一種白色鏈霉菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)ε-聚L-賴氨酸的白色鏈霉菌Ls2，其保藏號(hào)為CGMCC?NO.8472，在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落為白色絲狀，邊緣干燥中央塌陷；鏡檢細(xì)胞為桿狀，無隔斷，長(zhǎng)度1.0-3.0mm；革蘭氏陰性；在20-40℃的溫度下均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28-30℃；生長(zhǎng)pH范圍為3.0-9.5，最適生長(zhǎng)pH為6.8-7.2；需氧生長(zhǎng)；碘化鉍鉀實(shí)驗(yàn)生成橙紅色沉淀，甲基橙實(shí)驗(yàn)生成橙色沉淀。本發(fā)明還涉及白色鏈霉菌Ls2在制備ε-聚L-賴氨酸的應(yīng)用。
【專利說明】一種白色鏈霉菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)聚賴氨酸的白色鏈霉菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] ε -聚L-賴氨酸（ε -PL)是必需氨基酸L-賴氨酸通過α -羧基和ε -氨基形成 的同聚物，是一種具有抑菌功效的多肽，抑菌譜廣，對(duì)于酵母菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性 菌和霉菌均有明顯的抑菌效果。ε -PL能在人體內(nèi)分解為賴氨酸，是人體必需的8種氨基 酸之一，世界各國均允許在食品中強(qiáng)化賴氨酸，因此，ε -PL是一種營(yíng)養(yǎng)型的抑菌劑。ε -PL 在食品添加劑領(lǐng)域作為天然食品防腐劑正日益受到人們的重視，其安全性明顯高于其他的 化學(xué)防腐劑。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)已知可以利用白色鏈霉菌生產(chǎn)ε-PL，但多存在白色鏈霉菌對(duì)培養(yǎng)條件 要求高、生長(zhǎng)速度慢、ε -PL產(chǎn)量低以及分離純化工藝復(fù)雜等缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種能夠產(chǎn)生聚賴氨酸的白色鏈霉菌（Streptomyces albus)Ls2， 其能夠代謝產(chǎn)生ε -聚L-賴氨酸（ε -PL)，從而能夠用于生產(chǎn)ε -PL。
[0005] 本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 保藏，保藏號(hào)為CGMCC N0. 8472,保藏時(shí)間為2013年11月15日，其16SrDNA片段長(zhǎng)度為 1462bp，具體如SEQ ID N〇:l所示。BLAST檢索發(fā)現(xiàn)菌種Ls2與白色鏈霉菌基因組序列的同 源性很高，達(dá)到99 %，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化性狀的鑒定結(jié)果，可以確認(rèn)本發(fā)明的菌種Ls2 為白色鏈霉菌（Streptomyces albus)。
[0006] 本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2從采自杭州的土壤中篩選分離得到，在高氏一號(hào)固體培 養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落為白色絲狀，邊緣干燥中央塌陷；鏡檢細(xì)胞為桿狀，無隔 斷，長(zhǎng)度1. 0-3. 0mm ;革蘭氏陰性；在20-40°C的溫度下均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28-30°C; 生長(zhǎng)pH范圍為3. 0-9. 5,最適生長(zhǎng)pH為6. 8-7. 2 ;需氧生長(zhǎng)；碘化鉍鉀實(shí)驗(yàn)生成橙紅色沉 淀，甲基橙實(shí)驗(yàn)生成橙色沉淀；高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖50份，氯化鈉0. 5 份，硝酸鉀1份，磷酸氫二銨0. 5份，硫酸鎂0. 5份，硫酸亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫 酸鋅0. 01份，酵母膏0. 1份，瓊脂粉15份和水1000份。
[0007] 本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2能夠代謝產(chǎn)生ε -聚L-賴氨酸，因此，本發(fā)明還涉及白 色鏈霉菌Ls2在生產(chǎn)ε-聚L-賴氨酸中的應(yīng)用。本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2代謝所產(chǎn)生的 ε -PL具有很強(qiáng)的抑菌性，分子量大約在3KDa左右，可廣泛應(yīng)用于食品防腐劑和藥物載體 等其他領(lǐng)域。
[0008] 本發(fā)明還涉及生產(chǎn)ε -聚L-賴氨酸的方法，其包括如下步驟：
[0009] (1)將白色鏈霉菌Ls2的試管種接種于液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為 28-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天，獲得發(fā)酵液，在培養(yǎng)過程中無需調(diào)節(jié)pH值；
[0010] 液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以重量份計(jì)為：
[0011] 酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸銨10份，硫酸亞鐵0. 03份，硫酸鎂0. 5份，硫酸鋅 〇. 04份，磷酸氫二鉀0. 8份，磷酸二氫鉀1. 36份，和水1000份；
[0012] 制備液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的方法為：稱取酵母膏、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸 鋅、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀放入水中，充分混勻后將pH值調(diào)節(jié)至6.8,121°C濕熱滅菌20分 鐘，然后再加入經(jīng)單獨(dú)滅菌的葡萄糖水溶液，混勻冷卻后備用；
[0013] (2)將發(fā)酵液離心，取上清液用lmol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至8,靜置0· 5h 后用濾紙過濾去除沉淀，得濾液；
[0014] (3)用弱酸性陽離子交換樹脂HD-2對(duì)濾液進(jìn)行震蕩吸附8-16h，優(yōu)選12h，例如可 以搖床震蕩，150r · min-1，其中，濾液要浸過樹脂，并高于樹脂約3厘米，靜置0. 5-lh后過 濾，將樹脂用蒸餾水沖洗3-5次，然后用0. lmol/L的HC1溶液對(duì)樹脂進(jìn)行震蕩洗脫8-16h， 優(yōu)選12h，靜置0. 5-lh后過濾，用lmol/L的NaOH溶液將洗脫液的pH值調(diào)節(jié)至6. 5,然后減 壓濃縮得濃縮液；
[0015] (4)在濃縮液中加入乙醇乙醚體積比為2:1的混合液，濃縮液與乙醇乙醚混合液 的體積比大約為1:10,混勻，過濾除去液體，保留沉淀物，即ε -聚L-賴氨酸，經(jīng)檢測(cè)，其純 度達(dá)80%，產(chǎn)量達(dá)0.6克/L發(fā)酵液。將所得的ε-聚L-賴氨酸溶于去離子水中，用G-250 柱進(jìn)行吸附解析，可得純度超過98%的ε -聚L-賴氨酸，產(chǎn)量達(dá)0. 42克/L發(fā)酵液。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：⑴本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2適應(yīng)環(huán)境的能力強(qiáng)，在 pH3. 0-9. 5和溫度為20-40°C條件下均能很好地生長(zhǎng)，并產(chǎn)生ε -聚L-賴氨酸，從而在生產(chǎn) 賴氨酸的過程中無需監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝；（2)本發(fā)明的白色鏈霉 菌Ls2能夠快速產(chǎn)生ε -聚L-賴氨酸，培養(yǎng)時(shí)間僅需2-3天，降低了生產(chǎn)成本；(3)本發(fā) 明的白色鏈霉菌Ls2以葡萄糖為碳源，以酵母膏和硫酸銨為氮源，培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，價(jià)格低 廉，便于后期對(duì)ε -聚L-賴氨酸的分離純化；(4)本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2生產(chǎn)的ε -聚 L-賴氨酸性質(zhì)穩(wěn)定，分子量在3KDa左右，抑菌效果好，且穩(wěn)定性好，不易降解。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0017] 圖1 :本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2在含有染料亞甲基藍(lán)的選擇性培養(yǎng)基中產(chǎn)生排斥 圈；
[0018] 圖2 :本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2的搖瓶發(fā)酵液在碘化鉍鉀實(shí)驗(yàn)中生成橙紅色沉淀， 其中，第1個(gè)試管為發(fā)酵液；第2個(gè)試管為在不產(chǎn)聚賴氨酸菌種的發(fā)酵液中加入碘化鉍鉀試 齊U ;第3個(gè)試管為在白色鏈霉菌Ls2發(fā)酵液中加入碘化鉍鉀試劑；第4個(gè)試管為在水溶聚賴 氨酸標(biāo)準(zhǔn)品中加入碘化鉍鉀試劑；
[0019] 圖3 :本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2分別對(duì)革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌（圖3a)和革 蘭氏陰性大腸桿菌（圖3b)的抑菌試驗(yàn)；
[0020] 圖4 :本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2的16SrDNA PCR后瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1.白色鏈霉菌Ls2的分離和保藏
[0022] 本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2通過如下步驟分離得到：
[0023] (1)利用富集培養(yǎng)基對(duì)采自杭州的土壤中的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 28-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為6-7天，得到邊緣干燥中央塌陷的白色放線菌。
[0024] 富集培養(yǎng)基的組成以重量份計(jì)為：
[0025] 可溶性淀粉20份，氯化鈉0. 5份，硝酸鉀1份，磷酸氫二鉀0. 5份，硫酸鎂0. 5份， 硫酸亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫酸鋅0. 01份，酵母膏0. 1份，重鉻酸鉀0. 05份，瓊脂 粉15份，和水1000份。
[0026] 制備富集培養(yǎng)基的方法為：稱取可溶性淀粉、氯化鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸 鎂、硫酸亞鐵、硫酸銨、硫酸鋅、酵母膏、重鉻酸鉀和瓊脂粉放入水中，充分混勻后將pH值調(diào) 節(jié)至7. 0-7. 2,121°C濕熱滅菌20分鐘，冷卻后備用。
[0027] (2)利用選擇性培養(yǎng)基篩選產(chǎn)物中含有帶正電物質(zhì)的菌種。將含染料亞甲基藍(lán)的 選擇性培養(yǎng)基滅菌后，倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用劃線法進(jìn)行接種。培養(yǎng)溫度為28-30°C， 培養(yǎng)時(shí)間為6-7天，結(jié)果如圖1所示，周圍存在排斥圈的菌落其產(chǎn)物中含有帶正電物質(zhì)。挑 選單菌落在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線純化，純化菌株于4°C保存。
[0028] 選擇性培養(yǎng)基的組成以重量份計(jì)為：
[0029] 葡萄糖50份，氯化鈉0. 5份，硝酸鉀1份，磷酸氫二銨0. 5份，硫酸鎂0. 5份，硫酸 亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫酸鋅0. 01份，酵母膏0. 1份，亞甲基藍(lán)0. 02份，瓊脂粉15 份，和水1000份。
[0030] 制備選擇性培養(yǎng)基的方法為：稱取氯化鈉、硝酸鉀、磷酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸亞 鐵、硫酸銨、硫酸鋅、酵母膏、亞甲基藍(lán)和瓊脂粉放入適量水中，充分混勻后將pH值調(diào)節(jié)至 7. 0-7. 2,121°C濕熱滅菌20分鐘，然后再加入經(jīng)單獨(dú)滅菌的葡萄糖水溶液，混勻冷卻后備 用。
[0031] 本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落 為白色絲狀，邊緣干燥中央塌陷；鏡檢細(xì)胞為桿狀，無隔斷，長(zhǎng)度1. 0-3. 0mm ;革蘭氏陰性； 在20-40°C的溫度下均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28-30°C;生長(zhǎng)pH范圍為3. 0-9. 5,最適生長(zhǎng) pH為6. 8-7. 2 ;需氧生長(zhǎng)；碘化鉍鉀實(shí)驗(yàn)生成橙紅色沉淀（結(jié)果如圖2所示），甲基橙實(shí)驗(yàn) 生成橙色沉淀。高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖50份，氯化鈉0. 5份，硝酸鉀1份， 磷酸氫二銨〇. 5份，硫酸鎂0. 5份，硫酸亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫酸鋅0. 01份，酵母 膏〇. 1份，瓊脂粉15份和水1000份。
[0032] 本發(fā)明的白色鏈霉菌Ls2在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保 藏，保藏號(hào)為CGMCC N0. 8472,保藏時(shí)間為2013年11月15日。
[0033] 實(shí)施例2.利用白色鏈霉菌Ls2生產(chǎn)ε -聚L-賴氨酸
[0034] (1)將白色鏈霉菌Ls2的試管種接種于液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為 28_30°C，培養(yǎng)時(shí)間為2天，獲得發(fā)酵液，在培養(yǎng)過程中無需調(diào)節(jié)pH值；
[0035] 液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以重量份計(jì)為：
[0036] 酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸銨10份，硫酸亞鐵0. 03份，硫酸鎂0. 5份，硫酸鋅 〇. 04份，磷酸氫二鉀0. 8份，磷酸二氫鉀1. 36份，和水1000份；
[0037] 制備液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的方法為：稱取酵母膏、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸 鋅、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀放入適量水中，充分混勻后將pH值調(diào)節(jié)至6. 8,121°C濕熱滅菌 20分鐘，然后再加入經(jīng)單獨(dú)滅菌的葡萄糖水溶液，混勻冷卻后備用；
[0038] (2)將發(fā)酵液離心，取上清液用lmol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至8,靜置0· 5h 后用濾紙過濾去除沉淀，得濾液；
[0039] (3)取20ml的濾液加入到裝有大約5g弱酸性陽離子交換樹脂HD-2的100ml三角 瓶中，其中，濾液要浸過樹脂，并高于樹脂約3厘米，放置在搖床中，150r · min-1震蕩吸附 12h，，然后靜置0. 5h，過濾，將樹脂用適量蒸餾水沖洗4次，重新放入100ml三角瓶中，再加 入20ml0. lmol/L的HC1溶液，放置在搖床中，震蕩洗脫12小時(shí)。用lmol/L的NaOH溶液將 洗脫液的pH值調(diào)節(jié)至6. 5,然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；
[0040] (4)在濃縮液中加入乙醇乙醚的混合液（體積比2:1)，不斷的向濃縮液中添加乙 醇乙醚的混合溶液，直至不在有沉淀析出，邊加混合液，邊震蕩，濃縮液與乙醇乙醚混合液 的體積比例大約為1:10?；靹?，過濾除去液體，沉淀物即ε-聚L-賴氨酸，經(jīng)檢測(cè)，其純度 達(dá)80 %，產(chǎn)量為0. 6克/L發(fā)酵液。
[0041] 實(shí)施例3· ε -聚L-賴氨酸的純化和檢測(cè)
[0042] 將實(shí)施例2所得的ε -聚L-賴氨酸溶于去離子水中，用G-250柱進(jìn)行吸附解析， 可得純度超過98%的ε-聚L-賴氨酸，產(chǎn)量為0.42克/L發(fā)酵液。通過SDS-PAGE電泳，可 知該 ε _聚L-賴氨酸的分子量大約為3000Da。
[0043] 取實(shí)施例2所得的ε -聚L-賴氨酸用去離子水溶解，制成濃度為0. 1克/升的溶 液，進(jìn)行濾紙片抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯抑制作用， 如圖3a和3b所示。
[0044] 將實(shí)施例2所得的ε -聚L-賴氨酸存放于4°C冰箱中1個(gè)月后，分子量和抑菌性 能均沒有變化。
[0045] 實(shí)施例4
[0046] 使用DNA提取試劑盒進(jìn)行菌種總DNA的提取。以菌種Ls2的總DNA為模板，上游 引物 P1 :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物 P2 :5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，對(duì) 16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增提取，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，16SrDNA片段長(zhǎng)度為1500bp左右， 結(jié)果如圖4所示。對(duì)膠進(jìn)行回收純化后測(cè)序，結(jié)果表明，菌種Ls2的DNA為1462,具體如 SEQ ID No :1所示。BLAST檢索發(fā)現(xiàn)菌種Ls2與白色鏈霉菌基因組序列的同源性很高，達(dá)到 99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化性狀的鑒定結(jié)果，可以確認(rèn)菌種Ls2為白色鏈霉菌。
[0047] SEQ ID Nol ：
[0048] 〈110>北京化工大學(xué)
[0049] 〈120>-種白色鏈霉菌及其應(yīng)用
[0050] <160>1
[0051] <210>1
[0052] <211>1462
[0053] <212>DNA
[0054] 〈213> 白色鏈霉菌（Streptomyces albus)
[0055] <400>1
[0056] CGGGGCTGCTCTTGTTCGACTTCGTCCAATCGCCAGTCCCACCTTCGACGATTCCCTCCCACAAGGGGT TGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACC GCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGAC CGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAG ACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGTGAGTCCCCAT CACCCCGAAAGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACG AGCTGACGACAGCCACGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGACCGTGTCTCCACGGTTTTCCGGTGTATGTCA AGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT TTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTTAGCTGCGGCACGGACGACGTGGATG TCCCCACACCTAGTTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCRC TCCTACAGCGTCAGWATCGGCCCARAKATCCGCYTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATGTGCGCATTTCACCGCT ACACCAGGAAATCCGATCTCCCCTACCGAGCTCTAGCCTGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGC TTTCACATCCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTCGCGCCCTACGTAT TACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTC TGCAGGTACCGTCACTCTCGCTTCTTCCCTGCTGAAA GAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCC CACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCG TCGTCGCCTTGGTGAGCCACTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTTCACCGCCGGAGCTTTCCA CACGGAGATCATGCGACCCCGTGTCATATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGA TTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCTCCCGAAGGAGGTTCATCGTCGACTGCATGGTAGACCCG CCACTGGT
【權(quán)利要求】
1. 一種白色鏈霉菌（Streptomyces albus) Ls2,其特征在于，其保藏號(hào)為CGMCC NO. 8472。
2. 如權(quán)利要求1所述的白色鏈霉菌Ls2,其特征在于，其在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上單 細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落為白色絲狀，邊緣干燥中央塌陷；鏡檢細(xì)胞為桿狀，無隔斷，長(zhǎng)度 1. 0-3. Omm ;革蘭氏陰性；在20-40°C的溫度下均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28-30°C ;生長(zhǎng)pH 范圍為3. 0-9. 5,最適生長(zhǎng)pH為6. 8-7. 2 ;需氧生長(zhǎng)；碘化鉍鉀實(shí)驗(yàn)生成橙紅色沉淀，甲基 橙實(shí)驗(yàn)生成橙色沉淀；其中，所述高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖50份，氯化鈉0. 5 份，硝酸鉀1份，磷酸氫二銨0. 5份，硫酸鎂0. 5份，硫酸亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫酸 鋅〇. 01份，酵母膏〇. 1份，瓊脂粉15份和水1000份。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的白色鏈霉菌Ls2在生產(chǎn)ε-聚L-賴氨酸中的應(yīng)用。
4. 一種生產(chǎn)ε-聚L-賴氨酸的方法，其包括如下步驟： (1) 將如權(quán)利要求1或2所述的白色鏈霉菌Ls2的試管種接種于液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)溫度為28-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天，獲得發(fā)酵液，在培養(yǎng)過程中無需調(diào)節(jié)pH值； 其中，液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以重量份計(jì)為： 酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸銨10份，硫酸亞鐵0. 03份，硫酸鎂0. 5份，硫酸鋅0. 04 份，磷酸氫二鉀〇. 8份，磷酸二氫鉀1. 36份，和水1000份； 制備液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的方法為：稱取酵母膏、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸鋅、 磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀放入水中，充分混勻后將pH值調(diào)節(jié)至6.8,121°C濕熱滅菌20分鐘， 然后再加入經(jīng)單獨(dú)滅菌的葡萄糖水溶液，混勻冷卻后備用； (2) 將發(fā)酵液離心，取上清液用lmol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至8,靜置0. 5h后 用濾紙過濾去除沉淀，得濾液； (3) 用弱酸性陽離子交換樹脂HD-2對(duì)濾液進(jìn)行震蕩吸附8-16h，其中，濾液浸過樹脂并 高于樹脂約3厘米，靜置0. 5-lh后過濾，將樹脂用蒸餾水沖洗3-5次，然后用0. lmol/L的 HC1溶液對(duì)樹脂進(jìn)行震蕩洗脫8-16h，靜置0. 5-lh后過濾，用lmol/L的NaOH溶液將洗脫液 的pH值調(diào)節(jié)至6. 5,然后減壓濃縮得濃縮液； (4) 在濃縮液中加入乙醇乙醚體積比為2:1的混合液，其中，濃縮液與乙醇乙醚混合液 的體積比大約為1:10,混勻，過濾除去液體，沉淀即ε-聚L-賴氨酸。
【文檔編號(hào)】C12P13/02GK104120095SQ201410216869
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】羅施中, 劉欣, 高紅柳, 陳慧 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)