細(xì)胞培養(yǎng)裝置、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及細(xì)胞培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)裝置、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及細(xì)胞培養(yǎng)方法，其能夠抑制培養(yǎng)液的壓力變動(dòng)、且能抑制氣泡流入到細(xì)胞培養(yǎng)部。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)裝置具有：培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)部(12)；儲(chǔ)藏培養(yǎng)液的儲(chǔ)藏部(14)；連接細(xì)胞培養(yǎng)部(12)與儲(chǔ)藏部(14)的流路；設(shè)于流路的、將培養(yǎng)液從儲(chǔ)藏部(14)輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部(12)的送液單元(16)；設(shè)于流路的、對施加給輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部(12)中的培養(yǎng)液的壓力的變動(dòng)進(jìn)行抑制的壓力均勻化單元(18)；以及設(shè)于細(xì)胞培養(yǎng)部(12)的流出口側(cè)的流路(24E)的、向培養(yǎng)液施加特定壓力的加壓單元(22)。
【專利說明】細(xì)胞培養(yǎng)裝置、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及細(xì)胞培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)裝置、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及細(xì)胞培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]作為細(xì)胞培養(yǎng)裝置，已知有一邊利用泵(送液單元)輸送培養(yǎng)液使其循環(huán)一邊進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。此外，在日本專利第4330436號(hào)公報(bào)中公開了一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其設(shè)有氣體腔室(空氣擋板)，對泵(送液單元)的脈動(dòng)進(jìn)行吸收。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]發(fā)明所要解決的課題
[0004]另外，對于一邊輸送培養(yǎng)液一邊進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置來說，需要持續(xù)長時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)液的輸送。因此，在使用注射器泵等一定容量的泵進(jìn)行輸送的情況下，需要大容量的注射器泵。由于這樣大容量的注射器泵是大型的，因而無法置于顯微鏡的載物臺(tái)上，難以定期觀察細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)。此外，若裝置呈大型化，則可搬動(dòng)性變差，因而在培養(yǎng)液的輸送中，小型的管式泵等是適宜的。
[0005]此處，對于管式泵，其在結(jié)構(gòu)上具有不能避免脈動(dòng)、無法使培養(yǎng)液的流量恒定的問題。此外，本發(fā)明人反復(fù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果確認(rèn)到，若抑制脈動(dòng)、將培養(yǎng)液的流量維持在一定范圍內(nèi)，則能夠避免細(xì)胞的死亡。
[0006]此處，即使是在設(shè)置氣體腔室的情況下，也無法充分吸收泵(送液單元)的脈動(dòng)，培養(yǎng)液的壓力發(fā)生變動(dòng)，無法抑制流量的偏差。即，若由于溫度的變化使氣體腔室的體積變動(dòng)，則作為空氣擋板的彈性模量變動(dòng)，因而難以維持一定的脈動(dòng)抑制功能。此外，若溫度上升，則氣體腔室內(nèi)的空氣膨脹，在培養(yǎng)液中可能會(huì)混入氣泡。并且，若為了回避上述問題而使氣體腔室的容量為大容量，則裝置會(huì)大型化。因此，希望有能夠抑制泵的脈動(dòng)的小型細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
[0007]另一方面，出于pH調(diào)整或細(xì)胞毒性等理由，細(xì)胞培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)液通常含有碳酸系緩沖液成分。因此，在培養(yǎng)液中容易由于溫度變化等而產(chǎn)生二氧化碳等氣泡，該氣泡為細(xì)胞死亡的原因，因而需要抑制氣泡的產(chǎn)生。本發(fā)明人進(jìn)行了上述的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能夠抑制泵的脈動(dòng)、同時(shí)能夠降低氣泡產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)裝置是必要的，從而完成了本發(fā)明。
[0008]考慮到上述事實(shí)，本發(fā)明的課題在于提供可抑制培養(yǎng)液的壓力變動(dòng)且可抑制氣泡流入到細(xì)胞培養(yǎng)部的細(xì)胞培養(yǎng)裝置、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及細(xì)胞培養(yǎng)方法。
[0009]【解決課題的手段】
[0010]本發(fā)明第I方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置具有:培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)部；儲(chǔ)藏培養(yǎng)液的儲(chǔ)藏部；連接所述細(xì)胞培養(yǎng)部與所述儲(chǔ)藏部的流路；送液單元，其設(shè)于所述流路，將所述培養(yǎng)液從所述儲(chǔ)藏部輸送到所述細(xì)胞培養(yǎng)部；壓力均勻化單元，其設(shè)于所述流路，對施加給輸送到所述細(xì)胞培養(yǎng)部中的所述培養(yǎng)液的壓力的變動(dòng)進(jìn)行抑制；以及加壓單元，其設(shè)于所述細(xì)胞培養(yǎng)部的流出口側(cè)的所述流路，向所述培養(yǎng)液施加特定壓力。
[0011]根據(jù)上述發(fā)明，培養(yǎng)液通過送液單元在流路中通過，從儲(chǔ)藏部輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部。此處，在流路中設(shè)置有壓力均勻化單元，對施加給輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部的培養(yǎng)液的壓力的變動(dòng)進(jìn)行抑制。由此可抑制培養(yǎng)液的脈動(dòng)、抑制流量的偏差。
[0012]此外，在細(xì)胞培養(yǎng)部的流出口側(cè)的流路設(shè)置有加壓單元。并且，通過加壓單元對培養(yǎng)液施加特定的壓力，可抑制培養(yǎng)液中的氣體變成氣泡，能夠避免氣泡所致的細(xì)胞死亡。因此，即使例如培養(yǎng)液的溫度發(fā)生變化，也能夠抑制氣泡的發(fā)生。此外可通過對培養(yǎng)液施加壓力使培養(yǎng)液中的氣泡溶解。進(jìn)一步地，若對培養(yǎng)液施加壓力，則與僅配置壓力均勻化單元的情況相比，能夠進(jìn)一步降低脈動(dòng)。
[0013]此外，在送液單元所輸送的培養(yǎng)液的流量發(fā)生變化的情況下，也可通過壓力均勻化單元和加壓單元抑制脈動(dòng)，因而培養(yǎng)液的流量不會(huì)劇烈變動(dòng)，能夠?qū)ε囵B(yǎng)液的流量進(jìn)行微調(diào)。由此，能夠以適于細(xì)胞培養(yǎng)的流量輸送培養(yǎng)液。如上所述，在具備壓力均勻化單元、進(jìn)一步在細(xì)胞培養(yǎng)部的流出口側(cè)的流路配置加壓單元時(shí)，能夠得到實(shí)用的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
[0014]對于本發(fā)明第2方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，在第I方式的發(fā)明中，所述壓力均勻化單元具有:填充有所述培養(yǎng)液的流體室；在所述流體室中形成的流入口和流出口，該流入口和流出口與所述流路連接；以及撓性膜，其構(gòu)成所述流體室內(nèi)壁的一部分，同時(shí)隨著所述流體室壓力的變動(dòng)而彎曲。
[0015]根據(jù)上述的發(fā)明，通過使撓性膜隨著脈動(dòng)而發(fā)生彎曲，能夠增減流體室的容積、降低流體室的壓力變動(dòng)。此外，在使用氣體腔室抑制壓力變動(dòng)的情況下，氣體腔室的容積會(huì)根據(jù)溫度的變化而發(fā)生變動(dòng)，培養(yǎng)液的流量不穩(wěn)定。利用本發(fā)明的壓力均勻化單元，通過使用撓性膜，即使溫度發(fā)生變化，流體室的容積也不會(huì)增減，能夠使培養(yǎng)液的流量穩(wěn)定。
[0016]對于本發(fā)明第3方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，在第2方式的發(fā)明中，所述流入口和所述流出口在所述流體室的相對的端部形成；所述流體室以從所述端部向著中央部緩慢擴(kuò)寬的方式形成。
[0017]根據(jù)上述的發(fā)明，在向流體室填充培養(yǎng)液時(shí)，能夠抑制氣泡的卷入，避免由氣泡所致的細(xì)胞的死亡。
[0018]對于本發(fā)明第4方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，在第3方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，所述流體室在俯視圖中是圓角的菱形形狀。
[0019]根據(jù)上述的發(fā)明，能夠抑制氣泡進(jìn)入到菱形形狀的角部而發(fā)生殘留。
[0020]對于本發(fā)明第5方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，在第I方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，所述加壓單元具有:與所述流路連接的加壓部，其截面積小于所述流路；以及彈性膜，其構(gòu)成所述加壓部壁面的一部分，受到流入至所述加壓部的所述培養(yǎng)液的壓力的作用而發(fā)生彈性變形。
[0021 ] 根據(jù)上述的發(fā)明，可以僅通過使培養(yǎng)液流入至加壓部來對培養(yǎng)液施加壓力。此時(shí)，若培養(yǎng)液呈特定以上的壓力，則氣泡溶解在培養(yǎng)液中，能夠避免細(xì)胞的死亡。此外，例如，在連接寬度窄的管體進(jìn)行加壓的情況下，細(xì)胞在管體中堵住，流路的壓力可能會(huì)發(fā)生變動(dòng)。與此相對，若加壓部壁面的一部分為彈性膜，則彈性膜發(fā)生彈性變形，可增加流路的寬度，從而能夠抑制細(xì)胞堵塞。
[0022]對于本發(fā)明第6方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，在第I方式的發(fā)明中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)部的流入口側(cè)的所述流路設(shè)有用于除去氣泡的氣泡除去單元。
[0023] 根據(jù)上述的發(fā)明，由于培養(yǎng)液中的氣泡在流入到細(xì)胞培養(yǎng)部之前可利用氣泡除去單元除去，因而能夠避免氣泡流入到細(xì)胞培養(yǎng)部而使細(xì)胞死亡。
[0024]對于本發(fā)明第7方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，在第I方式~第6方式的任意I個(gè)方式的發(fā)明中，所述壓力均勻化單元具備2個(gè)以上。
[0025]根據(jù)上述的發(fā)明，與僅具備I個(gè)壓力均勻化單元的情況相比，能夠抑制培養(yǎng)液壓力的變動(dòng)。并且能夠更細(xì)致地設(shè)定培養(yǎng)液的流量。
[0026]本發(fā)明第8方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)具有權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置以及容納所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置的恒溫器。
[0027]根據(jù)上述的發(fā)明，通過將細(xì)胞培養(yǎng)裝置整體容納在恒溫器中，能夠在適于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。此外，能夠抑制環(huán)境溫度變化所致的氣泡產(chǎn)生。需要說明的是，在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，還可以包括用于對生長在細(xì)胞培養(yǎng)部的細(xì)胞進(jìn)行觀察的顯微鏡等觀察單元。
[0028]本發(fā)明第9方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法為使用權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，該方法具有下述工序:在所述細(xì)胞培養(yǎng)部、所述儲(chǔ)藏部以及所述壓力均勻化單元的至少之一添加細(xì)胞的工序；以及利用所述加壓單元對所述流路中的所述培養(yǎng)液進(jìn)行加壓，同時(shí)利用所述送液單元使所述流路中的所述培養(yǎng)液進(jìn)行循環(huán)的工序。
[0029]根據(jù)上述的發(fā)明，在細(xì)胞添加工序中在細(xì)胞培養(yǎng)部、儲(chǔ)藏部以及壓力均勻化單元的至少之一添加細(xì)胞。所添加的細(xì)胞沒有特別限定，例如為多能性細(xì)胞。通過添加細(xì)胞，由細(xì)胞分泌的分泌物散布在培養(yǎng)液中并流入到細(xì)胞培養(yǎng)部，可促進(jìn)細(xì)胞的培養(yǎng)。此外，通過使培養(yǎng)液在循環(huán)工序中循環(huán)，能夠?qū)⒑蟹置谖锏呐囵B(yǎng)液反復(fù)輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部。
[0030]發(fā)明的效果
[0031]本發(fā)明由于具有上述構(gòu)成，因而可提供能夠抑制培養(yǎng)液的壓力變動(dòng)且能夠抑制氣泡流入到細(xì)胞培養(yǎng)部的細(xì)胞培養(yǎng)裝置、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及細(xì)胞培養(yǎng)方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為示出第I實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的整體構(gòu)成的俯視圖。
[0033]圖2中，圖2(A)示出了第I實(shí)施方式的壓力均勻化機(jī)構(gòu)，為從正面觀察的截面圖，圖2⑶為2B-2B線截面圖。
[0034]圖3示出了培養(yǎng)液脈動(dòng)時(shí)的第I實(shí)施方式的壓力均勻化機(jī)構(gòu)，為從正面觀察的截面圖。
[0035]圖4示出了第I實(shí)施方式的空氣阱(二 7卜9 )，為從正面觀察的放大圖。
[0036]圖5為第I實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)部的分解立體圖。
[0037]圖6為第I實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)部的截面圖。
[0038]圖7示出了第I實(shí)施方式的加壓機(jī)構(gòu)流入培養(yǎng)液前的狀態(tài)，為從正面觀察的要部放大截面圖。
[0039]圖8示出了第I實(shí)施方式的加壓機(jī)構(gòu)流入了培養(yǎng)液的狀態(tài)，為從正面觀察的要部放大截面圖。
[0040]圖9為示出了在未設(shè)有壓力均勻化機(jī)構(gòu)以及加壓機(jī)構(gòu)的比較例的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中經(jīng)過時(shí)間與培養(yǎng)液的流量的關(guān)系的曲線圖。
[0041]圖10為示出了第I實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中經(jīng)過時(shí)間與培養(yǎng)液的流量的關(guān)系的曲線圖。
[0042]圖11為示出了第2實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的整體構(gòu)成的俯視圖。
[0043]圖12為示出了細(xì)胞培養(yǎng)裝置的第I變形例的俯視圖。
[0044]圖13為示出了細(xì)胞培養(yǎng)裝置的第2變形例的俯視圖。

【具體實(shí)施方式】
[0045](第I實(shí)施方式)
[0046]參照附圖對具備本發(fā)明第I實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)100進(jìn)行說明。本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)100為主要培養(yǎng)多能性細(xì)胞的裝置，但并不限于此，也可作為培養(yǎng)其他細(xì)胞的裝置來使用。需要說明的是，此處所說的多能性細(xì)胞是指具有分化為2種以上的細(xì)胞的能力的細(xì)胞。例如，多能性細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、精子干細(xì)胞(GS細(xì)胞)、胚胎生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)、人工多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)、培養(yǎng)纖維原細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞來源的多能性細(xì)胞(Muse細(xì)胞)以及體性干細(xì)胞，但并不限定于此。此外，多能性細(xì)胞也可以來自各種生物。優(yōu)選為來自包括人的哺乳類動(dòng)物的多能性細(xì)胞，更優(yōu)選為來自鼠的多能性細(xì)胞或來自靈長類的多能性細(xì)胞。特別優(yōu)選為來自人的多能性細(xì)胞。
[0047]多能性細(xì)胞中，特別是胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和人工多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)預(yù)計(jì)在近期的將來會(huì)用于再生醫(yī)療中。此處，胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是指由人或鼠等哺乳動(dòng)物的早期胚(例如囊胚泡)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)建立的、具有多能性以及基于自身復(fù)制的增殖能力的干細(xì)胞。此外，人工多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)是指可通過將特定的再編程因子(初期化因子)以DNA或蛋白質(zhì)的形態(tài)導(dǎo)入到體細(xì)胞中而制作出的干細(xì)胞。特別是指與ES細(xì)胞具有大致同等的特性、例如具有分化多能性以及基于自身復(fù)制的增殖能力的體細(xì)胞來源的人工干細(xì)胞。
[0048] 如圖1所示，本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)100具有作為恒溫器的培養(yǎng)箱102以及收納在培養(yǎng)箱102中的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10。培養(yǎng)箱102只要為能夠收納細(xì)胞培養(yǎng)裝置10的尺寸即可，內(nèi)部溫度維持在特定的溫度。需要說明的是，在本實(shí)施方式中，為了在接近人的體溫的溫度下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)箱102內(nèi)維持在37度，但并不限定于此，只要維持在適于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度即可。此外，作為培養(yǎng)箱102，優(yōu)選使用C02培養(yǎng)箱102。
[0049]細(xì)胞培養(yǎng)裝置10主要具備細(xì)胞培養(yǎng)部12、蓄液池(儲(chǔ)藏部)14、循環(huán)泵(送液單元)16、壓力均勻化機(jī)構(gòu)(壓力均勻化單元)18、空氣阱(氣泡除去單元)20、加壓機(jī)構(gòu)(加壓單元)22。并且在各部連接管24A~24F構(gòu)成循環(huán)流路26。需要說明的是，在本實(shí)施方式中，在細(xì)胞培養(yǎng)部12中形成的6個(gè)管道之中，使用2個(gè)管道進(jìn)行培養(yǎng)。因此，循環(huán)泵16、壓力均勻化機(jī)構(gòu)18、空氣阱20以及加壓機(jī)構(gòu)22各設(shè)有2個(gè)，但并不限于此，可以根據(jù)所使用的管道數(shù)設(shè)置更多的循環(huán)流路26。并且，在I個(gè)循環(huán)泵16上可以連接2個(gè)以上的管24。
[0050]下面對構(gòu)成本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10的各部進(jìn)行說明。蓄液池14設(shè)于圖1的下側(cè)，在蓄液池14中儲(chǔ)藏培養(yǎng)液。此外，在本實(shí)施方式中，在I個(gè)蓄液池14上連接2個(gè)循環(huán)泵16，但并不限于此，，也可以對各循環(huán)泵16獨(dú)立地設(shè)置蓄液池14。
[0051]此處，對于儲(chǔ)藏在蓄液池14中的培養(yǎng)液，可根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。例如，作為用于培養(yǎng)ES細(xì)胞的培養(yǎng)液，可以使用添加有0.1mM的2-巰基乙醇、0.1mM的非必須氨基酸、2mM的L-谷氨酸、20%的KSR以及4ng/ml的bFGF的DMEM/F-12培養(yǎng)液。此外，作為用于iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)液，可以使用含有10%~15%的FBS的DMEM、DMEM/F12、或者DME培養(yǎng)液。還包括市售的培養(yǎng)液(鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液、靈長類ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液、無血清培養(yǎng)基等)。
[0052]蓄液池14藉由管24A與作為送液單元的循環(huán)泵16連接。作為循環(huán)泵16，可利用各種送液泵，優(yōu)選低流量的小型泵。在本實(shí)施方式中，作為一例，使用蠕動(dòng)方式的管式泵，但并不限定于此，也可使用其他泵。此外，在本實(shí)施方式中，以平均流量為0.75μ Ι/min以下的流量進(jìn)行培養(yǎng)液的輸送。
[0053]循環(huán)泵16通過管24A從蓄液池14將培養(yǎng)液吸上來輸送到管24B。由此，與管24B連接的壓力均勻化機(jī)構(gòu)18內(nèi)的培養(yǎng)液被擠出，通過管24C輸送到空氣阱20中。與此同樣地，培養(yǎng)液通過管24D被輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部12，進(jìn)一步通過管24E被輸送到蓄液池14。由此，培養(yǎng)液以層流的形式在細(xì)胞培養(yǎng)裝置10中循環(huán)。需要說明的是，此處所說的層流是指流體的流線與壁面平行，是指并非為紊流的流場。優(yōu)選層流是越靠近壁流速越小、通過與壁面離開一定距離以上而呈均勻流速的流場。
[0054]循環(huán)泵16藉由管24B與作為壓力均勻化單元的壓力均勻化機(jī)構(gòu)18連接。如圖2(A)所示，壓力均勻化機(jī)構(gòu)18主要具備上部區(qū)塊40、下部區(qū)塊42以及撓性膜44，通過將撓性膜44夾在上部區(qū)塊40與下部區(qū)塊42之間來形成。上部區(qū)塊40和下部區(qū)塊42為樹脂制的區(qū)塊，在上部區(qū)塊40形成了上部區(qū)塊40的下面凹下去的流體室46。
[0055]流體室46為填充有培養(yǎng)液的空間，在流體室46長度方向的一個(gè)端部形成貫通到上部區(qū)塊40的上面的流入口 40A，在該流入口 40A與管24B連接。此外，在流體室46長度方向的另一端部形成貫通上部區(qū)塊40的上面的流出口 40B，與管24C連接。
[0056]此處，如圖2(B)所示，流體室46在俯視圖中形成為圓角的菱形形狀。由此，將培養(yǎng)液從流入口 40A流到流出口 40B進(jìn)行填充時(shí)，可抑制空氣(氣泡)殘留在流體室46中。此外，在本實(shí)施方式中，通過在菱形形狀的呈銳角的位置形成流入口 40A和流出口 40B，使流體室46的寬度從流入口 40A向著流體室46的中央部緩慢地?cái)U(kuò)寬，從而在填充培養(yǎng)液時(shí)不易卷入氣泡。銳角的角度Θ優(yōu)選為90度~5度、更優(yōu)選為60度~8度、特別優(yōu)選為30度~10度。需要說明的是，流體室46的角落不一定必須為圓形的，并且也可以不是菱形形狀。
[0057]如圖2(A)所示，在上部區(qū)塊40的下面粘接撓性膜44，構(gòu)成流體室46內(nèi)壁的一部分。作為撓性膜44的材質(zhì)，只要為以能夠充分改變流體室46的容積的程度進(jìn)行彎曲的材料就沒有特別限定，例如可以為撓性樹脂或橡膠等彈性體，也可以為具有撓性的金屬。另外，其是以與培養(yǎng)液不發(fā)生反應(yīng)的材質(zhì)形成的，這自不消說。
[0058]此處，在流體室46的壓力由于循環(huán)泵16的脈動(dòng)等而增高的情況下，如圖3所示，撓性膜44向下方彎曲、流體室46的容積增大。由此使流體室46的壓力降低，可抑制循環(huán)流路26的壓力變動(dòng)。反之，在流體室46的壓力降低的情況下，撓性膜44向上方彎曲、流體室46的容積減小。由此使流體室46的壓力升高，能夠抑制循環(huán)流路26的壓力變動(dòng)。如上所述，通過使撓性膜44隨著流體室46的壓力變動(dòng)而發(fā)生彎曲，能夠使壓力均勻。
[0059] 需要說明的是，在本實(shí)施方式中，在上部區(qū)塊40的上面形成流入口 40A和流出口40B,培養(yǎng)液從相對于流體室46垂直的方向流入，但并不限于此，也可以在上部區(qū)塊40的兩側(cè)面形成流入口 40A和流出口 40B，使培養(yǎng)液從水平方向流入到流體室46中。
[0060]如圖1所示，壓力均勻化機(jī)構(gòu)18藉由管24C與作為氣泡除去單元的空氣阱20連接。如圖4所示，空氣阱20具備阱主體48，在阱主體48的上面連接有管24C和管24D。并且在阱主體48的內(nèi)部形成管24C與管24D連接而成的流路48A。
[0061]此處，在流路48A的中央部，流路48A的寬度擴(kuò)寬，形成阱部48B。阱部48B的尺寸根據(jù)培養(yǎng)液的流量或氣泡的發(fā)生程度形成適當(dāng)?shù)某叽?。由此，在流?jīng)流路48A的培養(yǎng)液中產(chǎn)生氣泡O的情況下，在通過阱部48B期間向上方浮起，被壁面擋住，氣泡O被捕獲。被捕獲的氣泡O可通過將阱主體48中形成的排氣口用的配管(未圖示)打開而進(jìn)行排氣，也可利用基于加壓機(jī)構(gòu)22的加壓進(jìn)行除去。
[0062]如圖1所示，空氣阱20藉由管24D與細(xì)胞培養(yǎng)部12連接。細(xì)胞培養(yǎng)部12為進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的俯視圖大致為矩形狀的部件，如圖5所示，其具備樹脂板30、聚甲基硅氧烷(PDMS)層32以及玻璃板34，將它們從上方起順序疊置來形成。此外，在于玻璃板34的下方配置下壓板38的狀態(tài)下，從樹脂板30的上方放置上壓板36，利用上壓板36與下壓板38夾入樹脂板30、PDMS層32以及玻璃板34。在該狀態(tài)下，將螺栓41在上壓板36形成的螺栓孔36A與下壓板38形成的螺栓孔38A中插通并相互締緊，形成細(xì)胞培養(yǎng)部12。
[0063]此處，在PDMS層32獨(dú)立地形成有6條作為管道的狹縫狀的槽32A。在本實(shí)施方式中，作為一例，槽32A是以寬0.5mm、長20mm、深0.5mm的方式形成的,但并不限于此,也可以以其他尺寸形成。此外，在各槽32A形成有流入口 32B和流出口 32C。需要說明的是，在本實(shí)施方式中，是在PDMS層32形成了槽32A，但也可使用其他材質(zhì)的部件。例如可使用塑料、硅樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚苯乙烯、或者玻璃。
[0064]如圖6所示，流入口 32B與管24D連接，將培養(yǎng)液從管24D輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部12時(shí)，培養(yǎng)液到達(dá)在細(xì)胞培養(yǎng)部12的下部形成的培養(yǎng)室12B的一個(gè)端部。此處，在培養(yǎng)室12B有細(xì)胞生存，利用以層流形式流動(dòng)的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。通過培養(yǎng)室12B的培養(yǎng)液從培養(yǎng)室12B的另一端部向上方移動(dòng)，由與流出口 32C連接的管24E流出。
[0065]如圖1所示，細(xì)胞培養(yǎng)部12藉由管24E與作為加壓單元的加壓機(jī)構(gòu)22連接。加壓機(jī)構(gòu)22為對于流經(jīng)循環(huán)流路26的培養(yǎng)液施加預(yù)定壓力的機(jī)構(gòu)，如圖7所示，加壓機(jī)構(gòu)22主要具備:上部區(qū)塊50、隔膜底54、作為彈性膜的隔膜56、以及下部區(qū)塊52。
[0066]上部區(qū)塊50和下部區(qū)塊52為樹脂制的區(qū)塊，在上部區(qū)塊50設(shè)有2個(gè)貫通孔50A、50B，管24E、24F插通到各貫通孔50A、50B中。此外，在管24E、24F的內(nèi)側(cè)插入有內(nèi)筒58、60，將管24E、24F由內(nèi)筒58、60與貫通孔50A、50B的孔壁夾住。
[0067]下部區(qū)塊52與上部區(qū)塊50隔開間隔設(shè)置在上部區(qū)塊50的下方，在下部區(qū)塊52的中央部形成貫通孔52A。由此，后述的隔膜56向下方彈性變形時(shí)，不會(huì)與下部區(qū)塊52接觸。需要說明的是，也可以使下部區(qū)塊52的上面凹陷形成凹部。
[0068]在上部區(qū)塊50與下部區(qū)塊52之間設(shè)置隔膜底54。隔膜底54為板狀的樹脂部件，在與上部區(qū)塊50的貫通孔50A、50B對應(yīng)的位置形成貫通隔膜底54的流路54A。此外，隔膜底54中央部的高度低于周端部。
[0069]在隔膜底54的下面安裝有隔膜56。隔膜56為可彈性變形的膜狀部件，在本實(shí)施方式中，其是以與隔膜底54相同的尺寸形成的，但并不限于此，只要為覆蓋流路54A的尺寸，也可以為與隔膜底54不同的尺寸。進(jìn)一步地，隔膜56與隔膜底54的周端部粘接，在隔膜56與隔膜底54的中央部之間形成寬度窄于循環(huán)流路26的窄幅部54B。
[0070]此處，將培養(yǎng)液從管24E輸送到加壓機(jī)構(gòu)22時(shí)，培養(yǎng)液從隔膜底54的流路54A流到窄幅部54B。此時(shí)，培養(yǎng)液在窄幅部54B受到加壓，如圖8所示，隔膜56向下方彈性變形，窄幅部54B擴(kuò)張。在發(fā)生了彈性變形的隔膜56產(chǎn)生復(fù)原力的作用，在流路54A收縮的方向上賦予力，培養(yǎng)液被施以特定的壓力。需要說明的是，在本實(shí)施方式中，作為一例，按照可在1kPa下進(jìn)行加壓的方式對隔膜56的厚度等進(jìn)行了調(diào)整，但并不限定于此，也可以在1kPa以上的壓力下進(jìn)行加壓。
[0071]如圖1所示，加壓機(jī)構(gòu)22藉由管24F與蓄液池14連接。并且，輸送到蓄液池14的培養(yǎng)液經(jīng)蓄液池14儲(chǔ)藏后上吸到循環(huán)泵16中，在直至循環(huán)泵16停止為止的期間進(jìn)行循環(huán)流路26的循環(huán)。
[0072]需要說明的是，在本實(shí)施方式中，僅在細(xì)胞培養(yǎng)部12有細(xì)胞生存，但并不限定于此，也可以在蓄液池14或加壓機(jī)構(gòu)22中添加細(xì)胞。這種情況下，在經(jīng)循環(huán)泵16循環(huán)的培養(yǎng)液中混有由細(xì)胞分泌的分泌物，可促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)部12的細(xì)胞培養(yǎng)。
[0073]接下來對本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10的作用進(jìn)行說明。本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10具備壓力均勻化機(jī)構(gòu)18，因而能夠抑制培養(yǎng)液的壓力由于循環(huán)泵16的脈動(dòng)而發(fā)生變動(dòng)。由此，不會(huì)產(chǎn)生流經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)部12的培養(yǎng)液的壓力發(fā)生變動(dòng)而對細(xì)胞造成損害的情況。
[0074]此外，由于在細(xì)胞培養(yǎng)部12的流出口 32C側(cè)的循環(huán)流路26設(shè)有加壓機(jī)構(gòu)22，因而輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部12的培養(yǎng)液得到加壓，能夠抑制在培養(yǎng)液中產(chǎn)生氣泡。進(jìn)一步地，通過賦予特定壓力以上的壓力，能夠?qū)⒕砣氲窖h(huán)流路26中的氣泡溶解在培養(yǎng)液中。如此，通過抑制氣泡流入到細(xì)胞培養(yǎng)部12，能夠避免氣泡所致的細(xì)胞死亡。
[0075]此外，由于加壓機(jī)構(gòu)22是使用可彈性變形的隔膜56形成的，因而即使在流路54A狹窄的情況下，培養(yǎng)液中的細(xì)胞也不會(huì)堵塞，培養(yǎng)液能夠穩(wěn)定循環(huán)。
[0076]進(jìn)一步地，在本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10中，通過設(shè)置壓力均勻化機(jī)構(gòu)18與加壓機(jī)構(gòu)22，能夠得到協(xié)同效應(yīng)。即，即使是在僅利用壓力均勻化機(jī)構(gòu)18無法充分抑制壓力變動(dòng)的情況下，通過加壓機(jī)構(gòu)22對培養(yǎng)液加壓也能抑制壓力的變動(dòng)，并且能夠抑制培養(yǎng)液中產(chǎn)生氣泡。
[0077]此外，由于本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10中所需要的培養(yǎng)液的流量為0.75 μ I/min以下的低流量，因而能夠使裝置整體的尺寸小型化。由此，例如能夠?qū)⒀b置整體由培養(yǎng)箱102中取出運(yùn)至顯微鏡處，對細(xì)胞培養(yǎng)部12的培養(yǎng)室12B進(jìn)行觀察。
[0078]此外，在以低流量輸送培養(yǎng)液的情況下，若僅變更循環(huán)泵16的流量設(shè)定，則脈動(dòng)的影響大，因而無法進(jìn)行細(xì)微的流量調(diào)整。與此相對，通過設(shè)置加壓機(jī)構(gòu)22，能夠抑制流量的變動(dòng)，能夠進(jìn)行流量的微調(diào)整。若能夠進(jìn)行流量的微調(diào)整，則能夠得到培養(yǎng)條件的再現(xiàn)性。
[0079](試驗(yàn)例)
[0080] 此處，為了確認(rèn)本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10的效果，進(jìn)行下述試驗(yàn)。
[0081]試驗(yàn)1:使用本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10，利用微小流量計(jì)對輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部12的培養(yǎng)液的流量進(jìn)行計(jì)測，示于圖10。另外使用從細(xì)胞培養(yǎng)裝置10中卸下壓力均勻化機(jī)構(gòu)18和加壓機(jī)構(gòu)22的比較例的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，利用微量流量計(jì)對輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部12的培養(yǎng)液的流量進(jìn)行計(jì)測，示于圖9。
[0082]試驗(yàn)2:使用本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10，將輸送到細(xì)胞培養(yǎng)部12的培養(yǎng)液的流量設(shè)定為0.3μ l/min、0.5μ l/min、0.75 μ 1/min，在各情況下，在培養(yǎng)開始后第I天與第3天利用顯微鏡對在培養(yǎng)室12B中生存的iPS細(xì)胞的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，記載于表1中。另外使用上述比較例的細(xì)胞培養(yǎng)裝置實(shí)施同樣的試驗(yàn)。需要說明的是，比較例的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的培養(yǎng)液的平均流量為0.5 μ 1/min。另外,任一培養(yǎng)均在C02培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行,關(guān)于培養(yǎng)液，使用1.0X 15細(xì)胞/ml的培養(yǎng)液。
[0083]對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察，如圖9所示，在比較例的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，循環(huán)泵16的脈動(dòng)直接在流量中反映，流量在-0.2 μ Ι/min~1.3 μ 1/min的范圍內(nèi)周期性地變動(dòng)。如此，在流量的變動(dòng)大的情況下，會(huì)對細(xì)胞造成損害。如表1所示，在未設(shè)有壓力均勻化機(jī)構(gòu)18和加壓機(jī)構(gòu)22的比較例的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，第3天細(xì)胞全部死亡。
[0084]與此相對，在連接有壓力均勻化機(jī)構(gòu)18和加壓機(jī)構(gòu)22的本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10中，如圖10所示，可確認(rèn)到脈動(dòng)得到抑制，培養(yǎng)液的流量平穩(wěn)保持在0.5 μ 1/min,可知能夠在穩(wěn)定的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
[0085]如表1所示，在本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10中，至少到第3天為止未發(fā)生全部細(xì)胞死亡的情況。此外，在本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10中，在所設(shè)定的任一流量下，流量(實(shí)測值)的變動(dòng)幅度均較小，為設(shè)定值的20%以下。即，可以說本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10在流量控制方面具有高分辨能力，在改變設(shè)定流量時(shí)，能夠?qū)υO(shè)定值進(jìn)行細(xì)微控制。例如，在要發(fā)現(xiàn)適于細(xì)胞培養(yǎng)的流量的情況下，若利用本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10，則能夠微細(xì)設(shè)定流量，能夠提高最佳值的確定精度。若以表1所示的示例而言，則在0.3 μ I/min、0.5 μ 1/min和0.75 μ 1/min設(shè)定流量下，由于實(shí)測值相互無重復(fù)，因而能夠精度良好地對各設(shè)定量下的效果進(jìn)行比較研究。需要說明的是，在本示例中，可知在培養(yǎng)液的流量為0.5 μ m/min的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)較高的細(xì)胞生存率。此處，個(gè)數(shù)比超過100%是由細(xì)胞分裂所致的。此外，例如在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的情況下，能夠?qū)τ谟糜诩?xì)胞培養(yǎng)的設(shè)定流量進(jìn)行更細(xì)微的調(diào)整，能夠在最佳層流條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0086]根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)⒘髁?實(shí)測值)的變動(dòng)幅度抑制在設(shè)定值的O~50%的范圍，例如，利用本實(shí)施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置10，能夠?qū)⒘髁?實(shí)測值)的變動(dòng)幅度抑制在設(shè)定值的3%~30%O
[0087]【表1】
[0088]

【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其具有: 培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)部； 儲(chǔ)藏培養(yǎng)液的儲(chǔ)藏部； 連接所述細(xì)胞培養(yǎng)部與所述儲(chǔ)藏部的流路； 送液單元，其設(shè)于所述流路，將所述培養(yǎng)液從所述儲(chǔ)藏部輸送到所述細(xì)胞培養(yǎng)部； 壓力均勻化單元，其設(shè)于所述流路，對施加給輸送到所述細(xì)胞培養(yǎng)部的所述培養(yǎng)液的壓力的變動(dòng)進(jìn)行抑制；以及 加壓單元，其設(shè)于所述細(xì)胞培養(yǎng)部的流出口側(cè)的所述流路，向所述培養(yǎng)液施加特定壓力。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中，所述壓力均勻化單元具有: 填充有所述培養(yǎng)液的流體室； 在所述流體室中形成的流入口和流出口，該流入口和流出口與所述流路連接；以及 撓性膜，其構(gòu)成所述流體室內(nèi)壁的一部分，同時(shí)隨著所述流體室壓力的變動(dòng)而彎曲。
3.如權(quán)利要求2 所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中， 所述流入口和所述流出口在所述流體室的相對的端部形成； 所述流體室以從所述端部向著中央部緩慢擴(kuò)寬的方式形成。
4.如權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中，所述流體室在俯視圖中是圓角的菱形形狀。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中，所述加壓單元具有: 與所述流路連接的加壓部，其截面積小于所述流路；以及 彈性膜，其構(gòu)成所述加壓部壁面的一部分，受到流入至所述加壓部的所述培養(yǎng)液的壓力的作用而發(fā)生彈性變形。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)部的流入口側(cè)的所述流路設(shè)有用于除去氣泡的氣泡除去單元。
7.如權(quán)利要求1~6的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中，所述壓力均勻化單元具備2個(gè)以上。
8.一種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其具有: 權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置、以及 容納所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置的恒溫器。
9.一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其為使用權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，該方法具有下述工序: 在所述細(xì)胞培養(yǎng)部、所述儲(chǔ)藏部以及所述壓力均勻化單元的至少之一添加細(xì)胞的工序；以及 利用所述加壓單元對所述流路中的所述培養(yǎng)液進(jìn)行加壓，同時(shí)利用所述送液單元使所述流路中的所述培養(yǎng)液進(jìn)行循環(huán)的工序。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK104073436SQ201410111119
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月28日
【發(fā)明者】中西直之, 野田雄一郎 申請人:愛科來株式會(huì)社