硫磺礦硫化葉菌中（+）γ-內(nèi)酰胺酶的編碼基因及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】硫磺礦硫化葉菌中（+）γ-內(nèi)酰胺酶的編碼基因及應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域，還提供了該（+）γ-內(nèi)酰胺酶在拆分消旋體γ-內(nèi)酰胺中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的（+）γ-內(nèi)酰胺酶是下述（a）蛋白：（a）由序列表中的SEQ?ID?NO:1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，其具有拆分消旋體γ-內(nèi)酰胺活性的由SEQ?ID?NO:1衍生的蛋白質(zhì)。在拆分消旋體γ-內(nèi)酰胺從而獲得光學(xué)純（-）γ-內(nèi)酰胺的應(yīng)用中，該酶在高溫下還具有很高的生物活性，獲得的（-）γ-內(nèi)酰胺的光學(xué)純度達(dá)99%以上，轉(zhuǎn)化率達(dá)到49%。
【專(zhuān)利說(shuō)明】硫磺礦硫化葉菌中(+) Y -內(nèi)酰胺酶的編碼基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，涉及來(lái)源于硫磺礦硫化葉菌中第二種新的(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶的編碼基因，及該(+) Y-內(nèi)酰胺酶在拆分消旋體Y-內(nèi)酰胺中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]20世紀(jì)90年代國(guó)際上興起了一項(xiàng)為人類(lèi)造福的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)一手性藥物，這是醫(yī)藥界的一次重大變革。(-)2-氮雜雙環(huán)-[2，2，I]-庚烷-5-烯-3-酮(簡(jiǎn)稱(chēng)(-)Y -內(nèi)酰胺)是合成抗艾滋病藥物阿巴卡韋和抗流感藥物帕拉米韋重要手性中間體。近幾年，科學(xué)家利用酶的專(zhuān)一性，用微生物酶法高效性拆分消旋體Y -內(nèi)酰胺，從而得到(_) Y -內(nèi)酰胺。具有對(duì)環(huán)境友好，節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]目前報(bào)道的能拆分消旋體Y -內(nèi)酰胺的微生物有硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus P2)、氧化經(jīng)微桿菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)> 嗜酸叢毛菌(Comomonas acidovorans)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、突光假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)、青枯假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、嗜熱泉生古細(xì)菌(Aeropyrum pernix)。由于野生菌生長(zhǎng)緩慢，蛋白表達(dá)量低、不穩(wěn)定等諸多缺陷，構(gòu)建相應(yīng)的基因工程菌并用于工業(yè)化生產(chǎn)備受青睞。但是只有硫磺礦硫化葉菌、嗜酸叢毛菌、大豆慢生根瘤菌及嗜熱泉生古細(xì)菌找到了相應(yīng)的編碼基因并完成基因工程菌構(gòu)建，純化出了相應(yīng)的(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶。
[0004]本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于從硫磺礦硫化葉菌中找到一種(+ ) Y內(nèi)酰胺酶，此種(+ )Y-內(nèi)酰胺酶的編碼氨基酸與硫磺礦硫化葉菌中已發(fā)現(xiàn)的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶完全不同。這是首次從同一種菌中發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型卻具有相同功能的(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶。
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種新的、高效的能拆分消旋體Y -內(nèi)酰胺的(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶。
[0006]本發(fā)明所提供的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶，來(lái)源于硫磺礦硫化葉菌，是如下(a)的蛋白:
[0007](a)由序列表中序列SEQ ID No:1所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；
[0008]其中，序列表中的SEQ ID No:1是由318個(gè)氨基酸構(gòu)成。
[0009]上述(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。它是具有以下核苷酸序列之一:
[0010]Ca)序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0011](b)編碼序列表中SEQ ID NO:1蛋白氨基酸序列對(duì)應(yīng)的多核苷酸。
[0012]其中，序列表中的SEQ ID N0:2由957個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5，端的ATG起始密碼子到3，端的TAA終止密碼子的完整開(kāi)放閱讀框。
[0013]一種重組載體，其特征在于:其上述的編碼基因包括的核苷酸序列，原核表達(dá)載體為 PET30 或者 pET28。
[0014]—種表達(dá)宿主,其特征在于:含有上述的重組載體，一般表達(dá)宿主為大腸桿菌。
[0015]所述的硫磺礦硫化葉菌中(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶的應(yīng)用，為在拆分消旋體Y -內(nèi)酰胺從而得到(-)Y-內(nèi)酰胺的應(yīng)用。
[0016]所述應(yīng)用為:將消旋體Y -內(nèi)酰胺底物加入0.5M，pH7.4的磷酸緩沖液中，使消旋體Y -內(nèi)酰胺底物濃度在0.005M-0.1M之間；然后向其中加入( + )Υ_內(nèi)酰胺酶，在90°C轉(zhuǎn)化5_24h,制得(-)Y-內(nèi)酸胺。
[0017]進(jìn)一步，純化(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶蛋白采用熱處理去除雜蛋白從而得到純的(+ )Y-內(nèi)酰胺酶的。
[0018]進(jìn)一步，純化的(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶在拆分Y -內(nèi)酰胺的時(shí)加入Ni2+或Zn2+。
[0019]本發(fā)明所述的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶是按照下述方法構(gòu)建的:硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus P2)基因組DNA為中科院微生物所王建軍研究員惠贈(zèng)。以硫磺礦硫化葉菌基因組為模版，設(shè)計(jì)目的基因的引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR情況，然后回收957bp的條帶?；厥债a(chǎn)物用T4連接酶連接到T載體上并轉(zhuǎn)入DH5 α中，涂布到涂有x-gal和IPTG的氨芐霉素平板上(藍(lán)白斑篩選)，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。之后以白斑為模版，進(jìn)行菌落PCR，將克隆出條帶的菌送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的菌轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，提取該菌質(zhì)粒，并用Hind III，Nde I酶于37°C酶切該質(zhì)粒以及PET30載體。1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切情況并分別回收酶切成功的目的基因及PET30載體。回收后的產(chǎn)物在T4連接酶作用下進(jìn)行連接，再次轉(zhuǎn)化到DH5a中，并涂布到含卡那霉素的平板上，進(jìn)行菌落PCR。將克隆出條帶的對(duì)應(yīng)菌再次送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確后提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL-21 (DE3)表達(dá)感受態(tài)中，用終濃度為2.5g/L的乳糖誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白。
[0020]本發(fā)明所述的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶還可以通過(guò)化學(xué)合成其編碼基因，通過(guò)常規(guī)基因操作手段將此化學(xué)合成的基因構(gòu)建到表達(dá)載體，并導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子，表達(dá)得到(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶。
[0021]用于構(gòu)建含有上述(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶編碼基因的重組表達(dá)載體可以為基因工程菌領(lǐng)域中的表達(dá)載體，其載體包括PET系列載體，pUC系列載體等。選擇的宿主細(xì)胞是與上述載體對(duì)應(yīng)的宿主，一般優(yōu)先選擇大腸桿菌(BL21(DE3)pLysS、E.coli JM109、E.coli HBlOUE.coli DH5 a等)。表達(dá)后的蛋白以已知的純化方法進(jìn)行純化。
[0022]本發(fā)明所述(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶可以用來(lái)拆分消旋體Y -內(nèi)酰胺，并得到99%以上的光學(xué)純(-)Y-內(nèi)酰胺。由于該蛋白耐熱性好，在100°C下還能保持很高的活性，因此本實(shí)驗(yàn)為了提高酶的反應(yīng)效率，用高溫煮蛋白來(lái)除去雜蛋白，并通過(guò)超濾管millipore對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行濃縮。
[0023]對(duì)于本發(fā)明所述的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶的酶學(xué)性質(zhì)，主要從最適溫度，最適pH，溫度穩(wěn)定性，金屬離子對(duì)酶活的影響等幾個(gè)方面進(jìn)行考察。
[0024]本發(fā)明的意義主要在于:在同一種菌中發(fā)現(xiàn)了另一種(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶的編碼基因，并且此基因表達(dá)的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶耐熱性很高，對(duì)消旋體Y-內(nèi)酰胺的拆分活性ee值達(dá)到99%以上。
[0025]下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方法做進(jìn)一步說(shuō)明。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】 [0026]圖1以硫磺礦硫化葉菌基因組為模版擴(kuò)增目的片段的核酸電泳圖，[0027]泳道I，PCR產(chǎn)物；泳道M，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量
[0028]圖2重組菌表達(dá)前后對(duì)比及純化后蛋白SDS-PAGE圖，
[0029]泳道1，重組菌誘導(dǎo)前；泳道2，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，泳道3，重組菌的純化；泳道M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；
[0030]圖3重組菌拆分消旋體Y -內(nèi)酰胺HPLC圖譜。
[0031]A沒(méi)有經(jīng)過(guò)酶拆分的消旋體Y -內(nèi)酰胺的HPLC分析圖；B經(jīng)過(guò)(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶拆分后獲得(_) Y -內(nèi)酰胺HPLC圖譜；其中，I一乙酸乙酯，2 —( + ) Y -內(nèi)酰胺，3 —Y -內(nèi)酰胺。
[0032]圖4 ( + ) Y-內(nèi)酰胺酶學(xué)性質(zhì)的表征
[0033]a: ( + ) Y -內(nèi)酸胺酶最適溫度；
[0034]b: ( + ) Y -內(nèi)酸胺酶最適pH ；
[0035]c:( + ) Y-內(nèi)酰胺酶的熱穩(wěn)定性；
[0036]d:金屬離子對(duì)(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶活性影響。
【具體實(shí)施方式】
[0037]以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0038]實(shí)施例1本發(fā)明的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶基因的獲得
[0039](I)設(shè)計(jì)(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶基因的引物
[0040]根據(jù)上述基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下(由上海生工合成):
[0041]( + ) Y -內(nèi)酰胺酶基因上游引物:
[0042]5，-GGG AAT TCC ATA TGC AAT ATA CTA TTC ACG-3，
[0043]下劃線(xiàn)表示Nde I酶切位點(diǎn)；
[0044]( + ) Y -內(nèi)酰胺酶基因下游引物:
[0045]5，-ATA TAA GCT TTT ATA ATA CCT CCA CGT TTA C-3，
[0046]下劃線(xiàn)表示Hind III酶切位點(diǎn)；
[0047](2) PCR擴(kuò)增及基因克隆
[0048]以硫磺礦硫化葉菌基因組為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為(50 μ I):1 μ I基因組，4 μ I dNTP Mixture，I單位(U)的rTaq酶，I μ I上游引物，1μ I下游引物，用水補(bǔ)齊。PCR條件:第一步熱變性95°C，5分鐘，第二步熱變性95°C，I分鐘，第三步退火溫度68°C，I分鐘(每循環(huán)一次降I°c)，第四步延伸72°C，I分鐘，第五步熱變性95°C，I分鐘，第六步退火55°C，I分鐘，第七步延伸72°C，I分鐘，弟八步延伸72°C，10分鐘，第二步到第四步之間設(shè)置15個(gè)循環(huán)，第五步到第七步之間設(shè)置20個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后電泳檢測(cè)(附圖1)。
[0049]PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳結(jié)束后用膠回收試劑盒(QIAGEN)回收目的片段，操作方法嚴(yán)格按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作。回收后的PCR產(chǎn)物、以及pET30載體分別都用Nde I和Hind III酶在37°C下酶切過(guò)夜，再在T4連接酶作用下連接，從而構(gòu)建好重組質(zhì)粒。
[0050]實(shí)施例2本發(fā)明重組菌中目的蛋白(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶的表達(dá)和純化
[0051]用熱激發(fā)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coil BL21(DE3)pLysS)中，獲得轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化好的菌接到5ml LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，37°C下過(guò)夜培養(yǎng)，再按照1%的接種量轉(zhuǎn)接到50ml LB液體培養(yǎng)(含卡那霉素)中，37°C培養(yǎng)到菌的OD值達(dá)到0.6-1.0時(shí)，加入終濃度為2.5g/L的乳糖于16°C下誘導(dǎo)過(guò)夜。離心收集菌體,再加入去離子水清洗2-3次，最后將菌體重懸到一定量的磷酸緩沖液中進(jìn)行超聲破碎(360W，超聲3秒，間隔5秒，總共40分鐘)。將破碎溶液離心，收集上清液，將上清液至于100°C下煮I小時(shí)。之后將煮后溶液在1000Orpm下離心15min,取上清液。接下來(lái)用0.22um濾膜過(guò)濾上清液，以除去大顆粒雜質(zhì)。過(guò)濾后的溶液置于超濾管millipore中，于4°C下濃縮蛋白液。SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)誘導(dǎo)前(泳道I)誘導(dǎo)后(泳道2)及純化后(泳道3)蛋白(附圖2)。重組菌中(+ ) Y -內(nèi)酰胺酶蛋白表觀分子量為35kDa。
[0052]實(shí)施例3 (+) Y -內(nèi)酰胺酶在消旋體Y -內(nèi)酰胺拆分中的應(yīng)用
[0053]( I)轉(zhuǎn)化率、ee值測(cè)定和Y -內(nèi)酰胺手性分析方法
[0054]
【權(quán)利要求】
1.硫磺礦硫化葉菌中(+) Y -內(nèi)酰胺酶，表達(dá)的蛋白質(zhì)如下: Ca)由序列表中的SEQ ID NO:1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)。
2.一種包含權(quán)利要求1所述的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶的編碼基因，其特征在于:這種(+ )Y-內(nèi)酰胺酶的編碼基因具有下列核苷酸序列之一: Ca)序列表中SEQ ID No:2所示的核苷酸序列； (b)編碼序列表中SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列對(duì)應(yīng)的多核苷酸序列。
3.—種重組載體，其特征在于:其含有權(quán)利要求2所示的編碼基因包括的核苷酸序列，原核表達(dá)載體為PET30或者pET28。
4.一種表達(dá)宿主,其特征在于:含有權(quán)利要求3所不的重組載體,一般表達(dá)宿主為大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫磺礦硫化葉菌中(+) Y-內(nèi)酰胺酶的應(yīng)用，為在拆分消旋體Y -內(nèi)酰胺從而得到(_) Y -內(nèi)酰胺的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為:將消旋體Y-內(nèi)酰胺底物加入0.5M，pH7.4的磷酸緩沖液中，使消旋體Y -內(nèi)酰胺底物濃度在0.005M-0.1M之間；然后向其中加入(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶，在90°C轉(zhuǎn)化5-24h，制得(-)Y-內(nèi)酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，純化(+) Y-內(nèi)酰胺酶蛋白采用熱處理去除雜蛋白從而得到純的(+ ) Y-內(nèi)酰胺酶的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，純化的(+) Y-內(nèi)酰胺酶在拆分Y-內(nèi)酰胺的時(shí)加入Ni2+ 或 Zn2+。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103992992SQ201410140274
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】鄭國(guó)鈞, 黃蓉 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)