一種檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測結(jié)合分枝桿菌復(fù)合群的引物對及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的引物對具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。本發(fā)明還提供了利用所述引物對檢測待測樣本中是否含有結(jié)合分枝桿菌復(fù)合群的方法。本發(fā)明所提供的檢測方法無需等待4-8周時間等待檢測結(jié)果，省時；無需價格昂貴的大型儀器，也無需特殊的抗體或熒光試劑，只需普通的PCR儀及其試劑，即可進(jìn)行實驗；檢測結(jié)果簡單明了，易于判斷；檢測陽性率高。
【專利說明】—種檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，涉及一種檢測結(jié)合分枝桿菌復(fù)合群的引物對及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是目前嚴(yán)重威脅人民身體健康的慢性傳染病之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾將結(jié)核病與aids、瘧疾一起列為人類的最主要?dú)⑹?。由于抗結(jié)核藥物的濫用以及艾滋病毒(HIV)等感染而使結(jié)核病的疫情再次回升。據(jù)WHO估算，全球大約有1/3人口已感染結(jié)核病，每年新發(fā)生肺結(jié)核患者約130萬人，每年約有13萬人死于結(jié)核病，每年近10萬個多藥耐藥結(jié)核(MDR-TB)病例。但結(jié)核病只要早期診斷并合理用藥，絕大多數(shù)的結(jié)核病是可以治愈的。我國作為人口大國，人口流動性較大，不易對結(jié)核病患者進(jìn)行管理，容易造成肺結(jié)核病在人群中的傳播。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，包括結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)和田鼠分枝桿菌(M.microti)等，其中結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的主要病因。早期快速、有效的診斷和治療是結(jié)核病控制的關(guān)鍵。
[0003]目前臨床檢測結(jié)核分枝桿菌的主要方法是細(xì)菌學(xué)檢測，包括痰涂片抗酸染色檢查和細(xì)菌培養(yǎng)。痰涂片抗酸染色檢查法是全世界最普遍使用的檢測方法，它簡便、快速、價廉，當(dāng)天即可出結(jié)果，但敏感性低，陽性率在25%-35%。細(xì)菌培養(yǎng)法一直以來都是診斷結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”，靈敏度略高于痰涂片抗酸染色法，但其培養(yǎng)周期長，一般4-8周才能獲得結(jié)果。實驗室研究的氣相色 譜法需要高精密度分析儀，分析過程的條件選擇和質(zhì)量控制都需嚴(yán)格要求。從1985年Mullis創(chuàng)建了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，到1989年Hance等首先將該技術(shù)應(yīng)用于檢測分枝桿菌，再到1990年我國引進(jìn)該項技術(shù)，從而開辟了以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌階段。由于PCR具有快速、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，非常適合結(jié)核分枝桿菌這類生長緩慢細(xì)菌的快速診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種檢測結(jié)合分枝桿菌復(fù)合群的引物對及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的用于檢測或輔助檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對，具體為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。
[0006]進(jìn)一步，組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子的摩爾比可為1:1。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測或輔助檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的試劑盒。
[0008]本發(fā)明所提供的試劑盒具體可含有所述引物對、dNTP和DNA聚合酶。
[0009]制備所述引物對和所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]進(jìn)一步，制備所述引物對的方法，具體可包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝的步驟。
[0011]制備所述試劑盒的方法，具體可包括如下步驟:將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與如下物質(zhì)包裝于同一個試劑盒內(nèi):dNTP和DNA聚合酶。
[0012]所述引物對，或所述試劑盒在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:(I)在檢測或輔助檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的非疾病診斷目的的應(yīng)用；(2)在制備檢測或輔助檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的又一個目的是提供一種利用所述引物對，或所述試劑盒檢測待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的非疾病診斷目的的方法。
[0014]本發(fā)明所提供的利用所述引物對，或所述試劑盒檢測待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的非疾病診斷目的的方法，具體可包括如下步驟:
[0015](I)從待測樣本中提取DNA作為模板，采用所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；
[0016](2)根據(jù)步驟(1)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群:若PCR產(chǎn)物中含有大小為344bp的DNA片段，則所述待測樣本中含有或候選含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；若PCR產(chǎn)物中不含有大小為344bp的DNA片段，則所述待測樣本中不含有或候選不含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。
[0017]在所述方法的步驟(1)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件具體為94°C 5min ；30個循環(huán):94°C 30sec,56°C 30sec,72°C 45sec ;最終延伸 72°C 7min。
[0018]在所述方法的步驟(1)中，在進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，所述引物對中每條單鏈DNA分子的終濃度均為0.5 μ M。
[0019]進(jìn)一步，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體為2XPremix TaqlO μ 1，10 μ M的上下游引物各I μ I (終濃度均為0.5 μ Μ), DNA模板I μ 1，補(bǔ)雙蒸水7 μ I至20 μ I體系。
[0020]其中，所述2XPremix Taq 由 TaKaRa Taq (1.25U/25 μ I)、dNTP Mixture (2X ；各0.4mM)、Taq Buffer (2X ；3mM Mg2+)、色素Marker、比重增加物和穩(wěn)定劑組成。在本發(fā)明的一個實施例中，所述2 X Premix Taq具體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為RR901A。
[0021]在上述方法的步驟(1)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時采用的退火溫度具體可為56°C。
[0022]在實際應(yīng)用中，判斷所述PCR產(chǎn)物中是否含有大小為344bp的DNA片段，可通過將所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，若電泳結(jié)果顯示有大小為344bp目的條帶，則所述PCR產(chǎn)物中含有大小為344bp的DNA片段；反之，則不含有大小為344bp的DNA片段。
[0023]在所述方法中，所述大小為344bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3所
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[0024]在上述方法中，所述待測樣本可為痰液樣本。
[0025]在本發(fā)明中，以上所有的所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群均具體可為如下中的至少一種:結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。
[0026]在本發(fā)明的一個實施例中，所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群具體為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV，或牛分枝桿菌菌株93006。
[0027]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有如下優(yōu)點(diǎn):無需等待4-8周時間等待檢測結(jié)果，省時；無需價格昂貴的大型儀器，也無需特殊的抗體或熒光試劑，只需普通的PCR儀及其試劑，即可進(jìn)行實驗；檢測結(jié)果簡單明了，易于判斷；檢測陽性率高?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0028]圖1為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV對本發(fā)明所提供的引物對(引物I和引物2)最佳退火溫度的鑒定。其中，M:Trans2K plus DNA Marker ；1:退火溫度50°C ;2:退火溫度52°C ；3:退火溫度54°C ；4:退火溫度56°C ；5:退火溫度58°C ；N:陰性對照。
[0029]圖2為供試菌株對本發(fā)明所提供的引物對(引物I和引物2)的特異性的鑒定。其中，M:Trans2K plus DNA Marker ;1:結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV ;2:牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis) 93006 ；3:堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii) ATCC12478 ；4:陰性對照。
[0030]圖3為采用本發(fā)明所提供的引物對(引物I和引物2)對30個臨床確診為結(jié)核病患者痰液樣本的PCR檢測結(jié)果。其中，M:Trans2K plus DNA Marker ;N為陰性對照;1_30:30個結(jié)核病患者的痰液樣本。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033]堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii) ATCC12478 菌株:記載于 “F Papa, M Riviere, J J Fournie,et al.Specificity of a Mycobacteriumkansasii phenolic glycolipid (mycoside A)immunoserum.Journal of ClinicalMicrobiology, 1987，2270-2273” 一文中的 “M.kansasii ATCC12478，，。
[0034]結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)93006:記載于“張媛媛,黃明翔，趙秀療等.Spoligotyping結(jié)合多位點(diǎn)PCR用于牛分枝桿菌卡介苗的快速鑒定.中國人獸共患病學(xué)報，2011，27 (8): 712-720”一文。
[0035]實施例1、用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對的設(shè)計及鑒定
[0036]一、用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對的設(shè)計
[0037]本實施例針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的插入序列IS1081，設(shè)計如下引物I和引物2作為用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性引物對。
[0038]引物I (序列 I):5，-CGGGTACTCGACGCTCTGA-3’(序列 3 的第 1-19 位)；
[0039]引物2 (序列 2):5’ -GTGTTGGTGGTTTGCTGCTT-3’(序列 3 的第 325-344 位的反向互補(bǔ)序列)。
[0040]理論上，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為序列表中序列3所示的344bp DNA片段。
[0041]二、反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0042]供試菌株:屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37RV。
[0043]本發(fā)明的發(fā)明人以供試菌株的基因組DNA為模板，采用步驟一設(shè)計的引物對在不同退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定最佳退火溫度。
[0044]反應(yīng)體系(20μ I):2XPremix TaqlO μ 1，10 μ M的上下游引物(引物I和引物2)各ΙμL (終濃度均為0.5μΜ)，DNA模板ΙμL，補(bǔ)雙蒸水7μ1至20μ1體系。其中，2 XPremix Taq為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為RR901A，具體由TaKaRaTaq (1.25υ/25μ I)、dNTP Mixture (2Χ ;各 0.4mM)、Taq Buffer (2X ；3mM Mg2+)、色素Marker、比重增加物和穩(wěn)定劑組成。
[0045]設(shè)置梯度PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性:94°C 5min ;變性:94 °C 30s,復(fù)性30s，延伸:72°C 45s，循環(huán)次數(shù):30次；最終延伸:72°C 7min。復(fù)性時的退火溫度設(shè)置為:50°C、52°C、54°C、56°C、58°C共 5 個梯度。
[0046]反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠(EB，終濃度為0.5 μ g/ml)染色，用凝膠呈像儀拍照并觀察條帶亮度。結(jié)果顯示退火溫度為56°C的目的條帶(大小約為344bp)相對較亮(圖1),從而確定56°C為最佳退火溫度。
[0047]三、用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對的特異性鑒定
[0048]供試菌株:屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV和牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis) 93006,以及不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii) ATCC12478。
[0049]以供試菌株的基因組DNA為模板，采用步驟一設(shè)計的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0050]反應(yīng)體系(20 μ I):同步驟二。
[0051]反應(yīng)條件:94°C5min ；30 個循環(huán):94°C 30sec、56°C 30sec、72°C 45sec ;最終延伸72 °C 7min。
[0052]實驗同時設(shè)置以水替代模板的陰性對照。
[0053]實驗重復(fù)三次。
[0054]反應(yīng)結(jié)束后，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在電壓為100V條件下電泳40min。理論上，屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37RV 和牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)93006 的 PCR 產(chǎn)物在電泳結(jié)果上應(yīng)顯示大小為344bp (序列3)的目的條帶；而不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)ATCC12478在電泳結(jié)果上應(yīng)不顯示大小為344bp(序列3)的目的條帶。
[0055]結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出，屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37RV 和牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)93006的PCR產(chǎn)物均擴(kuò)增出了大小為344bp的目的條帶，進(jìn)一步將目的條帶測序，其序列正為序列表中序列3 ;而不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii) ATCC12478的PCR產(chǎn)物未擴(kuò)增出了大小為344bp的目的條帶。以上結(jié)果與預(yù)期一致，證明本發(fā)明步驟一所設(shè)計的引物對特異性較強(qiáng)。
[0056]四、檢測待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的方法
[0057]根據(jù)以上步驟三的結(jié)果，總結(jié)得到檢測待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的方法，具體可包括如下步驟:
[0058](1)從待測樣本中提取DNA作為模板，采用所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增(退火溫度56°C)，得到PCR產(chǎn)物；
[0059](2)根據(jù)步驟(1)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群:若PCR產(chǎn)物中含有大小為344bp的DNA片段(序列3)，則所述待測樣本中含有或候選含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；若PCR產(chǎn)物中不含有大小為344bp的DNA片段(序列3)，則所述待測樣本中不含有或候選不含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。[0060]實施例2、用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對進(jìn)行臨床樣本檢測
[0061]待測樣本:30個臨床上通過影像學(xué)、痰涂片以及細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果綜合確診為結(jié)核病患者的痰液樣本。
[0062]一、從待測樣本中提取DNA
[0063](I)挑取約I~3ml痰液于50ml無菌有蓋離心管中，加等體積(或根據(jù)痰液濃稀程度酌情調(diào)整)NALC-NaOH消化液(簡單處理可以用NaOH水溶液處理。如果需要過夜處理就用NALC-NaOH消化液。只提取DNA時可以直接用簡單法。)。
[0064]其中，NALC-NaOH消化液的配方如下:50ml濃度為6% (6g/100ml)氫氧化鈉的水溶液、50ml濃度為2.94% (2.94g/100ml)檸檬酸鈉的水溶液、0.5g N-乙酰-L半胱氨酸。臨用前新鮮配制。
[0065](2)漩渦振蕩，打散痰液，室溫孵育15min ；
[0066](3)加PBS緩沖液(ρΗ6.8)至45ml，4000g離心15min，棄去上清夜；
[0067](4)向沉淀的痰菌樣品加溶菌酶至終濃度為20mg/ml，37°C孵育過夜；加蛋白酶K至終濃度為100mg/ml，56°C孵育lh。然后采用QIAamp DNA minikit試劑盒提取基因組DNA，作為檢測時PCR擴(kuò)增的模板。
[0068]二、PCR 擴(kuò)增
[0069]以步驟一從待測樣本中提取的DNA為模板，采用實施例1步驟一設(shè)計的引物對(弓丨物I和引物2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例1步驟二。實驗同時設(shè)置以雙蒸水為模板作為陰性對照。實驗重復(fù)三次。
[0070]反應(yīng)結(jié)束后，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在電壓為100V條件下電泳40min。根據(jù)電泳結(jié)果，按照實施例1中步驟三的方法確定待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。
[0071]結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，利用本發(fā)明的引物對(引物I和引物2)對30個臨床確診結(jié)核患者痰液樣本進(jìn)行檢測，均擴(kuò)增得到大小為344bp的目的條帶，將這些條帶回收后送樣測序，其序列均為序列表中序列3所示。以上結(jié)果表明，采用本發(fā)明的引物對(引物I和引物2)對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進(jìn)行檢測，其準(zhǔn)確率與臨床采用的細(xì)菌培養(yǎng)法相當(dāng)，但大大縮短的檢測時間，且花費(fèi)少，利用標(biāo)準(zhǔn)的PCR試劑和儀器便可達(dá)到高通量檢測的目的。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測或輔助檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的引物對，其特征在于:所述引物對為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于:組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子的摩爾比為1:1。
3.用于檢測或輔助檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有權(quán)利要求1或2所述的引物對、dNTP和DNA聚合酶。
4.制備權(quán)利要求1或2所述引物對的方法，包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝的步驟。
5.制備權(quán)利要求3所述試劑盒的方法，包括如下步驟:將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與如下物質(zhì)包裝于同一個試劑盒內(nèi):dNTP和DNA聚合酶。
6.權(quán)利要求1或2所述引物對，或權(quán)利要求3所述的試劑盒在檢測或輔助檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的非疾病診斷目的的應(yīng)用，或在制備檢測或輔助檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.利用權(quán)利要求1或2所述引物對，或權(quán)利要求3所述的試劑盒檢測待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的非疾病診斷目的的方法，包括如下步驟: (O從待測樣本中提取DNA作為模板，采用權(quán)利要求1或2所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物； (2)根據(jù)步驟(1)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群:若PCR產(chǎn)物中含有大小為344bp的DNA片段，則所述待測樣本中含有或候選含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；若PCR產(chǎn)物中不含有大小為344bp的DNA片段，則所述待測樣本中不含有或候選不含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:在步驟(1)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時采用的退火溫度為56°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述大小為344bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列3所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的引物對或試劑盒或方法或應(yīng)用，其特征在于:所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群為如下中的至少一種:結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。
【文檔編號】C12N15/11GK103882130SQ201410111291
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】朱寶利, 張衛(wèi)紅, 孫照剛, 苗慧芳, 劉飛, 張瑞芬 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所, 北京曠博生物技術(shù)有限公司, 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院