一種提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸產(chǎn)量的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征在于以重組枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，敲除其基因組中sucA基因。是將sucA基因敲除，從而阻斷胞內(nèi)L-谷氨酸的分解途徑，以此改造菌株高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸，從而解決了工業(yè)化α-酮戊二酸生產(chǎn)高成本、低得率、污染嚴(yán)重的問題。
【專利說明】—種提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種通過敲除SUcA基因提高重組枯草芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α -酮戊二酸產(chǎn)量的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]α -酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的重要中間體，對于協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)碳代謝和氮代謝發(fā)揮重要作用。α -苯丙酮酸有很多應(yīng)用，可用來合成抗腫瘤藥物的雜環(huán)化合物，可作為抗氧化劑及促進(jìn)傷口愈合。在生物醫(yī)學(xué)診斷中，α-酮戊二酸可作為酮戊二酸脫氫酶，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的底物。α -酮戊二酸可作為合成聚乙烯的原材料，這種聚合物具有生物降解能力。傳統(tǒng)α-酮戊二酸生產(chǎn)采用化學(xué)法，化學(xué)法的主要缺點(diǎn)是缺乏選擇性，采用有毒的氰化物及金屬銅，產(chǎn)率低，且污染環(huán)境。酶和全細(xì)胞生物催化劑越來越多的用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0003]L-氨基酸脫氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脫氨基，生成相應(yīng)α -酮酸和氨，多為黃素蛋白，二聚體結(jié)構(gòu)。L-氨基酸脫氨酶主要存在于蛇毒和昆蟲毒素中，在細(xì)菌、真菌、藻類中也存 在。蛇毒氨基酸脫氨酶是研究最好的脫氨酶，但是價(jià)格昂貴，難以大規(guī)模使用。P.mirabilis KCTC2566有兩種L-氨基酸脫氨酶，一種具有廣泛的底物特異性，能夠催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其對L-苯丙氨酸具有較高催化活性；另一種具有底物限制性，只對堿性氨基酸具有催化活性，尤其是L-組氨酸。大部分細(xì)菌L-氨基酸脫氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中兩種L-氨基酸脫氨酶都是膜蛋白。
[0004]通過PCR和Cre/loxP定點(diǎn)重組系統(tǒng)結(jié)合進(jìn)行基因重組操作，實(shí)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌內(nèi)不依賴載體構(gòu)建的無痕敲除過程。
[0005]全細(xì)胞轉(zhuǎn)化相比分離酶具有如下優(yōu)勢:全細(xì)胞生物催化劑更容易制備，成本低；比分離酶更穩(wěn)定，不易受環(huán)境溫度、PH等因素影響，使用方便；轉(zhuǎn)化過程中不產(chǎn)生有毒害產(chǎn)品，不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物。有望實(shí)現(xiàn)低能耗、高效率、高純度、無污染的工業(yè)化PPA生產(chǎn)。之前的研究中我們已經(jīng)成功構(gòu)建了枯草芽孢桿菌全細(xì)胞催化劑，表達(dá)來源于P.mirabilisKCTC2566的改造的脫氨酶基因，α-酮戊二酸的產(chǎn)量為8.59g/L。但是由于全細(xì)胞催化劑本身對底物有一定吸收，用于胞內(nèi)分解代謝消耗，從而影響了胞外底物轉(zhuǎn)化生成α-酮戊二酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是解決全細(xì)胞催化劑本身對L-谷氨酸的吸收浪費(fèi)，從而提高胞外轉(zhuǎn)化L-谷氨酸的產(chǎn)量。是將sucA基因敲除，從而阻斷胞內(nèi)L-谷氨酸的分解途徑，以此改造菌株高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸，從而解決了工業(yè)化α-酮戊二酸生產(chǎn)高成本、低得率、污染嚴(yán)重的問題。本發(fā)明以重組枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，敲除其基因組中sucA基因。
[0007]所述重組枯草芽孢桿菌為表達(dá)的改造后L-氨基酸脫氨酶基因的枯草芽孢桿菌168。
[0008]所述改造后L-氨基酸脫氨酶基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，編碼的突變體為 F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T
[0009]所涉及到的微生物有:P.mirabilis KCTC2566、B.subtilisl68。
[0010]所涉及到的質(zhì)粒有:p7Z6(pMD18_T containing lox71-zeo_lox66cassette)、pTSC (Emr Ampr; temperature sensitive in B.subtilis),均系本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0011]所述sucA基因敲除方法:PCR擴(kuò)增sucA基因上下游約1000bp及抗性標(biāo)記片段約lOOObp，融合PCR制備打靶片段。將此融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選發(fā)生同源重組的菌株。最后用溫敏型質(zhì)粒消去抗性。所述sucAGENBANK ID:939507。
[0012]所述微生物菌株的種子培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCllg,自來水定容至100mL。發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨12g,酵母提取物24g,甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加IOOmL滅菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2P O4和12.54g的K2HPO4溶于水中，終體積為IOOmL,高壓滅菌)。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明成功實(shí)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌內(nèi)sucA基因的敲除，從而阻斷了細(xì)胞對底物的吸收，進(jìn)一步提高了胞外轉(zhuǎn)化L-谷氨酸的產(chǎn)量，α -酮戊二酸的產(chǎn)量可達(dá)12.20g/L。此全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的建立，解決了化學(xué)法合成α -酮戊二酸的步驟繁瑣、得率低、污染環(huán)境等問題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率低的問題，實(shí)現(xiàn)了無污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn)α -酮戊二酸，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]材料與方法
[0015]種子培養(yǎng)基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g, NaCllg,自來水定容至100mL。
[0016]發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到 60°C，再加 IOOmL 滅菌的 17mmol/L KH2PO4 和 72mmol/LK2HP04 的溶液。
[0017]α-酮戊二酸含量測定:將轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行離心，棄上清，離心向細(xì)胞中加入50 μ LL-谷氨酸(IOOmM)，30min后，加入45 μ I三氯乙酸(20%)，室溫放置30min，終止反應(yīng)。加入20yL DNP (20mM)，室溫放置15min，加入400 μ L NaOH (0.8Μ)終止反應(yīng)。離心，取上清，酶標(biāo)儀測定520nm的吸光度。
[0018]實(shí)施例1sucA基因的敲除
[0019]之前的研究中，通過枯草芽孢桿菌表達(dá)通過易錯(cuò)PCR或定點(diǎn)飽和突變改造的L-氨基酸脫氨酶基因(SEQ ID N0.1)，提高了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率。
[0020]SEQ I D NO, 1:
atggcaataa gtagaagaaa alllallcll gglggcacag lggllgclgl lgclgcaggc60
gctggggttt taacacciat gttaacgcga gaagggcgti Ugttcctgg lacgccgaga120
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[0022]以此重組枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，以sucA-L-F和sucA-L-R為引物，PCR擴(kuò)增sucA基因上游約lOOObp，以sucA-R-F和sucA-R-R為引物，PCR擴(kuò)增sucA基因下游約lOOObp。以p7Z6為模板，以sucA-Z-F和sucA_Z-R為引物，擴(kuò)增抗性標(biāo)記片段Lox71-zeo-lox66約lOOObp。對這三個(gè)片段進(jìn)行融合PCR。融合PCR片段轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，同源重組，篩選 zeor轉(zhuǎn)化子。溫敏型質(zhì)粒pTSC轉(zhuǎn)化zee/轉(zhuǎn)化子,促進(jìn)1οχ71和1οχ66的接合，從而消除zeo抗性。通過50°C
[0023]培養(yǎng)12h，丟失溫敏型質(zhì)粒pTSC。從而得到了敲除sucA基因的菌株。
[0024]表1PCR所用引物
[0025]PrimersSequence
sucA-Z-F.r-ACCATGTGCATGACTTCAAAGAGCAGCGGATAACAATTTCACACAGG-:^
sucA-Z-R5-CTCCTGCACTTCCGACACCGTATTTGGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3f
sucA-L-F5-ACGAACAAAATGGGA?CGTTGATA-3,
sucA-L-RS- rCdO rGl GAAAl I G I I AiCCGC IC AlCCAC IC ICCAAACGAGr I GAI AC-3
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sucA-R-F^-ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCACGGTGTCGGAAGTGCAGGAG-S'sucA-R-R 5 -TCGACATCCTGCTTGCGCACTCTTC-3(
[0026]實(shí)施例2全細(xì)胞催化劑的制備及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程
[0027]實(shí)施例 1中的原始枯草芽孢桿菌和敲除sucA后的重組枯草芽孢桿菌接種種子培養(yǎng)基(氯霉素10mg/L)，37°C，200rpm過夜培養(yǎng)。發(fā)酵在3L NBS發(fā)酵罐中進(jìn)行，1%接種量到
1.8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和溫度分別為400rpm、l.0vvm和28°C，當(dāng)OD6tltl達(dá)到
0.6,加入0.41111 IPTG誘導(dǎo)L-氨基酸脫氨酶表達(dá)。誘導(dǎo)5h后,8，OOOrpm低溫離心10min,收集菌體，用20mM Tris-HCl (pH8.0)緩沖液洗兩遍菌體。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系為:L_谷氨酸15g/L,全細(xì)胞催化劑 20.0g/L,反應(yīng)在 20mM Tris-HCl (pH8.0)中進(jìn)行，37°C，200rpm 轉(zhuǎn)化 24h。
[0028]敲除sucA后的重組枯草芽孢桿菌，其α -酮戊二酸的產(chǎn)量可達(dá)12.20g/L ;未敲除sucA的重組枯草芽孢桿菌，其α -酮戊二酸的產(chǎn)量為8.59g/L。
[0029]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸產(chǎn)量的方法，其特征在于以重組枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，敲除其基因組中sucA基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述重組枯草芽孢桿菌為表達(dá)改造后L-氨基酸脫氨酶基因的枯草芽孢桿菌168。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述改造后L-氨基酸脫氨酶基因核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示，編碼的突變體為 F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于敲除重組枯草芽孢桿菌中sucA基因的方法為:通過PCR方法將sucA基因上下游約1000bp及抗性標(biāo)記片段約1000bp融合，抗性標(biāo)記片段兩端含有突變的1xP位點(diǎn)；將此融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選發(fā)生同源重組的菌株；最后用溫敏型質(zhì)粒消去抗性，實(shí)現(xiàn)無痕敲除。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于敲除sucA基因后此全細(xì)胞催化劑轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α -酮戊二酸的產(chǎn)量為12.20g/L。
【文檔編號】C12N15/70GK103937842SQ201410146961
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 劉龍, 堵國成, 李江華, 嘎子侯賽因, 侯穎 申請人:江南大學(xué)