一種耐熱性提高的堿性果膠酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐熱性提高的堿性果膠酶突變體，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明將源于Bacillus?sp.WSHB04-02的堿性果膠酶的第325位的異亮氨酸I點(diǎn)突變?yōu)楸奖彼酕。突變后50℃保溫2h后，殘留酶活是突變前的4.27倍；這說明突變后的堿性果膠酶I325F在50℃下的耐熱性明顯提高，I325F在50℃下可以較長時間的維持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。突變后的堿性果膠酶I325F在55℃下的半衰期是突變前的1.89倍；Km、Vmax、kcat和kcat/Km等都有改善。本發(fā)明提供的PGL的酶學(xué)性質(zhì)有大幅度提高，更加適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，滿足社會生產(chǎn)的要求。
【專利說明】一種耐熱性提高的堿性果膠酶突變體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種耐熱性提高的堿性果膠酶突變體，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2,簡稱PGL)，全稱聚半乳糖醛酸裂解酶，在堿性條件下具有高活性，可以利用反式消去作用切斷聚乳糖醛酸的α-1，4-糖苷鍵，將果膠質(zhì)分解為不飽和的寡聚半乳糖醛酸。該酶廣泛存在于細(xì)菌、酵母菌、真菌、植物以及和某些寄生線蟲。不同來源的堿性果膠酶同源性差異較大。堿性果膠酶廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)等各個領(lǐng)域，在茶和咖啡發(fā)酵、紡織和植物纖維加工、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理等發(fā)揮巨大作用。
[0003]在棉纖維初生細(xì)胞壁的最表面含有很多伴生雜質(zhì)，如:果膠質(zhì)、蠟質(zhì)、含氮物質(zhì)以及蛋白質(zhì)等非纖維素類物質(zhì)，互相包結(jié)成為復(fù)雜龐大的疏水網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。紡織工業(yè)中包含精煉步驟，其目的就是去除棉纖維上的雜質(zhì)，提高棉織物的吸濕功能性，再進(jìn)行后續(xù)加工。傳統(tǒng)的化學(xué)紡織精煉方法即熱堿法，其需要消耗大量的化學(xué)品與水資源，環(huán)境污染嚴(yán)重，據(jù)統(tǒng)計(jì)，印染過程中約70%的廢水是在這個步驟中產(chǎn)生的。除此之外，熱堿處理將對纖維造成嚴(yán)重?fù)p傷，機(jī)械強(qiáng)度將大幅下降。
[0004]近十幾年來，隨著分子生物學(xué)與工 業(yè)微生物研究的迅猛快速發(fā)展，研究者開始采用基因工程手段構(gòu)建重組菌，以期實(shí)現(xiàn)堿性果膠酶的過量重組表達(dá)。目前，已相繼出現(xiàn)了利用 Escherichia col1、Bacillus subtilis 和 Pichia pastoris 等作為宿主表達(dá)不同來源果膠酶基因的報(bào)道?，F(xiàn)在對堿性果膠酶的研究主要集中于合成堿性果膠酶工程菌與發(fā)酵過程控制。盡管PGL的表達(dá)量很高，但是酶的催化效率耐熱性等酶學(xué)特性還有待進(jìn)一步改進(jìn)，而目前所做的分子改造也只是嘗試不同宿主異源表達(dá)，提高酶活、耐熱性、催化效率等酶學(xué)性質(zhì)方面的研究，目前國內(nèi)做的甚少。近十年，國外堿性果膠酶的研究方向集中到酶的分離純化、酶學(xué)特性及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征研究等方面，我國對堿性果膠酶的研究主要集中在菌種選育、發(fā)酵工藝和應(yīng)用工藝的改良方面，而我國尚缺效價(jià)很高的商品堿性果膠酶，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化鋪墊，這方面的研究不容忽視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種耐熱性提高的堿性果膠酶突變體。所述突變體是以氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的堿性果膠酶(野生型)為基礎(chǔ)，將第325位的異亮氨酸I點(diǎn)突變?yōu)楸奖彼酕。
[0006]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供構(gòu)建所述堿性果膠酶突變體的方法，是通過設(shè)計(jì)引物對編碼堿性果膠酶的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后表達(dá)。
[0007]所述構(gòu)建方法，優(yōu)選以質(zhì)粒pET-20b(+)_pgl為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行突變并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli JM109進(jìn)行擴(kuò)增，然后以E.coli BL21 (DE3)表達(dá)含突變基因的重組質(zhì)粒，得到熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的堿性果膠酶突變體。[0008]所述pET_20b (+)-pgl 的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)！Overproduction of alkalinepolygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerolfeeding approach.2011, Shuying Fang et al.Volumel02, Issue22, pl0671 - 10678。
[0009]所述用于定點(diǎn)突變的引物是:
[0010]pglI325F primerl:5’-CTATGCCCAAAACAATGTCTTCGACGTACCGGGACTGTCAG-3’
[0011]pglI325F primer2:5’-CTGACAGTCCCGGTACGTCGAAGACATTGTTTTGGGCATAG-3’ 。
[0012]本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供應(yīng)用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)所述堿性果膠酶突變體的方法，是將含有編碼突變堿性果膠酶的基因的重組菌E.coli BL2KDE3)(pET-20b (+) -pglI325F)活化培養(yǎng)后接種到含有IOOyg mL—1氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為50mL/500mL,于37°C，200r mi11-1培養(yǎng)；菌體生長到OD600 = 0.6，加入終濃度
0.4mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時將溫度調(diào)整為30°C，誘導(dǎo)發(fā)酵48h。
[0013]所述活化培養(yǎng)是將重組菌Ε.coli BL21(DE3) (pET-20b(+)-pglI325F)接種于含有100μ gmL—1氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，裝液量為20mL/250mL，培養(yǎng)溫度37°C，200rpmmirT1搖床上振蕩培養(yǎng)IOh。
[0014]所述種子培養(yǎng)基組成(g/L):酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCllO，葡萄糖20，pH7.0。 [0015]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成:酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HP0472mmolΙΛ KH2P0417mmol L'
[0016]本發(fā)明通過定點(diǎn)突變改造堿性果膠酶基因，使所編碼的PGL耐熱性增強(qiáng)；相比突變前，在經(jīng)過30°C保溫24h，50°C保溫2h，55°C下保溫Ih后，突變后的堿性果膠酶(I325F)殘留酶活較突變前有所提高。50°C保溫2h后，突變后的殘留酶活是突變前的4.27倍；這說明突變后的堿性果膠酶I325F在50°C下的耐熱性明顯提高，I325F在50°C下可以較長時間的維持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。突變后最適反應(yīng)溫度提高了 5°C，突變后堿性果膠酶可以更好地在高溫條件下表現(xiàn)出最優(yōu)酶活；突變后的堿性果膠酶I325F在55°C下的半衰期是突變前的1.89倍；Km> Vmax, kcat和kMt/Km等都有改善。本發(fā)明提供的堿性果膠酶更加適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，滿足社會生產(chǎn)的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明構(gòu)建的突變株以及原始菌株不同溫度下的穩(wěn)定性，WT:突變前的酶；I325F:突變體。
[0018]圖2為本發(fā)明構(gòu)建的突變株以及原始菌株結(jié)構(gòu)變化，WT:突變前的酶；I325F:突變體。
【具體實(shí)施方式】
[0019]堿性果膠酶酶活力檢測:取一定量發(fā)酵液，8000rpm離心10min，胞外堿性果膠酶即包含于發(fā)酵上清液之中。堿性果膠酶反應(yīng)體系為:酶稀釋液20 μ L，含0.2% PGA的甘氨酸-NaOH緩沖液(0.2mol ?Λθ.44mmol L—1的CaCl2, pH9.4) 2mL，無活性的酶液為空白對照。堿性果膠酶反應(yīng)條件為:45°C水浴15min，使用3mL磷酸溶液(0.03mol L-1)終止反應(yīng)，235nm處測定反應(yīng)物吸光度值。
[0020]堿性果膠酶酶活單位定義為:I分鐘裂解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生I μ mol不飽和聚半乳糖醒酸所對應(yīng)酶量。
[0021 ] 堿性果膠酶酶活計(jì)算方法:
[0022](OD235 XlO6X體系體積X稀釋倍數(shù))/(103 X比色杯厚度X 4600 X酶反應(yīng)線性范圍內(nèi)的酶促反應(yīng)時間X酶液體積)
[0023]堿性果膠酶純化條件:A液:甘氨酸-NaOH，pH7.5 ；B液:甘氨酸_NaOH，2M硫酸銨，pH7.5 ；5mL 疏水柱[HiTrap Phenvl (high sub) FF], 3mL/min, 30% B 液洗脫得到目的蛋白；30kDamiIIipore超濾離心管濃縮,透析得到SDS-PAGE電泳純。
[0024]堿性果膠酶熱穩(wěn)定性檢測:在不同溫度下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力，以處理前酶活定為100%.，將酶液分別在30°C保溫24h，40°C保溫2h，50°C保溫2h，55°C下保溫lh，利用冰浴迅速冷卻后，按上述方法測殘余酶活力，考察其耐熱性。
[0025]堿性果膠酶Km、Vmax檢測:在0.05-2g/L不等的底物濃度下測定，由GraphPadPrism5預(yù)測得到。
[0026]實(shí)施例1突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組枯草芽孢桿菌的獲得
[0027]1、以PET_20b (+) -pgl質(zhì)粒為模板構(gòu)建突變表達(dá)載體
[0028]編碼野生型堿性果膠酶及由21個氨基酸組成的信號肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，野生型成熟堿性果膠酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。通過比對耐熱果膠酶序列:Bacillus Iicheniformis 的 CAD56882,來自 Bacillus sp.strain P_4_N的 BAA96478，以及來自 Thermotoga maritima MSB82 的 AAD35518，最適溫度分別為 69°C，70°C和90°C。結(jié)合堿性果膠酶的三維結(jié)構(gòu)，推測325位的異亮氨酸I對堿性果膠酶的熱穩(wěn)定性有較大影響，設(shè)計(jì)突變實(shí)驗(yàn)，將325位的異亮氨酸I突變成其他三個耐熱序列的相同氨基酸一苯丙氨酸F。
[0029]以pET-20b(+)-pgl質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物將第325位的異亮氨酸I突變?yōu)楸奖彼酕。用于定點(diǎn)突變的引物:
[0030]pglI325F primerl:5’-CTATGCCCAAAACAATGTCTTCGACGTACCGGGACTGTCAG-3’
[0031]pglI325F primer2:5’-CTGACAGTCCCGGTACGTCGAAGACATTGTTTTGGGCATAG-3’ 。
[0032]PCR反應(yīng)體系如下:(引物濃度為2O μ mol/L)
[0033]

5X PrinicS tar buffer IOjiL

dNTP Mixture4jiL
上游引物ΙμL
下游引物IjiL
基因組DNAIpL

Primer Slar 聚合酶 0.5 joL

加水補(bǔ)至50μ1。
[0034]PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 10min，98°C變性 10s，55°C退火 15s，72°C延伸 5min，30個循環(huán)后72°C延伸lOmin，4°C保存。將通過PCR得到的突變表達(dá)載體pET_20b (+) -pgl I325F利用DpnI核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切消化DNA模板。
[0035]質(zhì)粒pET_20b (+) -pgl 的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn):Overproduction of alkalinepolygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerolfeeding approach.2011, Shuying Fang et al.Volumel02, Issue22, pl0671 - 10678.[0036]2、突變表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化
[0037](I)感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0038]將E.coli BL21 (DE3)在劃線平板培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種到LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩(200rpm)培養(yǎng)。測定0D_值，當(dāng)0D_值達(dá)到0.35~0.5時(約培養(yǎng)5小時)放置冰中停止培養(yǎng)(如果OD6tltl值超出此范圍將不能保證感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率)。取上述菌體培養(yǎng)液Iml于1.5ml Microtube中(根據(jù)需要量確定Microtube數(shù)量)。l，500Xg(—般的微型離心機(jī)約4000rpm)4°C離心5分鐘，棄上清(注意盡量除盡上清)。在每個Microtube中加入1001冰中預(yù)冷的Solution A,輕輕彈動Microtube使沉淀懸浮，禁止劇烈振蕩1，500Xg( —般的微型離心機(jī)約4000rpm)4°C離心5分鐘，棄上清(注意盡量除盡上清)。在每個Microtube中加入100 μ L冰中預(yù)冷的Solution B,輕輕彈動Microtube使沉淀懸浮，禁止劇烈振蕩。
[0039](2)突變表達(dá)載體的驗(yàn)證擴(kuò)增
[0040]感受態(tài)細(xì)胞制作完成。本感受態(tài)細(xì)胞可以直接用于DNA的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可以于-80°C中保存，以備以后使用。在-80°C保存時，可以有效保存一年以上，但不能反復(fù)凍融，一旦融解后，不能再進(jìn)行-80°C保存。感受態(tài)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)化將_80°C保存的感受態(tài)細(xì)胞置于冰中融化10分鐘。取100 μ L的感受態(tài)細(xì)胞移至新的轉(zhuǎn)化管中。向感受態(tài)細(xì)胞中加入0.1ng~IOng (3 μ L~10 μ L)的轉(zhuǎn)化用DNA，輕輕混勻后冰中放置30分鐘。42°C水浴中放置90秒鐘后，立即于冰中放置I~2分鐘。加入890 μ L37°C預(yù)溫的LB培養(yǎng)基。37°C振蕩培養(yǎng)I小時。取適量涂平板后，將平板倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜。確認(rèn)培養(yǎng)菌落，進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。
[0041 ] 實(shí)施例2突變PGL的表達(dá)
[0042]種子培養(yǎng)基組成(g/L):酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCllO，葡萄糖20，pH7.0。
[0043]發(fā)酵培養(yǎng)基組成:酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HP0472mmol ?ΛKH2PO417mmo I L'
[0044]從甘油管中將含有突變表達(dá)載體pET_20b (+) -pglI325F的重組菌E.coliBL21(DE3)接種于含有100 μ g mL—1氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，裝液量為20mL/250mL。培養(yǎng)溫度37°C，200rpm搖床上振蕩培養(yǎng)IOh。
[0045]將培養(yǎng)IOh的種子液以3% (V/V)的接種量接入含有100 μ g mL—1氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為50mL/500mL，于37°C，200r mirT1培養(yǎng)。菌體生長到一定階段(OD6tltl=0.6)，加入終濃度0.4mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時將溫度調(diào)整為30°C，誘導(dǎo)發(fā)酵48h。
[0046]實(shí)施例3突變前后PGL的酶學(xué)性質(zhì)
[0047]按照實(shí)施例2所述的方法分別以含未經(jīng)突變的表達(dá)載體pET_20b (+) -pgl的E.coli BL21(DE3) 及突變株 E.coli BL21(DE3) (pET_20b (+)-pglI325F)進(jìn)行發(fā)酵，將發(fā)酵液中的酶純化后進(jìn)行耐熱性等酶學(xué)性質(zhì)分析。所得堿性果膠酶突變體命名為I325F。
[0048]由圖1可以看出，突變前堿性果膠酶(WT)在經(jīng)過30°C保溫24h，50°C保溫2h，55°C下保溫Ih后酶活損失比較明顯；突變后的堿性果膠酶(I325F)做相同處理后，殘留酶活較突變前有所提高，尤其是50°C保溫2h。50°C保溫2h后，突變后的殘留酶活是突變前的4.27倍；這說明突變后的堿性果膠酶I325F在50°C下的耐熱性明顯提高，I325F在50°C下可以較長時間的維持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。
[0049]由表1可以看出，突變后最適反應(yīng)溫度提高了 5°C，突變后堿性果膠酶可以更好地在高溫條件下表現(xiàn)出最優(yōu)酶活；突變后的堿性果膠酶I325F在55°C下的半衰期是突變前的
1.89倍和kMt/Km等都有些許改善。說明突變后堿性果膠酶的整體酶學(xué)性質(zhì)都得到改善。
[0050]表1突變株以及原始菌株酶學(xué)參數(shù)
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種耐熱性提高的堿性果膠酶突變體，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的堿性果膠酶的第325位異亮氨酸I點(diǎn)突變?yōu)楸奖彼酕。
2.編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。
3.攜帶權(quán)利要求2所述基因的載體或細(xì)胞。
4.一種獲得權(quán)利要求1所述堿性果膠酶突變體的方法，是通過設(shè)計(jì)引物對編碼堿性果膠酶的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，是以質(zhì)粒pET-20b(+)-pgl為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行突變并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli JM109進(jìn)行擴(kuò)增，然后以E.coli BL21(DE3)表達(dá)含突變基因的重組質(zhì)粒，得到耐熱性增強(qiáng)的堿性果膠酶突變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，用于定點(diǎn)突變的引物是:
pglI325F primer1:5’-CTATGCCCAAAACAATGTCTTCGACGTACCGGGACTGTCAG-3’
pglI325F primer2:5’-CTGACAGTCCCGGTACGTCGAAGACATTGTTTTGGGCATAG-3’ 。
7.應(yīng)用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)權(quán)利要求1所述堿性果膠酶突變體的方法，其特征在于，是將含有突變 堿性果膠酶基因的重組菌活化培養(yǎng)后接種到含有100 μ g mL-1氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37°C，200r mirT1培養(yǎng)；菌體生長到OD6tltl = 0.6，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時將溫度調(diào)整為30°C，誘導(dǎo)發(fā)酵48h。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述活化培養(yǎng)是將重組菌E.coliBL21(DE3) (pET-20b(+)-pglI325F)接種于含有100 μ g mL—1氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37°C，200rpm搖床上振蕩培養(yǎng)IOh。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成:酵母粉5g/L，胰蛋白胨 10g/L，NaC110g/L，葡萄糖 20g/L，ρΗ7.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成:酵母粉24g/L，胰蛋白胨 12g/L，甘油 5g/L，K2HP0472mmol L—1，KH2PO417mmoI L—1。
【文檔編號】C12N15/70GK103981166SQ201410191532
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國成, 劉松, 汪明星 申請人:江南大學(xué)