一種高產(chǎn)l-丙氨酸且耐受自來(lái)水的菌株及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)L-丙氨酸且耐受自來(lái)水的菌株及其構(gòu)建方法。本發(fā)明提供了一種構(gòu)建重組菌的方法，為突變出發(fā)菌中的lon基因和clpA基因，得到重組菌；所述突變出發(fā)菌中的lon基因?yàn)閷⑺龀霭l(fā)菌中的lon基因核苷酸序列自5’末端第1310位的C突變?yōu)锳；所述突變出發(fā)菌中的clpA基因?yàn)閷⑺龀霭l(fā)菌中的clpA基因核苷酸序列自5’末端第1895位的T突變?yōu)镚。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過(guò)將大腸桿菌工程菌XZ-A26中的lon基因和clpA基因進(jìn)行突變，得到的重組菌XZ-A47，不僅能夠提高L-丙氨酸產(chǎn)量，而且還可以在自來(lái)水配置的發(fā)酵培養(yǎng)基中高產(chǎn)L-丙氨酸，采用自來(lái)水配置可以節(jié)約成本。
【專利說(shuō)明】一種高產(chǎn)L-丙氨酸且耐受自來(lái)水的菌株及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種高產(chǎn)L-丙氨酸且耐受自來(lái)水的菌株及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-丙氨酸作為人體非必需氨基酸，在生物體內(nèi)由甘氨酸的氨基轉(zhuǎn)移至丙酮酸而成。L-丙氨酸是一種白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，帶有甜味，易溶于水，在食品及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的用途。在食品工業(yè)領(lǐng)域，L-丙氨酸可提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，加入L-丙氨酸后能夠明顯提高食品及飲料中蛋白質(zhì)利用率。L-丙氨酸能夠改善人工合成甜味劑的味感，使其如同天然甜味劑。另外，L-丙氨酸還能夠改善有機(jī)酸的酸味，使其更接近自然味道。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-丙氨酸常被用作氨基酸類營(yíng)養(yǎng)藥，同時(shí)L-丙氨酸也是制造維生素B6、合成泛酸鈣和其他有機(jī)化合物的重要原料。
[0003]目前，L-丙氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。其中化學(xué)合成法主要有丙酸氯化氨化法、α -溴丙酸氯化法和氰醇法。這些方法都需要石油基原材料，如丙酸、α-溴丙酸、乙醛和氫氰酸等，因此成本受困于原油價(jià)格。隨著石油價(jià)格的提升，成本會(huì)越來(lái)越高。另外，這些方法都是經(jīng)過(guò)復(fù)雜的化學(xué)催化完成的，污染重，分離提取成本高，不適合可持續(xù)發(fā)展的需要。
[0004]生物法生產(chǎn)L-丙氨酸目前主要是以L-天冬氨酸為原料，在天冬氨酸-β -脫羧酶的催化下進(jìn)行脫羧反應(yīng)生產(chǎn)L-丙氨酸。該方法是目前國(guó)內(nèi)L-丙氨酸生產(chǎn)廠家主要使用的生產(chǎn)技術(shù)。但是由于該方法中的原材料天冬氨酸的生產(chǎn)是以順酐為原料的，因此L-丙氨酸的生產(chǎn)成本依舊依賴于石油價(jià)格。隨著石油資源的匱乏和價(jià)格的提升，順酐資源的緊張和價(jià)格上漲將導(dǎo)致天冬氨酸的供給存在巨大的隱患，從而會(huì)影響到L-丙氨酸的生產(chǎn)及成本。
[0005]隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，近年來(lái)使用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸的研究越來(lái)越受到重視。微生物發(fā)酵法能夠?qū)崿F(xiàn)以葡萄糖等糖類為原料生產(chǎn)L-丙氨酸。葡萄糖屬于可再生的生物質(zhì)資源，可以通過(guò)廣泛存在于自然界中的木質(zhì)纖維素降解獲得。因此，使用其作為原材料，能夠使L-丙氨酸的生產(chǎn)成本保持在穩(wěn)定的水平，具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。目前，已經(jīng)有多株能夠生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株的報(bào)道。Smith等構(gòu)建了一株Ε.coliALS929 (PTrc99A-alaD)菌株，其中在質(zhì)粒中表達(dá)的丙氨酸脫氫酶AlaD能夠?qū)麅?nèi)生成的丙酮酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-丙氨酸，該菌株經(jīng)過(guò)48小時(shí)發(fā)酵后，能夠生產(chǎn)88g/L的L-丙氨酸。Lee等構(gòu)建了一株E.coli ALA887 (pTrc99A-alaD)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)能夠在27小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)32g/L的L-丙氨酸。在這些菌株中，丙氨酸脫氫酶是生產(chǎn)L-丙氨酸的關(guān)鍵步驟，在報(bào)道的菌株中，編碼該蛋白的基因一般是通過(guò)高拷貝質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)的。在進(jìn)行菌株培養(yǎng)基發(fā)酵過(guò)程中，需要添加抗生素來(lái)維持質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。這些因素將導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程工藝復(fù)雜并提高L-丙氨酸生產(chǎn)的成本。因此，隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的L-丙氨酸生產(chǎn)菌株并經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸將是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。[0006]目前菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸使用的都是由蒸餾水配置的培養(yǎng)基，蒸餾水在工業(yè)生產(chǎn)中提高了生產(chǎn)的成本。開(kāi)發(fā)能夠直接使用自來(lái)水配置的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株并用于生產(chǎn)，將極大的降低L-丙氨酸的生產(chǎn)成本。但是相對(duì)于蒸餾水，自來(lái)水中存在大量的離子并且濃度較高。為了獲得能夠直接使用自來(lái)水配置的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵的菌株，需要提高菌株對(duì)高離子濃度的耐受力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā) 明的一個(gè)目的是提供構(gòu)建重組菌A的方法。
[0008]本發(fā)明提供的構(gòu)建重組菌A (XZ-A43)的方法，包括如下步驟:將出發(fā)菌染色體上的1n蛋白編碼基因替換為1n*蛋白的編碼基因，得到的重組菌A ;
[0009]所述1n*蛋白的氨基酸序列為將所述1n蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突變?yōu)樘於彼酓。
[0010]上述方法中，所述1n*蛋白為由序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸編碼的蛋白。
[0011]上述方法中，所述1n*蛋白編碼基因?yàn)閷⑺?n蛋白編碼基因核苷酸序列第1310位的堿基為C突變?yōu)锳得到的基因。
[0012]上述方法中，所述1n*蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸；
[0013]所述將出發(fā)菌染色體上的1n蛋白編碼基因替換為1n*蛋白編碼基因具體為將含有所述1n*蛋白編碼基因的DNA片段II同源重組到所述出發(fā)菌中；
[0014]所述DNA片段II的核苷酸序列尤其具體為序列表中序列2。
[0015]上述方法中，所述出發(fā)菌為通過(guò)將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)而得的基因工程菌；
[0016]所述出發(fā)菌具體為大腸桿菌XZ-A26CGMCC N0.4036?
[0017]上述同源重組具體通過(guò)兩步進(jìn)行:
[0018]1)將DNA片段I導(dǎo)入帶有pKD46的大腸桿菌工程菌株XZ-A26中，進(jìn)行第一次同源重組，得到中間菌XZ-A42 ；
[0019]2)將DNA片段II導(dǎo)入所述中間菌XZ-A42中，進(jìn)行第二次同源重組，得到重組菌XZ-A43 (重組菌 A)。
[0020]由上述的方法制備的重組菌A也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0021]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建重組菌B (XZ-A47)的方法。
[0022]本發(fā)明提供的構(gòu)建重組菌B的方法，包括如下步驟:將上述的出發(fā)菌染色體上的1n編碼蛋白基因替換為1n*蛋白的編碼基因，且將所述出發(fā)菌染色體上的clpA蛋白編碼基因突變?yōu)閏lpA*蛋白的編碼基因，得到的重組菌B ;
[0023]所述1n*蛋白的氨基酸序列為將所述1n蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突變?yōu)樘於彼酓 ；
[0024]所述clpA*蛋白的氨基酸序列為將所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位異亮氨酸I突變?yōu)榻z氨酸S。[0025]上述方法中，所述clpA*蛋白為由序列表中序列4自5’末端第1-2272位核苷酸編碼的蛋白。
[0026]上述方法包括如下步驟:先所述出發(fā)菌染色體上的1n編碼蛋白基因替換為1n*蛋白的編碼基因，得到重組菌A，再將所述重組菌A染色體上的clpA蛋白編碼基因替換為clpA*蛋白的編碼基因，得到的重組菌B;上述方法中，所述1n*蛋白編碼基因?yàn)閷⑺?n蛋白編碼基因核苷酸序列第1310位的堿基為C突變?yōu)锳得到的基因；
[0027]所述clpA*蛋白編碼基因?yàn)閷⑺鯿lpA蛋白編碼基因核苷酸序列第1895位的堿基為T突變?yōu)镚得到的基因；
[0028]所述1n*蛋白編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸；
[0029]所述clpA*蛋白編碼基因的核昔酸序列具體為序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸；
[0030]上述方法包括如下步驟:
[0031]所述將出發(fā)菌染色體上的1n編碼蛋白基因替換為1n*蛋白的編碼基因?yàn)閷⒑兴?n*蛋白編碼基因的DNA片段III同源重組到所述出發(fā)菌中；
[0032]所述將所述中間菌染色體上的ClpA蛋白編碼基因替換為clpA*蛋白的編碼基因?yàn)閷⒑兴鯿lpA*蛋白編碼基因的DNA片段IV同源重組到所述重組菌A中；
[0033]所述DNA片段III的核苷酸序列具體為序列表中序列3 ；
[0034]所述DNA片段IV的核苷酸序列具體為序列表中序列4。
[0035]上述方法具體通過(guò)兩步同源重組進(jìn)行:
[0036]I)將DNA片段III導(dǎo)入帶有PKD46的大腸桿菌工程菌株XZ-A43中，進(jìn)行第一次同源重組，得到中間菌XZ-A46 ；
[0037]2)將DNA片段IV導(dǎo)入所述中間菌XZ-A46中，進(jìn)行第二次同源重組，得到重組菌XZ-A47 (重組菌 B)。
[0038]由上述的方法制備的重組菌B也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0039]上述的重組菌A或上述的重組菌B在產(chǎn)生和/或提高L-丙氨酸中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0040]所述產(chǎn)生和/或提高L-丙氨酸具體為將所述重組菌A或所述重組菌B在自來(lái)水作為溶劑配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生成。
[0041]或一種產(chǎn)生L-丙氨酸的方法，包括如下步驟:在自來(lái)水作為溶劑配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵重組菌A或所述重組菌B，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到L-丙氨酸。
[0042]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建了兩種重組菌，一種為將大腸桿菌工程菌XZ-A26中的1n基因進(jìn)行突變，得到的重組菌XZ-A43，另一種為將大腸桿菌工程菌XZ-A26中的1n基因和clpA基因進(jìn)行突變，得到的重組菌XZ-A47 ;這兩種重組菌不僅能夠提高L-丙氨酸產(chǎn)量，而且還可以在自來(lái)水配置的發(fā)酵培養(yǎng)基中高產(chǎn)L-丙氨酸，采用自來(lái)水配置可以節(jié)約成本。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。[0044]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045]大腸桿菌工程菌XZ-A26CGMCC N0.4036，于2010年7月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.4036，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。該菌株能夠在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸。
[0046]下述實(shí)施例中的自來(lái)水取自首創(chuàng)自來(lái)水公司山海關(guān)分公司(硬度:2-3mmol/L、ρΗ=6.5-7.5、電導(dǎo)率:400-600 μ s/cm、氯化物 100_250mg/L、硫酸鹽 100_250mg/L)。
[0047]下述實(shí)施例中的蒸餾水(硬度O、ρΗ=7.0-8.0、電導(dǎo)率:5μ s/cm)
[0048]實(shí)施例1、用自來(lái)水配置的培養(yǎng)基篩選產(chǎn)L-丙氨酸且耐自來(lái)水菌株
[0049]1、對(duì)比蒸餾水和自來(lái)水配置的培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌工程菌XZ-A26發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的影響
[0050]大腸桿菌工程菌XZ-A26CGMCC N0.4036 (具體特征見(jiàn)表1)，能夠在蒸餾水配置的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)L-丙氨酸。然而，由于工業(yè)發(fā)酵中使用蒸餾水成本太高，因此希望能直接使用自來(lái)水配置培養(yǎng)基。
[0051]因此，對(duì)比了蒸餾水和自來(lái)水配置的培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌工程菌XZ-A26發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的影響。
[0052]表1生產(chǎn)L-丙氨酸的重組大腸桿菌
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建重組菌A的方法，包括如下步驟:將出發(fā)菌染色體上的1n蛋白編碼基因替換為1n*蛋白的編碼基因，得到的重組菌A ; 所述1n*蛋白的氨基酸序列為將所述1n蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突變?yōu)樘於彼酓。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述1n*蛋白編碼基因?yàn)閷⑺?n蛋白編碼基因核苷酸序列第1310位的堿基為C突變?yōu)锳得到的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述1n*蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸； 所述將出發(fā)菌染色體上的1n蛋白編碼基因替換為1n*蛋白編碼基因具體為將含有所述1n*蛋白編碼基因的DNA片段II同源重組到所述出發(fā)菌中； 所述DNA片段II的核苷酸序列尤其具體為序列表中序列2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述出發(fā)菌為通過(guò)將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)而得的基因工程菌； 所述出發(fā)菌具體為大腸桿菌XZ-A26CGMCC N0.4036。
5.由權(quán)利要求1-4中任一所述的方法制備的重組菌A。
6.—種構(gòu)建重組菌B的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1-4中任一所述的方法中所述的出發(fā)菌染色體上的1n編碼蛋白基因替換為1n*蛋白的編碼基因，且將所述出發(fā)菌染色體上的clpA蛋白編碼基因替換為clpA*蛋白的編碼基因，得到的重組菌B ； 所述1n*蛋白的氨基酸序列為將所述1n蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突變?yōu)樘於彼酓 ; 所述clpA*蛋白的氨基酸序列為將所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位異亮氨酸I突變?yōu)榻z氨酸S。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟:先所述出發(fā)菌染色體上的1n編碼蛋白基因替換為1n*蛋白的編碼基因，得到重組菌A，再將所述重組菌A染色體上的clpA蛋白編碼基因替換為clpA*蛋白的編碼基因，得到的重組菌B ； 所述1n*蛋白編碼基因?yàn)閷⑺?n蛋白編碼基因核苷酸序列第1310位的堿基為C突變?yōu)锳得到的基因； 所述clpA*蛋白編碼基因?yàn)閷⑺鯿lpA蛋白編碼基因核苷酸序列第1895位的堿基為T突變?yōu)镚得到的基因； 所述1n*蛋白編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸； 所述clpA*蛋白編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟:所述將出發(fā)菌染色體上的1n編碼蛋白基因替換為1n*蛋白的編碼基因?yàn)閷⒑兴?n*蛋白編碼基因的DNA片段III同源重組到所述出發(fā)菌中； 所述將所述中間菌染色體上的clpA蛋白編碼基因替換為clpA*蛋白的編碼基因?yàn)閷⒑兴鯿lpA*蛋白編碼基因的DNA片段IV同源重組到所述重組菌A中； 所述DNA片段III的核苷酸序列具體為序列表中序列3 ； 所述DNA片段IV的核苷酸序列具體為序列表中序列4。
9.由權(quán)利要求6-8中任一所述的方法制備的重組菌B。
10.權(quán)利要求5所述的重組菌A或權(quán)利要求6所述的重組菌B在產(chǎn)生和/或提高L-丙氨酸中的應(yīng)用； 所述產(chǎn)生和/或提高L-丙氨酸具體為將所述重組菌A或所述重組菌B在自來(lái)水作為溶劑配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生成。 或一種產(chǎn)生L-丙氨酸的方法，包括如下步驟:在自來(lái)水作為溶劑配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵重組菌A或所 述重組菌B，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到L-丙氨酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK103898089SQ201410140630
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】張學(xué)禮, 郭恒華, 張冬竹 申請(qǐng)人:安徽華恒生物科技股份有限公司