一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物，所述方法主要包括：從待測乳制品中提取總DNA；以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物為SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2；對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。本發(fā)明的方法還可包括制作熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將擴(kuò)增結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對計(jì)算出待測樣品中大腸菌群細(xì)菌的活菌數(shù)。本發(fā)明的引物具有較高的特異性和靈敏性，本發(fā)明的方法可以快速、準(zhǔn)確的完成乳制品中大腸菌群的定量測定。
【專利說明】—種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物，具體是一種熒光定量PCR檢測方法及該方法中所用的特異性引物，屬于細(xì)菌檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸菌群(Coliform bacteria)是一群在37°C 24小時能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，主要包括腸桿菌科的四個屬即大腸埃希氏菌屬(Escherichia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和陰溝腸桿菌屬(EnteiObacter)。大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。大腸菌群廣泛存在于人和溫血動物的腸道，并隨糞便分布于自然界。大腸菌群既是糞便污染的指示菌，又是腸道致病菌污染食品的指示菌，是世界上大多數(shù)國家和組織評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要安全性指標(biāo)之一，在食品微生物指標(biāo)體系中占有舉足輕重的地位。
[0003]我國的食品衛(wèi)生微生物標(biāo)準(zhǔn)體系主要由菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三大類構(gòu)成。大腸菌群的傳統(tǒng)檢測和計(jì)數(shù)方法有多管發(fā)酵法(MTF)和濾膜法(MF)。MTF是食品大腸菌群檢測公認(rèn)的傳統(tǒng)方法，其原理是依據(jù)大腸菌群能夠發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特點(diǎn)，將樣品進(jìn)行系列倍比稀釋，接種到含有乳糖的培養(yǎng)基中，進(jìn)行初發(fā)酵試驗(yàn)，觀察產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。MTF優(yōu)點(diǎn)是不需昂貴的儀器設(shè)備，經(jīng)過基本微生物學(xué)培訓(xùn)的技術(shù)員即可操作；缺點(diǎn)是耗時費(fèi)力，樣品需要作系列稀釋，加上復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)大約需要96h。MF已在許多國家作為水質(zhì)微生物檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，核心是使用0.45 μ m的過濾膜過濾水樣，將細(xì)菌截流在膜上，然后把膜放在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，計(jì)數(shù)膜上生長出的典型細(xì)菌集落。MF主要用于測定水中大腸菌群，雖然較MTF快，總需約48~72h，但僅適用于雜質(zhì)較少的水體。
[0004]乳制品富含蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，在生產(chǎn)、運(yùn)輸、加工和貯藏過程中，如果操作不當(dāng)，極易受到大腸菌群的污染。統(tǒng)計(jì)顯示，在影響中國食品安全的諸因素中，微生物污染高居首位。世界各國普遍將大腸菌群作為食品的細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)之一，并且都對此衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)有明確規(guī)定，其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到產(chǎn)品的品質(zhì)和食品企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，更關(guān)系到所有消費(fèi)者的健康。乳 制品企業(yè)大腸菌群的通用檢測方法是國標(biāo)方法，經(jīng)過系列稀釋、初發(fā)酵試驗(yàn)、復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證等步驟，得出檢驗(yàn)結(jié)果至少需要3-5天時間，對于貨架期較短的食品非常不便。因此，提高大腸菌群檢測的精確度和縮短檢測時間是控制和保障食品安全的重要手段。
[0005]自1985年聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)問世以來，這一技術(shù)逐漸推廣應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。因其具備快速、特異、靈敏、操作簡便的特性，目前已被廣泛應(yīng)用于各種致病微生物的檢測領(lǐng)域。但是常規(guī)PCR只能對終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，必須在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，費(fèi)時費(fèi)事，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時檢測，因此常規(guī)PCR難以用于微生物的定量分析。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，是DNA定量技術(shù)的一次飛躍，其主要是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)具有檢測精度、靈敏度高，檢測重復(fù)性好和線性范圍廣，操作簡單、安全、自動化程度高，檢測速度快、效率高等明顯的優(yōu)越性，是目前世界上公認(rèn)的用于醫(yī)學(xué)臨床及生物學(xué)研究的最先進(jìn)的核酸分子檢測手段，已被世界各國研究機(jī)構(gòu)承認(rèn)并推崇。
[0006]然而，對于乳制品而言，通常成分復(fù)雜，其中可能含有多種抑制PCR反應(yīng)的成分，且乳制品中大腸菌群限量指標(biāo)較低，如何設(shè)計(jì)具有較高特異性和靈敏性的引物成為分子生物學(xué)技術(shù)檢測乳制品中大腸菌群的一個關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個目的在于提供一種利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測乳制品中大腸菌群的方法，以縮短乳制品中大腸菌群的檢測時間，提高檢測準(zhǔn)確性，且可以定量地檢測乳制品中大腸菌群。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于分子生物學(xué)技術(shù)檢測乳制品中大腸菌群的特異性引物。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供了一種用于分子生物學(xué)技術(shù)檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒，其中包含本發(fā)明所述的引物。
[0010]為達(dá)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測乳制品中大腸菌群的方法，該方法主要包括:
[0011]從待測乳制品樣 品中提取總DNA ；
[0012]以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物為SEQID N0.1 與 SEQ ID N0.2 ；
[0013]對上述擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。
[0014]如前所述，通常，乳制品中成分復(fù)雜，可能含有多種抑制PCR反應(yīng)的成分，且乳制品中大腸菌群限量指標(biāo)較低，設(shè)計(jì)大腸菌群特異性引物是本發(fā)明的分子生物學(xué)檢測技術(shù)的
關(guān)鍵之一。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本案發(fā)明人研究了乳制品大腸菌群的污染狀況，對乳制品中大腸菌群進(jìn)行鑒定和分類，將從大量常見乳制品大腸菌群陽性樣品中分離到的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)、革蘭氏染色、生理生化及16S rRNA基因序列分析分類鑒定，最終設(shè)計(jì)了本發(fā)明的大腸菌群特異性引物。所設(shè)計(jì)的大腸菌群特異性引物為:
[0016]E.coli F:5，-CACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3，(SEQ ID N0.1)；
[0017]E.coli R:5’-GAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0018]本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對SEQ ID N0.1與SEQ ID N0.2，具有較高的特異性。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，利用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對，以大腸菌群四個菌屬標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板，同時以腸炎沙門氏菌和痢疾志賀氏菌基因組DNA為陰性對照，另以活性菌乳制品中常見的益生菌動物雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌基因組DNA為陰性對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果表明，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對只能擴(kuò)增出大腸菌群四個菌屬標(biāo)準(zhǔn)株，不能擴(kuò)增出對比菌株，表明該引物特異性非常好。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，由于通常乳制品成分復(fù)雜，其中可能含有多種抑制PCR反應(yīng)的成分，乳制品中大腸菌群限量指標(biāo)較低，為有效提取乳制品中大腸菌群DNA，本發(fā)明進(jìn)一步對相關(guān)提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟:
[0020]將待測乳制品樣品進(jìn)行増菌培養(yǎng)；
[0021]増菌培養(yǎng)后的樣品離心，收集沉淀，加入TE緩沖液重懸，液氮凍融；加入SDS和蛋白酶K，37°C搖床4h以上；
[0022]加入CTAB提取緩沖液消化；
[0023]用酚仿法抽提；
[0024]加入異丙醇沉淀富集DNA。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的更具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，樣品經(jīng)增菌培養(yǎng)后，才能有效提取到樣品中可能存在的大腸菌群DNA模板并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，適宜的培養(yǎng)時間是提高檢測準(zhǔn)確性、有效判別樣品是否符合相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵。本案發(fā)明人對多種常見的需檢測大腸菌群的乳制品包括奶粉、液態(tài)中性乳及乳飲料、酸奶、酸乳飲料、含乳蛋白的冷凍飲品等進(jìn)行了摸索性實(shí)驗(yàn)，最終確定了以下適宜的增菌培養(yǎng)條件:
[0026]對于液態(tài)的待測乳制品樣品(例如，液態(tài)中性乳及乳飲料、酸性乳及乳飲料、含乳蛋白的冷凍飲品料液)，可按照30~50mL待測乳制品樣品:250~350mL營養(yǎng)肉湯的比例進(jìn)行混合，于37 ± I °C生化培養(yǎng)箱中増菌培養(yǎng)4~6h ;
[0027]固態(tài)的乳制品樣品(例如，奶粉)，可按照30~50g待測乳制品樣品:250~350mL營養(yǎng)肉湯的比例進(jìn)行混合，于37±1°C生化培養(yǎng)箱中増菌培養(yǎng)4~6h。
[0028]上述增菌培養(yǎng)條件對于目前常見乳制品中大腸菌群的存在范圍是適用的，特別是，按照上述條件增菌培養(yǎng)后并按照本發(fā)明的方法進(jìn)行定量檢測時，檢測結(jié)果具有較高的檢測準(zhǔn)確性。
[0029]例如，在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，待測乳制品為含乳蛋白的冷凍飲品，在該方案中，增菌培養(yǎng)時可按照30mL含乳蛋白的冷凍飲品料液:300mL營養(yǎng)肉湯的比例進(jìn)行混合，于37°C生化培養(yǎng)箱中増菌培養(yǎng)5h ;之后按照本發(fā)明的方法提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。如果待測樣品中大腸菌群數(shù)量超過相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的最高限量指標(biāo)(GB2759.1-2003中大腸菌群限量指標(biāo)為450MPN/100mL)，則經(jīng)過上述增菌培養(yǎng)后可有效提取到DNA模板并經(jīng)后續(xù)PCR擴(kuò)增被檢測出來。即，在該實(shí)施方案中，如果按照該方法增菌培養(yǎng)并提取DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測后，當(dāng)?shù)陀跓晒舛縋CR檢測限時，則含乳蛋白的冷凍飲品中大腸菌群數(shù)< 450MPN/100mL，符合相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。
[0030]對于不同種類的乳制品樣品，相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中大腸菌群限量指標(biāo)不同，如僅需簡單的定性或半定量檢測，可先用大腸菌群數(shù)為衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中大腸菌群限量指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行增菌培養(yǎng)并提取DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測，確定能夠達(dá)到熒光定量PCR檢測限的最短培養(yǎng)時間。
[0031]根 據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，増菌培養(yǎng)后的樣品離心、重懸、加入SDS和蛋白酶K破裂細(xì)胞降解蛋白質(zhì)的過程可以參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。本發(fā)明中優(yōu)選的具體操作可以為:取増菌培養(yǎng)的樣品lmL，12000g，4°C離心10min，收集菌體沉淀；加入500 μ L TE緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次；加入80μ L10% SDS 和 1(^1^011^/11^蛋白酶1(，371:搖床411 以上。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，加入CTAB提取緩沖液消化的過程也可參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。本發(fā)明中優(yōu)選的具體操作可以為:加入 100μ L5M NaCl 溶液及 80μ L10mol/L CTAB 溶液，65°C水浴 20min。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，用酚仿法抽提的過程也可參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。本發(fā)明中優(yōu)選的具體操作可以為:用等體積酹:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提，12000g,4°C離心10min,取上清；之后再用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，酚仿法抽提后的樣品加入異丙醇沉淀富集DNA。該操作也可參照本領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。本發(fā)明中優(yōu)選的具體操作可以為:采用異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，自然干燥，50yL TE溶解備用。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的更具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟:
[0036]按照30~50mL待測乳制品液態(tài)樣品:250~350mL營養(yǎng)肉湯的比例，或者30~50g待測乳制品固態(tài)樣品:250~350mL營養(yǎng)肉湯的比例進(jìn)行混合，于37土1°C生化培養(yǎng)箱中増菌培養(yǎng)4~6h ;更優(yōu)選地，是按照30mL待測乳制品液態(tài)樣品:300mL營養(yǎng)肉湯的比例，或者30g待測乳制品固態(tài)樣品:300mL營養(yǎng)肉湯的比例進(jìn)行混合，于37°C生化培養(yǎng)箱中増菌培養(yǎng)5h ；
[0037]取増菌培養(yǎng)5h的樣品lmL，12000g，4°C離心10min，收集菌體沉淀；
[0038]加入500 μ L TE 緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次；
[0039]加入80yL10% SDS 和 10 μ L20mg/mL 蛋白酶 K，37°C搖床 4h 以上；
[0040]加入100 μ L5M NaCl 溶液及 80 μ L10mol/L CTAB 溶液，65°C水浴 20min ；
[0041]用等體積酌.:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提，12000g, 4?離心10min,取上清；
[0042]用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清；
[0043]采用異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，自然干燥，50 μ L TE溶解備用。
[0044]本發(fā)明的上述方法特別適合于從乳制品中提取大腸桿菌DNA，采用ND-1000微量紫外/可見分光光度計(jì)測定提取的基因組DNA的濃度，結(jié)果260nm/280nm的比值在1.8~
2.0之間，表明提取的基因組DNA質(zhì)量非常好。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，是需要定量測定乳制品樣品中的大腸菌群。在該實(shí)施方案中，所述PCR為熒光定量PCR，優(yōu)選的擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:
[0046]反應(yīng)體系:10μ mol/L 上下游引物各 0.4 μ L, DNA 模板 2 μ L, Passive ReferenceDye:0.4 μ L, 2 X TransStart Green qPCR SuperMix: 10 μ L, ddH20 補(bǔ)足至 20 μ L ;
[0047]擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性20s ;40個循環(huán)，95°C變性5s，62°C退火30s，72°C延伸40s。
[0048]本發(fā)明的方法，可適用于檢測液態(tài)乳制品(例如中性液態(tài)乳、中性乳飲料、酸性乳及乳飲料等)、奶粉、冷飲、酸奶等乳制品。
[0049]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，所述PCR為熒光定量PCR，該方法還包括制作熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、并將擴(kuò)增結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對計(jì)算出待測樣品中大腸菌群細(xì)菌的活菌數(shù)的過程。
[0050]另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述檢測乳制品中大腸菌群的方法的引物，該引物如SEQ ID N0.1與SEQ ID N0.2所示。
[0051]另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明所述的引物(SEQ ID N0.1與SEQ ID N0.2)。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒還包括Passive Reference Dye 以及 TransStart Green qPCR SuperMix0
[0053]綜上所述，本發(fā)明從待測乳制品樣品中提取了總DNA，設(shè)計(jì)了大腸菌群特異性引物，提供一種乳制品中大腸菌群的熒光定量PCR檢測方法，該方法可以快速、準(zhǔn)確定量檢測樣品的大腸菌群，大大縮短了樣品大腸菌群的檢測時間，提高了乳制品中大腸菌群檢測靈敏度和準(zhǔn)確度，對企業(yè)生產(chǎn)及品控微生物安全具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1為PCR(SEQ ID N0.1 ；SEQ ID N0.2)產(chǎn)物電泳圖，泳道I為大腸埃希氏菌，泳道2為檸檬酸桿菌,泳道3為產(chǎn)氣克雷伯氏菌，泳道4為陰溝腸桿菌,泳道5為腸炎沙門氏菌，泳道6為痢疾志賀氏菌，泳道7為動物雙歧桿菌，泳道8為鼠李糖乳桿菌，泳道M為DNAMarker2000o
[0055]圖2為PCR(SEQ ID N0.3 ；SEQ ID N0.4)產(chǎn)物電泳圖，泳道I為大腸埃希氏菌，泳道2為檸檬酸桿菌,泳道3為產(chǎn)氣克雷伯氏菌，泳道4為陰溝腸桿菌,泳道5為腸炎沙門氏菌，泳道6為痢疾志賀氏菌，泳道7為動物雙歧桿菌，泳道8為鼠李糖乳桿菌，泳道M為DNAMarker2000o
[0056]圖3為PCR(SEQ ID N0.5 ；SEQ ID N0.6)產(chǎn)物電泳圖，泳道I為大腸埃希氏菌，泳道2為檸檬酸桿菌,泳道3為產(chǎn)氣克雷伯氏菌，泳道4為陰溝腸桿菌,泳道5為腸炎沙門氏菌，泳道6為痢疾志賀氏菌，泳道7為動物雙歧桿菌，泳道8為鼠李糖乳桿菌，泳道M為DNAMarker2000o
[0057]圖4為引物(SEQ ID N0.1 ；SEQ ID N0.2)靈敏性驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物電泳圖，泳道I模板DNA濃度為105pg/ μ L，泳道2模板DNA濃度為104pg/ μ L，泳道3模板DNA濃度為103pg/μ L，泳道4模板DNA濃度為102pg/ μ L，泳道5模板DNA濃度為IOpg/ μ L，泳道6模板DNA濃度為Ipg/ μ L，泳道7模板DNA濃度為0.1pg/ μ L，泳道8為無菌水(陰性對照)，泳道M為 DNA Marker2000o
[0058]圖5為大腸菌群基因組DNA電泳圖，泳道I為大腸埃希氏菌，泳道2為檸檬酸桿菌，泳道3為產(chǎn)氣克雷伯氏菌，泳道4為陰溝腸桿菌，泳道M為DNA Marker。
[0059]圖6為FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，R值為0.998，精確度較高，可以作為待測樣品中大腸菌群細(xì)菌數(shù)量測定的參考依據(jù)。
[0060]圖7為樣品FQ-PCR擴(kuò)增曲線，灰度較深標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品，灰度較淺標(biāo)記為樣品，從左到右依次為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6。
【具體實(shí)施方式】
[0061] 為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。
[0062]實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件。
[0063]實(shí)施例中所用到的各種化學(xué)試劑均可商購獲得，例如:
[0064]乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇等化學(xué)試劑購自天津市化學(xué)試劑三廠；
[0065]蛋白酶K、Tris堿、EDTA(乙二胺四乙酸)購自Sigma公司；
[0066]Tris飽和酚、SDS (十二烷基硫酸鈉)、CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)購自生工生物工程(上海)有限公司；
[0067]TransStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；
[0068]使用的熒光定量PCR儀為美國ABI公司的ΑΒΙ-St印One熒光定量PCR儀；
[0069]所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；
[0070]大腸埃希氏菌(1.2463)、檸檬酸桿菌(1.1732)、產(chǎn)氣克雷伯氏菌(1.1736)、陰溝腸桿菌(1.181)、腸炎沙門氏菌(1.1859)以及痢疾志賀氏菌(1.1869)等標(biāo)準(zhǔn)菌株均購自中國普通微生物菌種保藏中心，動物雙歧桿菌(bbl2)、鼠李糖乳桿菌(LGG)由伊利集團(tuán)技術(shù)中心保存。
[0071]實(shí)施例1
[0072]1、引物的設(shè)計(jì)、合成、特異性檢測及靈敏性驗(yàn)證
[0073]本發(fā)明所設(shè)計(jì)的大腸菌群特異性引物為:
[0074]F:5，-CACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3，(SEQ ID N0.1)； [0075]R:5’-GAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0076]為驗(yàn)證本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物的特異性，與采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)的以下引物對(這些引物均是在GenBank中查找大腸菌群四個菌屬標(biāo)準(zhǔn)株大腸埃希氏菌(AB548582.1)、檸檬酸桿菌(AB548577.1)、產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Y17656.1)和陰溝腸桿菌(EF551364.1)的16S rRNA基因，找出其共同保守序列，利用軟件設(shè)計(jì))進(jìn)行了對比試驗(yàn):
[0077]F:5，-GACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATG-3，(SEQ ID N0.3)；
[0078]R:5，-CGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG-3，(SEQ ID N0.4)。
[0079]F:5’-GGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAAC-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0080]R:5，-CGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG-3，(SEQ ID N0.6)。
[0081]引物特異性驗(yàn)證:
[0082]取大腸埃希氏菌(1.2463)、檸檬酸桿菌(1.1732)、產(chǎn)氣克雷伯氏菌(1.1736)和陰溝腸桿菌(1.181)標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液，采用蛋白酶K法提取宏基因組DNA，作為模板。選取與大腸菌群四個菌屬親緣性較近，也是食品污染的主要致病菌，同為腸桿菌科的腸炎沙門氏菌(1.1859)以及痢疾志賀氏菌(1.1869)菌液，采用蛋白酶K法提取宏基因組DNA，以腸炎沙門氏菌(1.1859)及痢疾志賀氏菌(1.1869)基因組DNA為陰性對照，另以活性菌乳制品中常見的動物雙歧桿菌(bbl2)和鼠李糖乳桿菌(LGG)，采用蛋白酶K法提取基因組DNA為陰性對照，采用 3 對引物(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2 ；SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4 ;SEQ IDN0.5, SEQ ID N0.6)進(jìn)行普通 PCR 擴(kuò)增。PCR 體系 25 μ L =IOXPCRBuffer:2.5μ L ；2.5mmol/L dNTPs:2.Ομ L ；5 μ mol/L 上游引物:1.0μ L ;5ymol/L 下游引物:1.0μ L ；5U/y L TaqDNA聚合酶:0.3 μ L ；100ng/ μ LDNA模板:1.0 μ L ；ddH20:17.2 μ L。PCR循環(huán)程序:95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 lmin，58°C退火 45s，72°C延伸 IminlOs，35 個循環(huán);72°C終端延伸 7min,4°C —m。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果表明:引物(SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2)只能擴(kuò)增出大腸菌群四個菌屬標(biāo)準(zhǔn)株，不能擴(kuò)增出對比菌株(見圖1);引物(SEQ IDN0.3,SEQ ID N0.4)只能擴(kuò)增出大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌及產(chǎn)氣克雷伯氏菌，不能擴(kuò)增出陰溝腸桿菌(見圖2);引物(SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6)能擴(kuò)增出大腸菌群四個菌屬標(biāo)準(zhǔn)株，但是也能擴(kuò)增出腸炎沙門氏菌和動物雙歧桿菌(見圖3);表明引物(SEQ ID N0.USEQID N0.2)不但靈敏度高(擴(kuò)增目的條帶非常亮)，而且特異性也非常好。
[0083]引物靈敏性驗(yàn)證:
[0084]采用蛋白酶K法提取大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA，微量核酸蛋白分析儀測定其濃度，無菌水作10倍梯度稀釋，使基因組DNA濃度分別為IO5Pg/μ LUO4Pg/μ LUO3Pg/μ L、IO2Pg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L，0.lpg/ μ L，分別取不同濃度的基因組 DNA1.0 μ L 為模板，無菌水作為陰性對照，采用引物SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系 25 μ L: 10 X PCRBuffer:2.5μ L ；2.5mmol/L dNTPs:2.Ομ L ；5 μ mol/L 上游引物:l.0yL ;5 μ mol/L 下游引物:1.Ομ L ；5U/y L Taq DNA 聚合酶:0.3μ L ; DNA 模板:1.0μ L ;ddH20:17.2 μ L。PCR 循環(huán)程序:95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 lmin，58°C退火 45s，72°C延伸lminl0s，35個循環(huán)；72°C終端延伸7min，4°C —PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果當(dāng)模板濃度為IO5Pg/ μ L~102pg/ μ L時,可見清晰的目的條帶，當(dāng)模板濃度為IOpg/μ L時，可見微弱的目的條帶，當(dāng)模板濃度降低至lpg/μ L時，無目的條帶出現(xiàn)，表明引物對SEQ ID N0.1與SEQ ID N0.2的靈敏度較高，檢測限為模板DNA濃度IOpg/μ L (見圖4)。
[0085]2、待測樣品 中細(xì)菌宏基因組DNA提取
[0086]隨機(jī)選取6份待測乳制品樣品(含乳蛋白的冷凍飲品料液)，各取30mL分別接種到300mL營養(yǎng)肉湯中，于37°C生化培養(yǎng)箱中増菌培養(yǎng)5h ；
[0087]取増菌培養(yǎng)5h的樣品lmL，12000g，4°C離心10min，收集菌體沉淀；
[0088]加入500 μ L TE緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次；
[0089]加入80yL10% SDS 和 1(^1^2011^/1^蛋白酶1(，371:搖床411 以上；
[0090]加入100 μ L5M NaCl 溶液及 80 μ L10mol/L CTAB 溶液，65°C水浴 20min ；
[0091]用等體積酌.:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提，12000g, 4?離心10min,取上清；
[0092]用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清；
[0093]采用異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，自然干燥，50 μ L TE溶解，得到DNA模板，備用。
[0094]按照上述方法提取得到的DNA模板，經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見明顯的目的條帶(見圖5)，表明該法可以提取到大腸菌群的基因組DNA，而且收率很高。
[0095]3、采用熒光定量PCR檢測樣品中大腸菌群的數(shù)量:
[0096]標(biāo)準(zhǔn)品的制備:
[0097]將過夜活化的大腸菌群菌液，10倍系列稀釋，平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)并計(jì)算菌液濃度。取ImL已測定濃度的菌液，提取細(xì)菌的基因組DNA，應(yīng)用微量紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度，計(jì)算單位濃度的基因組DNA中所包含的大腸菌群細(xì)菌的個數(shù)，將此單位濃度的基因組DNA進(jìn)行10倍系列稀釋，并以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。
[0098]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
[0099]以含有梯度稀釋個數(shù)大腸菌群細(xì)菌基因組DNA陽性模板的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)擴(kuò)增得到大腸菌群的定量擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖6)，以此作為待測樣品中大腸菌群數(shù)量測定的參照標(biāo)準(zhǔn)。
[0100]待測樣品中大腸菌群的測定:
[0101]取2 μ L提取的待測樣品基因組DNA作為模板進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增，F(xiàn)Q-PCR反應(yīng)體系:上游引物:0.4μ L ;下游引物:0.4μ L ;DNA 模板:2μ L ；Passive Reference DyeI:0.4μ L ；
2X TransStart Green qPCR SuperMix:10 μ L ；ddH20:Up to20yL。FQ-PCR 擴(kuò)增程序:95°C 20s ;40個循環(huán)，95°C 5s, 62°C 30s, 72°C 40s。將擴(kuò)增結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對計(jì)算出每毫升樣品中大腸菌群細(xì)菌的活菌數(shù)(見圖7)。
[0102]待測樣品中大腸菌群的定量結(jié)果見表1:
[0103]表1樣品中大腸菌群數(shù)量。
[0104]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測乳制品中大腸菌群的方法，該方法主要包括: 從待測乳制品樣品中提取總DNA ； 以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物為SEQ IDN0.1 與 SEQ ID N0.2 ； 對上述擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟: 將待測乳制品樣品進(jìn)行増菌培養(yǎng)； 増菌培養(yǎng)后的樣品離心，收集沉淀，加入TE緩沖液重懸，液氮凍融；加入SDS和蛋白酶K，37°C搖床4h以上； 加入CTAB提取緩沖液消化； 用酚仿法抽提； 加入異丙醇沉淀富集DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟: 按照30~50mL待測乳制品液態(tài)樣品:250~350mL營養(yǎng)肉湯的比例，或者30~50g待測乳制品固態(tài)樣品:250 ~350mL營養(yǎng)肉湯的比例進(jìn)行混合，于37土 1°C生化培養(yǎng)箱中増菌培養(yǎng)4~6h ; 取増菌培養(yǎng)5h的樣品lmL，12000g，4°C離心10min，收集菌體沉淀； 加入500 μ L TE緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次； 加入80yL10% SDS和10 μ L20mg/mL蛋白酶K，37°C搖床4h以上； 加入 100 μ L5M NaCl 溶液及 80 μ L10mol/L CTAB 溶液，65°C水浴 20min ； 用等體積酌.:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提,UQQQgJC離心10min,取上清； 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清； 采用異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，自然干燥，TE溶解備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述PCR為熒光定量PCR，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下: 反應(yīng)體系:10 μ mol/L 上下游引物各 0.4 μ L, DNA 模板 2 μ L, Passive Reference Dye:0.4 μ L, 2 X TransStart Green qPCR SuperMix: 10 μ L, ddH20 補(bǔ)足至 20 μ L ; 擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性20s ；40個循環(huán)，95°C變性5s，62°C退火30s，72°C延伸40s。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述乳制品為液態(tài)乳制品、奶粉、冷飲。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述乳制品為含乳蛋白的冷凍飲品，其中，增菌培養(yǎng)時按照30mL含乳蛋白的冷凍飲品料液:300mL營養(yǎng)肉湯的比例進(jìn)行混合，于37°C生化培養(yǎng)箱中増菌培養(yǎng)5h ;之后提取DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測；當(dāng)?shù)陀跓晒舛縋CR檢測限時，則含乳蛋白的冷凍飲品中大腸菌群數(shù)< 450MPN/100mL，符合相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述PCR為熒光定量PCR，該方法還包括制作熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、并將擴(kuò)增結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對計(jì)算出待測樣品中大腸菌群細(xì)菌的活菌數(shù)的過程。
8.用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述檢測乳制品中大腸菌群的方法的引物，該引物如 SEQ ID N0.1 與 SEQ ID N0.2 所示。
9.一種檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求8所述的引物。
10.根據(jù)權(quán)利 要求9所述的試劑盒，該試劑盒還包括PassiveReference Dye以及TransStart Green qPCR SuperMix0
【文檔編號】C12N15/11GK103981266SQ201410210385
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】安穎, 齊炳理, 陳世賢, 張雅君 申請人:內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司