行為學(xué)異常主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降、沖動控制能力受損和認知能力下降等形式。這些行為改變是物質(zhì)成癮者接觸成癮性物質(zhì)和發(fā)生復(fù)吸的直接原因。沖動性表現(xiàn)為缺乏前瞻性考慮、不計后果地進行一些不恰當或冒險的行為。研究中發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)成癮者表現(xiàn)出更高的沖動性。沖動性高低與成癮物質(zhì)的使用量、渴求程度以及戒斷癥狀嚴重性呈正相關(guān)。高沖動性被認為是導(dǎo)致復(fù)吸的一個關(guān)鍵因素。研究表明，高沖動性預(yù)示著可卡因成癮者戒斷后復(fù)吸幾 率更高。對物質(zhì)成癮者的沖動性研究有多種角度，比如沖動性選擇(impulsive choice)、行為去抑制(response inhibition)和思維沖動(reflectionimpulsivity)等。對沖動性的評估有多種方法，其中沖動抉擇指的是在各種選擇中進行決斷，以期達到最優(yōu)化的能力。愛荷華賭博試驗(1wa Gambling Task, IGT)是一種對沖動抉擇能力進行定量評估的方法。在試驗中，受試在不確定結(jié)果的條件下需要權(quán)衡獎賞和懲罰的大小，并作出最優(yōu)選擇。對阿片類、酒精、可卡因、大麻類等物質(zhì)成癮性疾病的研究表明，物質(zhì)成癮者的沖動抉擇行為受損(沖動抉擇能力降低)，并且沖動抉擇行為損害程度與藥物成癮復(fù)吸行為密切相關(guān)。
[0004]此外，物質(zhì)成癮者腦影像也會發(fā)生改變，主要包括腦解剖結(jié)構(gòu)的改變、腦區(qū)活動和神經(jīng)遞質(zhì)的改變以及基于各種任務(wù)的腦區(qū)激活情況改變。研究表明，被濫用的物質(zhì)具有神經(jīng)毒性，可造成神經(jīng)細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，進而影響其功能。這種形態(tài)，結(jié)構(gòu)和功能的損害可能是慢性，永久性和不可逆轉(zhuǎn)的。目前從腦解剖結(jié)構(gòu)變化角度開展的成像研究主要集中在兩個方面:一是測量腦灰質(zhì)白質(zhì)的體積大??；二是用擴散張量成像技術(shù)對神經(jīng)纖維進行追蹤。其中，用voxel based morphometry (VBM)方法測量腦灰白質(zhì)體積改變實現(xiàn)了同一標準探測腦內(nèi)是否具有因為灰質(zhì)缺失所帶來的特定部位的萎縮。已有研究表明，物質(zhì)成癮者多個腦區(qū)均存在灰質(zhì)密度異常。
[0005]物質(zhì)成癮性疾病是多種遺傳因素與環(huán)境因素共同作用而導(dǎo)致的一種復(fù)雜的腦疾病。遺傳因素與物質(zhì)成癮性疾病的易感性密切相關(guān)。Tsuang等人對物質(zhì)成癮者的雙生子的研究中發(fā)現(xiàn)，遺傳因素是造成個體對成癮性物質(zhì)易感性不同的主要原因。已有研究證明，海洛因成癮者的行為學(xué)及影像學(xué)異常是可受遺傳因素調(diào)節(jié)的。遺傳因素能影響成癮疾病的各個階段，與物質(zhì)成癮性疾病相關(guān)的許多重要基因的遺傳多態(tài)性改變能夠影響個體對物質(zhì)成癮的易感性、耐受性、機體功能及復(fù)吸。
[0006]阿片類物質(zhì)成癮，特別是海洛因成癮是我國最早開始流行，也是流行最嚴重的成癮種類。根據(jù)2014年的中國禁毒報告，中國阿片類成癮者目前已達到133萬，占全國所有藥物成癮總?cè)藬?shù)的53.6%，是我國成癮人群的大多數(shù)。找到預(yù)示海洛因成癮疾病易感性及成癮后行為學(xué)損害程度的生物學(xué)靶標，對預(yù)防海洛因成癮疾病的發(fā)生和提高復(fù)吸治療成功
率，具有重要意義。
[0007]ZNF804A 蛋白即鋒指蛋白 804A(zinc finger protein804A)。ZNF804A 基因位于染色體2q32.1，大小為341kb。目前，ZNF804A基因的確切功能尚不清楚。ZNF804A基因在人腦內(nèi)廣泛表達，尤其在未發(fā)育完全的海馬和皮質(zhì)，在成年的小腦內(nèi)也有大量表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供用于檢測ZNF804A基因中的rs7597593位點和rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)的新用途。
[0009]rs7597593位點存在A/G多態(tài)，rsl344706位點存在A/C多態(tài)，將rs7597593位點和 rsl344706 位點的聯(lián)合基因型分為風(fēng)險基因型(AArs7597593-AArsl344706, AArs7597593-ACrsl344706,AGrs7597593_AArsl3447(l6)、中間基因型(AArs7597593_CCrsl3447(l6、GGrs7597593_AArsl344706、AGrs7597593_ACrsl3447(l6)和保護基因型(AGrs75g75g3_CCrsl344706' GGrs7597593_ACrsl344706、GGrs7597593_CCrsl344 ro6)。
[0010]本發(fā)明要求保護用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)在制備用于評估海洛因成癮風(fēng)險性的試劑盒中的應(yīng)用。基于rs7597593位點和rsl344706位點的聯(lián)合基因型，如果受試者為風(fēng)險基因型(AAre7597593-AA,sl3447(l6、AArs7597593_A￡rsl344706、AGrs75g75g3_AArsl344706 )、其海洛因成癮風(fēng)險性高，如果受試者為保護基因型(AGrs7597593_CCrsl344706Λ GGrs7597593~ACrsl344706、GGrs7597593_CCrsl344706 )、其海洛因成癮風(fēng)險性低。
[0011]本發(fā)明還保護用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)在制備用于評估海洛因成癮者的沖動抉擇行為損害程度的試劑盒中的應(yīng)用。基于rs7597593位點和rsl344706位點的聯(lián)合基因型，如果受試者為風(fēng)險基因型(AArs7597593_AArsl344706Λ ^rs7597593_-^-Crsl344706Λ AGrs7597593_AArsl344706 )、其沖動決策行為的損害程度聞，如果受試者為保護基因型(AGrs7597593-CCrsl3447tl6、GGrs7597593-ACrsl3447tl6、GGrs7597593-CCrsl344706)、其沖動決策行為的損害程度低。沖動決策行為的損害程度高具體體現(xiàn)為受試者的IGT得分結(jié)果為-10以下。沖動決策行為的損害程度低具體體現(xiàn)為受試者的IGT得分結(jié)果為-5以上。
[0012]本發(fā)明還保護用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)在制備用于評估海洛因成癮者的大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積的試劑盒中的應(yīng)用?；趓s7597593位點和rsl344706位點的聯(lián)合基因型，如果受試者為風(fēng)
1?基因型(AArs75g75g3_AArsl 344706' ^rs7597593_-^-Crsl 344706 Λ AGrs7597593_AA_rsl344706)、 其大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積高，如果受試者為保護基因型(AGre7597593-CC；sl3447(l6、GGrs7597593-ACrsl344706>GGrS7597593_CCrsl344706)、其大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體低。大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積高具體體現(xiàn)為受試者大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積大于正常受試者或具有統(tǒng)計學(xué)意義的正常受試者的平均值。大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體低具體體現(xiàn)為受試者大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積為正常受試者或具有統(tǒng)計學(xué)意義的正常受試者的平均值以下。
[0013]本發(fā)明還保護一種用于評估海洛因成癮風(fēng)險性的試劑盒，包括用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)?；趓s7597593位點和rsl344706位點的聯(lián)合基因型，如果受試者為風(fēng)險基因型(AAre7597593-AArsl3447(16、AArs7597593_A￡rsl344706、AGrs75g75g3_AArsl344706 )、其海洛因成癮風(fēng)險性高，如果受試者為保護基因型(AGrs7597593_CCrsl344706Λ GGrs7597593~ACrsl344706、GGrs7597593_CCrsl344706 )、其海洛因成癮風(fēng)險性低。
[0014]本發(fā)明還保護一種用于評估海洛因成癮后的沖動抉擇行為損害度的試劑盒，包括用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)?；趓s7597593位點和rs 1344706位點的聯(lián)合基因型，如果受試者為風(fēng)險基因型(AArs7597593_AArsl344706Λ ^rs7597593_-^-Crsl344706Λ AGrs7597593_AArsl344706 )、其沖動決策行為的損害程度聞，如果受試者為保護基因型(AGrs7597593-CCrsl3447tl6、GGrs7597593-ACrsl3447tl6、GGrs7597593-CCrsl344706)、其沖動決策行為的損害程度低。沖動決策行為的損害程度高具體體現(xiàn)為受試者的IGT得分結(jié)果為-10以下。沖動決策行為的損害程度低具體體現(xiàn)為受試者的IGT得分結(jié)果為-5以上。
[0015]本發(fā)明還保護一種用于評估海洛因成癮后的大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積的試劑盒，包括用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)?；趓s7597593位點和rsl344706位點的聯(lián)合基因型，如果受試者為風(fēng)險基因型(AArs7597593_AArsl3447Q6、AArs75g75g3_ACrsl344706' AGrs7597593_AArsl3447(l6)、其大腦左側(cè)感運動皮層的灰質(zhì)體積高，如果受試者為保護基因型(AGre7597593-CC；sl3447(l6、GGrs7597593-ACrsl344706>GGrS7597593_CCrsl344706)、其大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體低。大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積高具體體現(xiàn)為受試者大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積大于正常受試者或具有統(tǒng)計學(xué)意義的正常受試者的平均值。大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體低具體體現(xiàn)為受試者大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積為正常受試者或具有統(tǒng)計學(xué)意義的正常受試者的平均值以下。以上任一所述用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)為序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
[0016]以上任一所述用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)為序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
[0017]以上任一所述rs7597593位點位于ZNF804A基因中，具體來說為序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子自5’末端第501位核苷酸。
[0018]以上任一所述rsl344706位點位于ZNF804A基因中，具體來說為序列表的序列6所不的雙鏈DNA分 子自5’末端第465位核苷酸。
[0019]本發(fā)明還保護一種引物組，由引物對甲和引物對乙組成；所述引物對甲為序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對；所述引物對乙為序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成的引物對。[0020]本發(fā)明有助于預(yù)防海洛因成癮疾病，有助于對海洛因成癮者進行有效的干預(yù)，有助于開發(fā)新的針對海洛因成癮者的藥物，具有重大的應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為保護基因型、中間基因型和風(fēng)險基因型受試者的IGT得分結(jié)果(實施例2中的結(jié)果圖)。
[0022]圖2為保護基因型、中間基因型和風(fēng)險基因型受試者的大腦左側(cè)感覺運動皮層灰質(zhì)體積的結(jié)果(實施例3中的結(jié)果圖)。
【具體實施方式】
[0023]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0024]海洛因成癮者來源于戒毒中心，均為知情同意的志愿者。入選標準:(I)漢族，其父母均為中國南方人(南方即長江以南)；(2)符合美國精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊第四版(DSM-1V )阿片類物質(zhì)成癮診斷標準，吸食海洛因，靜脈注射給藥，除海洛因外沒有濫用其它成癮性物質(zhì)(如大 麻、甲基苯丙胺類物質(zhì)、氯胺酮等)。排除標準:(I)重大疾病史(如心血管疾病，內(nèi)分泌疾病，腫瘤疾病，自身免疫疾病等)；(2)有過精神疾病史。
[0025]正常受試者通過廣告、電話等方法招募，均為知情同意的志愿者。入選標準:(I)漢族，其父母均為中國南方人(南方即長江以南)；(2)無成癮性物質(zhì)使用史。排除標準:
(I)重大疾病史(如心血管疾病，內(nèi)分泌疾病，腫瘤疾病，自身免疫疾病等)；(2)有過精神疾病史。
[0026]rs7597593-upper(序列表的序列 I):5’ -ATGTCTATGGAAATAATAAG-3’ ；
[0027]rs7597593-lower(序列表的序列 2):5’ -TACCAATTCTCGGGCAATAC-3’。
[0028]rsl344706-upper(序列表的序列 3):5’ -TCAAAGCCTTATCTCTTCAC-3’ ；
[0029]rsl344706-lower (序列表的序列 4):5’ -CCAGATAGATATCCAAGAAG-3’。
[0030]實施例1、檢測受試者rs7597593位點的核苷酸、rsl344706位點的核苷酸、獲得受試者群體基于rs7597593位點和rsl344706位點的聯(lián)合基因型
[0031]1、提取受試者的外周靜脈血的基因組DNA。
[0032]2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，采用rs7597593_upper和rs7597593_lower組成的特異引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0033]3、將步驟2的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，從而獲知受試者基于rs7597593位點的基因型。測序結(jié)果表明，PCR擴增產(chǎn)物均為ZNF804A基因中的靶序列，不存在其它非特異性擴增，即對于所述特異引物對來說，人基因組中不存在其它可以擴增的靶點，特異性良好。
[0034]4、以步驟I提取的基因組DNA為模板，采用rsl344706_upper和rsl344706_lower組成的特異引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0035]5、將步驟4的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，從而獲知受試者基于rsl344706位點的基因型。測序結(jié)果表明，PCR擴增產(chǎn)物均為ZNF804A基因中的靶序列，不存在其它非特異性擴增，即對于所述特異引物對來說，人基因組中不存在其它可以擴增的靶點，特異性良好。[0036]兩個不同群體(海洛因成癮者群體和正常受試者群體)中:rs7597593位點存在A/G多態(tài)，等位基因A的分布頻率見表1 ;rsl344706位點存在A/C多態(tài)，等位基因A的分布頻率見表1。分布頻率統(tǒng)計結(jié)果經(jīng)過Bonferroni矯正。
[0037]表1兩個不同群體中rs7597593位點和rsl344706位點等位基因A的分布頻率
[0038]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)在制備用于評估海洛因成癮風(fēng)險性的試劑盒中的應(yīng)用。
2.用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)在制備用于評估海洛因成癮者的沖動抉擇行為損害程度的試劑盒中的應(yīng)用。
3.用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)在制備用于評估海洛因成癮者的大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積的試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種用于評估海洛因成癮風(fēng)險性的試劑盒,包括用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)。
5.一種用于評估海洛因成癮者的沖動抉擇行為損害度的試劑盒，包括用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)。
6.一種用于評估海洛因成癮者的大腦左側(cè)感覺運動皮層的灰質(zhì)體積的試劑盒，包括用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)和用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求1或2或3所述的應(yīng)用，或如權(quán)利要求4或5或6所述的試劑盒，其特征在于:所述用于檢測rs7597593位點核苷酸的物質(zhì)為序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對；所述用于檢測rsl344706位點的核苷酸的物質(zhì)為序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
8.一種引物組，由引物對甲和引物對乙組成；所述引物對甲為序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對；所述引物對乙為序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
【文檔編號】C12N15/11GK104004841SQ201410227778
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】時杰, 孫艷, 胡蝶, 梁潔, 陸林, 王貴彬, 朱維莉 申請人:北京大學(xué)