水稻葉色控制基因lyl1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個水稻葉色控制基因LYL1編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ?ID?No:3所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時公開了一種水稻葉色控制基因LYL1，該基因具有SEQ?ID?No:1和2所示的核苷酸序列。LYL1編碼一個雙牻牛兒基還原酶，該基因的突變導(dǎo)致水稻葉色從正常的綠色變成黃色。本發(fā)明還同時公開了一種載體，為含有上述基因的植物表達(dá)載體；植物表達(dá)載體例如為pCAMBIA1301-LYL1。本發(fā)明還同時公開了一種宿主細(xì)胞，其為含有上述載體的細(xì)胞；細(xì)胞例如為大腸桿菌、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。利用本發(fā)明lyl1-1突變基因控制的黃葉性狀可以作為遺傳標(biāo)記用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的品種鑒定以及水稻遺傳育種。
【專利說明】水稻葉色控制基因LYL1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及水稻葉色發(fā)育的基因及其應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為全球一半以上的人口提供了主食，提高水稻的產(chǎn)量對于保障全球糧食安全具有重要意義。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，水稻產(chǎn)量的95%來自于葉片的光合作用，而光合作用的高效依賴于葉綠素的合成和葉綠體的正常發(fā)育。葉色是葉綠體中各種色素的綜合表現(xiàn)，正常水稻葉片中葉綠素占優(yōu)勢，通常表現(xiàn)為綠色。
葉色變異是水稻種突變頻率較高且容易鑒定的突變性狀。突變基因往往是直接或者是間接影響到葉綠素的合成以及降解，改變?nèi)~綠素含量，所以葉色突變體也稱為葉綠素突變
[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前報(bào)道的水稻葉色突變的相關(guān)基因已經(jīng)超過80個，這些突變體大致可分為為白化、黃化、淺綠、條紋、斑點(diǎn)等5種類型，或分為白化、黃化、淺綠、白翠、綠白、黃綠、條紋和綠黃等8種類型[2]。其中黃化葉色突變體出現(xiàn)最多，且大部分受隱性核基因控制[3]。葉色突變體是研究水稻光能利用的理想材料，還可作為標(biāo)記性狀在雜種優(yōu)勢利用中加以應(yīng)用。因此，水稻葉色相關(guān)基因的克隆和功能分析對提高光合效率和產(chǎn)量具有重要意義。
雖然水稻葉色突變體發(fā)現(xiàn) 很多，但到目前為止，僅有少數(shù)幾個水稻葉色突變體基因被鑒定[4_12]，仍有大量的葉色基因有待分離。
參考文獻(xiàn):
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【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從水稻葉色突變體中克隆的新基因LYL1，該基因編碼的蛋白質(zhì)，和利用該基因調(diào)控水稻葉色的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了從水稻葉色突變體Iyll-1中克隆的新基因LYLlJn SEQ ID NO:1所示的gDNA序列以及SEQ ID NO:2所示的cDNA序列。
本發(fā)明還提供一種由上述水稻葉色基因LYLl編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ IDNo:3所示的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)是雙櫳牛兒基還原酶蛋白。
本發(fā)明還提供了含有上述基因的質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供了含有上述基因的植物表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述基因序列，該細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或 植物細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用LYLl基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的序列的基因或基因部分片段的載體，如圖4所示的PCAMBIA1301-LYL1，該載體可以表達(dá)有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。
本發(fā)明還提供了一種調(diào)控水稻葉色的方法，包括用為SEQ ID No:l和2所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。轉(zhuǎn)化可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍法。
本發(fā)明研究的具體技術(shù)步驟如下:
一、 水稻葉色突變體Iyll的分尚和遺傳分析:
本發(fā)明所采用的水稻葉色突變體(light-1nduced yellow leafl-1)是將粳稻品種(japonica)中花11號(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源庫)經(jīng)6°Co輻射處理后，再通過大量篩選而得到的表型穩(wěn)定的突變體lyll-Ι。該突變體表現(xiàn)出明顯的葉片黃化表型，如圖1所示。將Iyll-1突變體與秈稻品種(indica)揚(yáng)稻6號(審定編號:國審稻2001002)雜交，將F1代自交，種植F2代分離群體，群體內(nèi)綠苗和黃化苗分別為1377株和439株，分離比率符合3:1 (X^2 = 0.66<X_20.05；1 = 3.84)，表明我們所得到的是一個符合單基因控制遺傳規(guī)律的隱性突變體。
二、圖位克隆水稻葉色控制基因LYLl
(一)、LYL1基因的初步定位:
為了分離LYLl基因，本發(fā)明首先建立了一個大的多態(tài)性高的定位群體，由Iyll-1突變體與秈稻品種揚(yáng)稻6號(9311)雜交而形成的F2群體，再通過圖位克隆的方法，并利用STS、SSR等分子標(biāo)記對LYLl位點(diǎn)進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第2染色體長臂上，并介于標(biāo)記W243和W226之間，見圖2。
(二)、LYLl基因的精細(xì)定位和物理定位:
通過對W243和W226兩個標(biāo)記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的STS標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位，最終將LYLl精確定位于BAC克隆AP004114上的標(biāo)記W235和W246之間33_kb的范圍之內(nèi)(圖3)。通過分析此區(qū)段的開放閱讀框(ORF)推測候選基因，即，對該范圍內(nèi)的候選基因進(jìn)行序列分析，測序后發(fā)現(xiàn)只有LYLl候選基因的序列在中花11與Iyll-1突變體之間存在差異，而其它5個的序列在中花11與Iyll-1突變體間均無差異。
(三)、LYLl基因的鑒定和功能分析:
進(jìn)行功能互補(bǔ)的轉(zhuǎn)基因研究。將LYLl基因構(gòu)建到常規(guī)植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻黃葉突變體Iyll-1中，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使Iyll-1突變體恢復(fù)正常綠葉表型的轉(zhuǎn)基因水稻(圖5)，證明了本發(fā)明正確克隆了 LYLl基因。明確LYLl基因的gDNA序列(SEQ IDNo:1)和cDNA序列(SEQ ID No:2)，氨基酸序列分析表明LYLl基因編碼一個雙櫳牛兒基還原酶(SEQ ID No: 3) ο
本發(fā)明利用水稻葉色突變體，通過圖位克隆分離到了 LYLl基因，該基因編碼一個雙櫳牛兒基還原酶蛋白。通過對LYLl基因的克隆，進(jìn)一步闡明了水稻葉色調(diào)控的遺傳機(jī)制，為創(chuàng)建水稻高光效新種質(zhì)打下基礎(chǔ)。
通過植物基因工程技術(shù)將LYLl突變基因轉(zhuǎn)移到光敏核不育系材料中，可獲得含有Iyll基因，具有黃葉表型的不育系材料，用于水稻兩系雜交稻制種。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1是水稻葉色突變體Iyll-1的表型圖(左側(cè)為野生型中花11，右側(cè)為Iyll-1突變體)；
圖2是LYLl基因在水稻第2染色體上的初步定位圖；
圖3是LYLl基因的精細(xì)定位圖；圖4是互補(bǔ)載體pCAMBIAl301-LYLl質(zhì)粒圖譜；
圖5是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻的表型圖(左側(cè)為受體Iyll-1突變體，右側(cè)為Iyll-1互補(bǔ)Ttl代轉(zhuǎn)基因植株)。
【具體實(shí)施方式】
為了理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1:
1、水稻材料
水稻(Oryza sativa L.)突變體 Iyl 1-1 (light-1nduced yellow leaf 1-1),其原始野生型材料為粳稻品種“中花11”(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源庫)。中花11經(jīng)6ciCo輻射處理后，再通過大量篩選而得到的表型穩(wěn)定的突變體lyll-1 (Zhou, Y, Gong, ZY, Yang, ZF，Yuan, Y, Zhu, JY, Wang, M, Yuan, FH, ffu, SJ, Wang, ZD, Yi, CD, Xu, TH, Ryom, M, Gu, MH, Liang, GH.Mutation of the light-1nduced yellow leaflgene, which encodes a geranylgeranylreductase, affects chlorophyll biosynthesis and light sensitivity in rice, PLoSOne, 2013,8(9):e75299.) 0該突變體表現(xiàn)出明顯的葉片黃化表型，如圖1所示。
2、分析和定位群體
純合的Iyll-1突變體與原始野生型秈稻品種揚(yáng)稻6號(審定編號:國審稻2001002)雜交，F(xiàn)1代自交，得到F2代分離群體，并從中選出1203株葉片黃化的隱性個體作為定位群體。在苗期每株取1.0g左右的嫩葉，用來提取總DNA。
3、利用SSR和STS標(biāo)記定位LYLl基因
采用改進(jìn)的CTAB方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約0.1g水稻葉片(即步驟2中的水稻嫩葉)，用剪刀剪碎后放在2.0mL離心管中，放入直徑0.5mm的鋼珠，蓋好離心管蓋，將離心管置于液氮中冷凍，利用搗碎器(購自QIAGEN公司)將葉片磨成粉末狀，加入CTAB提取DNA。獲得的DNA沉淀溶解于200 μ L超純水中，得DNA溶液。每一個PCR反應(yīng)用I μ L上述DNA溶液。首先選用SSR和STS標(biāo)記用于基因定位和交換單株的篩選，然后使用新發(fā)展的STS標(biāo)記用于基因的精細(xì)定位。
LYLl基因的初步定位:在Iyll-1與揚(yáng)稻6號組合的F2分離群體中，分別將分離群體中10株綠葉植株和10黃葉植株的DNA混合，建成綠葉池和黃葉池，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR和STS引物，根據(jù)上述反應(yīng)條件檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將LYLl初步定位在第2染色體長臂W243和W226兩個標(biāo)記之間(見圖2)。
LYLl基因的精細(xì)定位:為了精細(xì)定位LYLl基因，根據(jù)W243和W226之間已發(fā)表的粳稻日本晴序列(http://rgp.dna.afTrc.g0.jp/)和秈稻 9311 序列(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/Genome)，比對粳稻與秈稻之間的序列，然后在差異區(qū)段的兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，5對引物(表1)在Iyll-1基因組DNA和揚(yáng)稻6號基因組DNA間檢測出多態(tài)性，這些有多態(tài)性的引物被用于LYLl基因的精細(xì)定位，最終將LYLl定位于BAC號為AP004114(即克隆0J1118G04)上33-Kb的范圍內(nèi)，兩邊的分子標(biāo)記為W235和W246。
SSR和STS的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:
在Mastercycler Pro PCR儀(購自Eppondorf公司)上進(jìn)行SSR和STS標(biāo)記的PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為:模板 DNA1.0 μ L，IOXPCR 的緩沖液 2.0 μ L, 25mM 的 MgCl22.0 μ L，2mM的 dNTP2.Ομ L，0.3μΜ 的引物 2.0 μ L, Taq 酶 0.5U，加 ddH20 補(bǔ)足至 20 μ L。
PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸lmin，擴(kuò)增34個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
PCR產(chǎn)物檢測:PCR反應(yīng)產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，利用GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)(購自Bio-Rad公司)拍照記錄結(jié)果。
表1、初步定位和精細(xì)定位的分子標(biāo)記引物序列及其目的片段大小。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻葉色調(diào)控基因LYLl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于:該蛋白質(zhì)具有Seq IDNo:3所示的氨基酸序列。
2.—種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因，其特征在于:該基因具有Seq ID No:l和2所示的核苷酸序列。
3.一種含有權(quán)利要求2所述基因的質(zhì)粒。
4.一種含有權(quán)利要求2所述基因的植物表達(dá)載體。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于:該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求2所述的基因序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于:該細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
7.權(quán)利要求2所述基因用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，改良水稻葉色的用途。
8.一種改良水稻葉色的方法，其特征在于:包括用具有Seq ID No:l和2所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。
【文檔編號】C12N15/53GK103923890SQ201410187111
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】周勇, 梁國華, 龔志云, 袁媛, 王曼, 楊澤峰, 朱金燕, 裔傳燈 申請人:揚(yáng)州大學(xué)