一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，該方法包括斜面孢子的制備、種子罐菌體的培養(yǎng)和發(fā)酵罐配方及控制，通過控制發(fā)酵罐中pH值的范圍及溶氧范圍實現(xiàn)了發(fā)酵過程的正常進行，并使菌體產(chǎn)素能力提高，從而降低了生產(chǎn)成本，減輕了環(huán)保壓力，具有重要的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益，適于規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]那西肽是由12個氨基酸及其衍生物組成的含硫多肽類抗生素，由活躍鏈霉菌(Streptomyces actuosus)產(chǎn)生,在體外能有效抑制革蘭氏陽性菌的生長,且毒性低。1961年法國科學(xué)家在發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了那西肽，但由于其產(chǎn)率低，成本太高而未能大規(guī)模推廣。
[0003]由于那西肽具備高效、低毒、在體內(nèi)不殘留的特性，目前已用作飼料添加劑，在歐共體、北美、日本等國廣泛使用。法國、日本已將該產(chǎn)品開發(fā)成動物抗生素，用于飼料添加劑。
[0004]因此，開發(fā)新的那西肽發(fā)酵技術(shù)，進一步提高那西肽發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，減輕環(huán)保壓力，具有重要的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，該方法能保證發(fā)酵代謝正常，提高菌體產(chǎn)素能力，降低生產(chǎn)成本，減輕環(huán)保壓力。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，發(fā)明人提供了以下技術(shù)方案:
[0007]—種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，操作步驟包括:
[0008]a.斜面孢子的制備:斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL):可溶性淀粉1.5_2.0，磷酸氫二鉀0.05-0.08，硫酸鎂0.05-0.10，硫酸亞鐵0.001-0.005,氯化鈉0.01-0.05，硝酸鉀0.1-0.4，瓊脂1.5-2.0，使用無菌接種針挖取適量砂土接種至斜面培養(yǎng)基上，28°C，40-60%濕度培養(yǎng)7-9天，向培養(yǎng)成熟的孢子斜面加入無菌水，使用無菌接種針輕輕刮下孢子，備用；
[0009]b.種子罐菌體的培養(yǎng):種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):葡萄糖2-3，黃豆餅粉2.5-3.5，硫酸銨0.2-0.4，硫酸鎂0.03-0.07，碳酸鈣0.4-1.0，磷酸二氫鉀0.02-0.08，豆油0.3-0.8，消沫劑0.02-0.05，種子罐培養(yǎng)溫度30土 1°C，向種子罐培養(yǎng)基上接種步驟a制備得到的孢子，接種量20-30億，通氣比0.8-1.0，罐壓0.04±0.005Mp，溶氧控制在15%_35%，繁殖菌體，當菌濃達到30%以上時進行移種，移種周期25-30h，移種pH值控制在6.6-7.0 ；
[0010]C.發(fā)酵罐配方及控制:發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為化/1001^):淀粉5.0-7.0，豆粉
2.5-3.5，硫酸銨0.5-1.0，碳酸鈣0.4-1.0，磷酸二氫鉀0.02-0.08，氯化鈉0.05-0.10，豆油0.3-0.8，消沫劑0.02-0.05，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度30± I°C，向發(fā)酵罐培養(yǎng)基上接種步驟b繁殖的菌體，接種量10%-20%，通氣比0.7-0.9，罐壓0.04±0.005Mp，全程流加氨水來調(diào)節(jié)pH值并補充氮源，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣比來控制溶氧，放罐周期為180-220h，發(fā)酵結(jié)束，即得到那西肽混懸液。
[0011]上述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，所述步驟c中，pH值的范圍為6.8-7.3，攪拌轉(zhuǎn)速為300-600rpm，通氣比為0.7-0.9，溶氧的范圍為25%_60%。[0012]上述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，所述步驟a中，斜面培養(yǎng)基成分為(g/lOOmL):可溶性淀粉1.5，磷酸氫二鉀0.05，硫酸鎂0.05，硫酸亞鐵0.001，氯化鈉0.01，硝酸鉀0.1，瓊脂
1.5。
[0013]上述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，所述步驟a中，斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL):可溶性淀粉2.0，磷酸氫二鉀0.08，硫酸鎂0.10，硫酸亞鐵0.005，氯化鈉0.05，硝酸鉀0.4，瓊脂
2.0。
[0014]上述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，所述步驟b中，種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):葡萄糖2，黃豆餅粉2.5，硫酸銨0.2，硫酸鎂0.03，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.02，豆油0.3，消沫劑0.02。
[0015]上述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，所述步驟b中，種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):葡萄糖3，黃豆餅粉3.5，硫酸銨0.4，硫酸鎂0.07，碳酸鈣0.4-1.0，磷酸二氫鉀0.02-0.08，豆油 0.3-0.8，消沫劑 0.02-0.05。
[0016]上述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，所述步驟c中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):淀粉5.0，豆粉2.5，硫酸銨0.5，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.02，氯化鈉0.05，豆油0.3，消沫劑0.02。
[0017]上述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，所述步驟c中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):淀粉7.0，豆粉3.5，硫酸銨1.0，碳酸鈣1.0，磷酸二氫鉀0.08，氯化鈉0.10，豆油0.8，消沫劑0.05。
[0018]上述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，所述步驟c中，pH值的范圍為7.0-7.1，溶氧的范圍為 45%-50%。
[0019]在那西肽發(fā)酵過程中，菌種生長快，溶氧需求高。在流加氨水調(diào)節(jié)pH值和補充氮源時，pH值不易控制，如果pH值超出7.5以上，則不能再繼續(xù)補加氨水，而不能補加氨水則會造成PH值快速上升，從而導(dǎo)致代謝異常，菌體自溶，發(fā)酵提前中止，產(chǎn)能低。全程控制高溶氧，也會導(dǎo)致菌絲生長異常，同時造成動力成本浪費，全程控制低溶氧，將不能滿足菌體正常生產(chǎn)和代謝。因此PH值和溶氧是工藝控制的關(guān)鍵指標，兩者協(xié)調(diào)控制可提高那西肽發(fā)酵水平。
[0020]發(fā)明人在那西肽發(fā)酵方法的研究過程中，意外發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵代謝的步驟中，流加氨水調(diào)節(jié)PH值在合適的范圍內(nèi)，同時控制溶氧的水平，能顯著提高那西肽的發(fā)酵水平在55%以上。
[0021]本發(fā)明所述的發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，將發(fā)酵代謝的步驟中pH值范圍限定在
6.8-7.3之間，溶氧的范圍限定在25%-60%，在此條件下，發(fā)酵過程能夠正常進行，菌體產(chǎn)素能力提高，從而降低了生產(chǎn)成本，減輕了環(huán)保壓力。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述內(nèi)容做進一步詳細的說明。
[0023]實施例1
[0024]a.斜面孢子的制備:斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL):可溶性淀粉1.5，磷酸氫二鉀
0.05，硫酸鎂0.05，硫酸亞鐵0.001，氯化鈉0.01，硝酸鉀0.1，瓊脂1.5，使用無菌接種針挖
取適量砂土接種至斜面培養(yǎng)基上，28°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)7-9天，向培養(yǎng)成熟的孢子斜面中加入IOmL無菌水，用無菌接種針輕輕刮下孢子，制備成孢子懸液。
[0025] b.種子罐菌體的培養(yǎng):種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，葡萄糖2，黃豆餅粉2.5，硫酸銨0.2，硫酸鎂0.03，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.02，豆油0.3，消沫劑0.02，種子罐培養(yǎng)溫度 30±1°C，接種量 20 億-30 億孢子 /L，通氣比 0.8-1.0(V/V/m)，罐壓 0.04±0.005MPa,溶氧控制在15%-35%，移種周期25-30h，移種pH控制在6.6-7.0,菌濃30%以上。
[0026]c.發(fā)酵罐配方及控制:發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，淀粉5.0，豆粉2.5，硫酸銨0.5，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.02，氯化鈉0.05，豆油0.3，消沫劑0.02，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度前30± 1°C，接種量10%-20%，通氣比0.7-0.9，罐壓0.04 ± 0.005MPa,發(fā)酵9h后流加氨水自控pH至7.1-7.3，20h后溶氧自控在50%-60%，發(fā)酵周期為220h，檢測那西肽效價為2490U/
mLo
[0027]實施例2
[0028]a.斜面孢子的制備:斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL):可溶性淀粉2.0，磷酸氫二鉀0.08，硫酸鎂0.10，硫酸亞鐵0.005，氯化鈉0.05，硝酸鉀0.4，瓊脂2.0,使用無菌接種針挖取適量砂土接種至斜面培養(yǎng)基上，28°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)7-9天，向培養(yǎng)成熟的孢子斜面中加入IOmL無菌水，用無菌接種針輕輕刮下孢子，制備成孢子懸液。
[0029]b.種子罐菌體的培養(yǎng):種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，葡萄糖3，黃豆餅粉3.5，硫酸銨0.4，硫酸鎂0.07，碳酸鈣1.0，磷酸二氫鉀0.08，豆油0.8，消沫劑0.05，種子罐培養(yǎng)溫度 30±1°C，接種量 20 億-30 億孢子 /L，通氣比 0.8-1.0(V/V/m)，罐壓 0.04 ±0.005MPa,溶氧控制在15%-35%，移種周期25-30h，移種pH控制在6.6-7.0，菌濃30%以上。
[0030]c.發(fā)酵罐配方及控制:發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，淀粉7.0，豆粉3.5，硫酸銨1.0，碳酸鈣1.0，磷酸二氫鉀0.08，氯化鈉0.10，豆油0.8，消沫劑0.05，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度前30± I °C，接種量10%-20%，通氣比0.7-0.9，罐壓0.04±0.005MPa,發(fā)酵9h后流加氨水自控pH至7.0-7.l，20h后溶氧自控在45%-50%，發(fā)酵周期為180h，檢測那西肽發(fā)酵效價為2550U/mL。
[0031]實施例3
[0032]a.斜面孢子制備:斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，可溶性淀粉2.0，磷酸氫二鉀
0.05，硫酸鎂0.05，硫酸亞鐵0.001，氯化鈉0.05，硝酸鉀0.1，瓊脂2.0。使用無菌接種針挖取適量砂土接種至斜面培養(yǎng)基上，28 0C，40-60%濕度培養(yǎng)7-9天至孢子成熟。將培養(yǎng)成熟的孢子斜面加入IOmL無菌水，使用無菌接種針輕輕刮下孢子制備成孢子懸液。
[0033]b.種子罐配方及控制:種子罐培養(yǎng)基成分為化/100!^)，葡萄糖2，黃豆餅粉3.5，硫酸銨0.4，硫酸鎂0.07，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.08，豆油0.3，消沫劑0.05，種子罐培養(yǎng)溫度30 土 1°C，接種量20億-30億孢子/L，通氣比0.8-1.0，罐壓0.04±0.005MPa，溶氧控制在15%-35%，移種周期25-30h，移種pH控制在6.6-7.0。
[0034]c.發(fā)酵罐配方及控制:發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，淀粉7.0，豆粉2.5，硫酸銨1.0，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.08，氯化鈉0.05，豆油0.8，消沫劑0.02-, 100L百侖不銹鋼發(fā)酵罐中裝入60L發(fā)酵液，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為30± 1°C，接種量10%-20%，通氣比0.7-0.9，罐壓0.04±0.005MPa,發(fā)酵9h后流加氨水自控pH至6.9-7.0, 20h后溶氧自控在35%_40%至發(fā)酵周期為220h，檢測那西肽發(fā)酵效價為2480U/mL。
[0035]實施例4[0036]a.斜面孢子制備:斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，可溶性淀粉2.0，磷酸氫二鉀
0.05，硫酸鎂0.05，硫酸亞鐵0.001，氯化鈉0.05，硝酸鉀0.1，瓊脂2.0。使用無菌接種針挖取適量砂土接種至斜面培養(yǎng)基上，28 0C，40-60%濕度培養(yǎng)7-9天至孢子成熟。將培養(yǎng)成熟的孢子斜面加入IOmL無菌水，使用無菌接種針輕輕刮下孢子制備成孢子懸液。
[0037]b.種子罐配方及控制:種子罐培養(yǎng)基成分為化/100!^)，葡萄糖3，黃豆餅粉2.5，硫酸銨0.4，硫酸鎂0.03，碳酸鈣1.0，磷酸二氫鉀0.02，豆油0.8，消沫劑0.02，種子罐培養(yǎng)溫度30± 1°C，接種量20億-30億孢子/L，通氣比0.8~1.0，罐壓0.04±0.005Mp，溶氧控制在15%-35%，移種周期25-30h，移種pH控制在6.6-7.0。
[0038]c.發(fā)酵罐配方及控制:發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，淀粉7.0，豆粉2.5，硫酸銨1.0，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.08，氯化鈉0.05，豆油0.8，消沫劑0.02，100L百侖不銹鋼發(fā)酵罐中裝入60L發(fā)酵液，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為30 ± I °C，接種量10%-20%，通氣比0.7-0.9，罐壓0.04 ± 0.005MPa,發(fā)酵9h后流加氨水自控pH至6.8-6.9，20h后溶氧自控在25%_35%至發(fā)酵周期為220h，檢測那西肽發(fā)酵效價為2650U/mL。
[0039]為了說明本發(fā)明所述發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法制備那西肽效價水平提高的程度，發(fā)明人進行了對比試驗，并將試驗結(jié)果進行了對比，具體見表1。
[0040]對比實施例
[0041]a.斜面孢子的制備:斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL):可溶性淀粉1.5，磷酸氫二鉀
0.05，硫酸鎂0.05，硫酸亞鐵0.001，氯化鈉0.01，硝酸鉀0.1，瓊脂1.5，使用無菌接種針挖取適量砂土接種至斜面培養(yǎng)基上，28°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)7-9天，向培養(yǎng)成熟的孢子斜面中加入IOmL無菌水，用無菌接種針輕輕刮下孢子，制備成孢子懸液。
[0042]b.種子罐菌體的培養(yǎng):種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，葡萄糖2，黃豆餅粉2.5，硫酸銨0.2，硫酸鎂0.03，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.02，豆油0.3，消沫劑0.02，種子罐培養(yǎng)溫度 30±1°C，接種量 20 億-30 億孢子 /L，通氣比 0.8-1.0(V/V/m)，罐壓 0.04±0.005MPa,溶氧控制在15%-35%，移種周期25-30h，移種pH控制在6.6-7.0,菌濃30%以上。
[0043]c.發(fā)酵罐配方及控制:發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL)，淀粉5.0，豆粉2.5，硫酸銨0.5，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.02，氯化鈉0.05，豆油0.3，消沫劑0.02，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度前30± 1°C，接種量10%-20%，通氣比0.7-0.9，罐壓0.04 ±0.005MPa,發(fā)酵9h后流加氨水自控pH7.3-7.4，溶氧未控制具體范圍，發(fā)酵周期為220h，檢測那西肽效價為1600U/mL。
[0044]表1
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，操作步驟包括: a.斜面孢子的制備:斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL):可溶性淀粉1.5-2.0，磷酸氫二鉀0.05-0.08，硫酸鎂 0.05-0.10，硫酸亞鐵 0.001-0.005，氯化鈉 0.01-0.05，硝酸鉀 0.1-0.4，瓊脂1.5-2.0，使用無菌接種針挖取適量砂土接種至斜面培養(yǎng)基上，28°C，40-60%濕度培養(yǎng)7-9天，向培養(yǎng)成熟的孢子斜面加入無菌水，使用無菌接種針輕輕刮下孢子，備用； b.種子罐菌體的培養(yǎng):種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):葡萄糖2-3，黃豆餅粉2.5-3.5，硫酸銨0.2-0.4，硫酸鎂0.03-0.07，碳酸鈣0.4-1.0，磷酸二氫鉀0.02-0.08，豆油0.3-0.8，消沫劑0.02-0.05，種子罐培養(yǎng)溫度30 土 1°C，向種子罐培養(yǎng)基上接種步驟a制備得到的孢子，接種量20-30億，通氣比0.8-1.0，罐壓0.04±0.005Mp，溶氧控制在15%_35%，繁殖菌體，當菌濃達到30%以上時進行移種，移種周期25-30h，移種pH值控制在6.6-7.0 ； c.發(fā)酵罐配方及控制:發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):淀粉5.0-7.0，豆粉2.5-3.5，硫酸銨0.5-1.0，碳酸鈣0.4-1.0，磷酸二氫鉀0.02-0.08，氯化鈉0.05-0.10，豆油0.3-0.8，消沫劑0.02-0.05，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度30± I°C，向發(fā)酵罐培養(yǎng)基上接種步驟b繁殖的菌體，接種量10%-20%，通氣比0.7-0.9，罐壓0.04±0.005Mp，全程流加氨水來調(diào)節(jié)pH值并補充氮源，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣比來控制溶氧，放罐周期為180-220h，發(fā)酵結(jié)束，即得到那西肽混懸液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，所述步驟c中，pH值的范圍為6.8-7.3，攪拌轉(zhuǎn)速為300-600rpm，通氣比為0.7-0.9，溶氧的范圍為25%_60%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，所述步驟a中，斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL):可溶性淀粉1.5，磷酸氫二鉀0.05，硫酸鎂0.05，硫酸亞鐵0.001，氯化鈉0.01，硝酸鉀0.1，瓊脂1.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，所述步驟a中，斜面培養(yǎng)基成分為(g/100mL):可溶性淀粉2.0，磷酸氫二鉀0.08，硫酸鎂0.10，硫酸亞鐵0.005，氯化鈉0.05，硝酸鉀0.4，瓊脂2.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，所述步驟b中，種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):葡萄糖2，黃豆餅粉2.5，硫酸銨0.2，硫酸鎂0.03，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.02，豆油0.3，消沫劑0.02。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，所述步驟b中，種子罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):葡萄糖3，黃豆餅粉3.5，硫酸銨0.4，硫酸鎂0.07，碳酸鈣0.4-1.0，磷酸二氫鉀 0.02-0.08，豆油 0.3-0.8，消沫劑 0.02-0.05。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，所述步驟c中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):淀粉5.0,豆粉2.5，硫酸銨0.5，碳酸鈣0.4，磷酸二氫鉀0.02，氯化鈉0.05，豆油0.3，消沫劑0.02。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，所述步驟c中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/100mL):淀粉7.0，豆粉3.5，硫酸銨1.0，碳酸鈣1.0，磷酸 二氫鉀0.08，氯化鈉0.10，豆油0.8，消沫劑0.05。9、根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的方法，其特征在于，所述步驟c中，PH值的范圍為7.0-7.1，溶氧的范圍為45%-50%。
【文檔編號】C12R1/465GK103898181SQ201410155304
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】李敏, 張慧, 齊巧娟, 王繪磚 申請人:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司