水稻劍葉寬度調(diào)控基因nal1分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻劍葉寬度調(diào)控基因NAL1的CAPS分子標(biāo)記NAL1-Nar?I，以水稻作為物種，分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5′→3′，NAL1-Nar?I：正向（F）：CCCTCTATTCATTTGCATTCATC；反向（R）：GGCTGTCCACAATGACAATAAA。本發(fā)明還同時(shí)空開了上述分子標(biāo)記NAL1-Nar?I的用途：用于水稻寬劍葉株系/或其后代輔助選擇育種。具體為：當(dāng)篩選日本晴和秈稻93-11的后代時(shí)，選擇后代中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種。
【專利說明】水稻劍葉寬度調(diào)控基因NAL1分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，特別涉及與水稻劍葉形態(tài)調(diào)控基因NALl有關(guān)的分子標(biāo)記及其獲得方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻葉片形態(tài)一直以來備受育種家關(guān)注，在水稻株型育種上具有重要的地位。改善水稻葉形能夠增大葉面積指數(shù)和提升葉片光合效率，為穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)提供可靠的保障。葉片是水稻植株的重要組成部分，是進(jìn)行光合作用的主要場所；微卷直立的葉片形態(tài)是理想植株的重要形態(tài)特征之一，已被直接或間接的應(yīng)用于水稻理想株型育種。葉片適度的內(nèi)卷能使葉片挺直以減少披垂現(xiàn)象的發(fā)生，在生長發(fā)育后期作用明顯，有利于改善水稻基部的受光條件，進(jìn)而提高植株光能的利用率，實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)的目的。大量證據(jù)表明，葉片形態(tài)是受到體內(nèi)遺傳機(jī)制和體外環(huán)境因子的雙重調(diào)節(jié)。了解水稻葉形態(tài)建成的遺傳規(guī)律，對于遺傳上控制植株形態(tài)，發(fā)展葉片發(fā)育的重要理論，改良葉平展度或卷曲度等遺傳性狀，提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
[0003]近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和突變體研究技術(shù)的廣泛應(yīng)用，科學(xué)家借助于擬南芥、金魚草和玉米等模式植物在葉發(fā)育方面的研究，取得了一系列重要進(jìn)展。關(guān)于水稻葉形調(diào)控的研究相對較晚，但也已取得一些進(jìn)展，Zhang等(2009)利用EMS誘變處理日本晴得到一個(gè)單隱性卷葉突變體slll，并通過圖位克隆技術(shù)獲得葉形調(diào)控基因SLL1，該基因編碼一個(gè)SHAQKYF類的MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控遠(yuǎn)軸面維管組織分化中的程序化死亡來控制葉形的卷曲程度。Hibara等(2009)分離到反卷葉調(diào)控基因ADL1，該基因通過編碼類似鈣蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶調(diào)控近軸面泡狀細(xì)胞的發(fā)育從而控制葉形的發(fā)育；Hu等
(2010)以化學(xué)誘變獲得的水稻窄葉突變體，通過圖位克隆技術(shù)將葉片寬度控制基因NRLl定位于第12染色體 ，并成功分離該基因；Zhao等(2010)利用反卷葉突變體也成功克隆了控制水稻葉片反卷的調(diào)控基因LC2。Zou等(2011)利用T-DNA插入方法篩選到一個(gè)反卷葉水稻突變體oulI，并成功克隆相關(guān)的調(diào)控基因Roc5，該基因通過編碼一個(gè)與亮氨酸鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)VI家族同源的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控上表面泡狀細(xì)胞的數(shù)量與大小，從而達(dá)到控制葉片的形態(tài)建成。Shi等(2007)和Li等(2010)同樣利用T-DNA插入誘變中花11，分別在第3、第4染色體上克隆到控制葉片卷曲極性不同的基因0sAG07和ACLl ;另外還有2個(gè)由Huang等
(2011)和Yamaguchi等(2004)克隆的披葉調(diào)控基因DL2和DL。水稻葉寬調(diào)控基因NALl最早由Qi等(2008)水稻窄葉突變體中克隆，認(rèn)為該基因通過調(diào)控生長素極性運(yùn)輸來影響葉片形態(tài)發(fā)育。隨后多位科學(xué)家利用不同的遺傳材料對該等進(jìn)行研究。Chen ML(2012),Takai T(2013)和Fujita D (2013)等利用美國javanica品種D50和秈稻品種HB277，粳稻Koshihikari和秈稻品種Takanari,新株型熱帶粳稻品種和秈稻IR64分別構(gòu)建重組自交系和染色體片段置換系克隆了與NALl基因等位的葉寬相關(guān)qFLW4、光合效率相關(guān)GPS基因和枝梗數(shù)相關(guān)SPIKE基因。秈粳亞種間該等位基因的編碼序列中差異比較保守，主要存在3個(gè)單堿基的替換差異，因此而造成了對株型和穗型等多個(gè)性狀發(fā)育調(diào)控的影響差異。這些葉片形態(tài)調(diào)控基因的克隆及功能研究，將有助于水稻育種家在育種過程中通過生物設(shè)計(jì)對葉型和株型進(jìn)行改良，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)化高效的育種目的。但總體而言，在水稻中分離到控制葉形發(fā)育相關(guān)基因的數(shù)量還相對偏少，加之功能研究進(jìn)展的緩慢，目前尚不能建立起有效的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系，難以更好的從分子水平上揭示葉片發(fā)育的分子機(jī)理。目前，從分子水平對單子葉模式作物及主要糧食作物的水稻的葉形態(tài)建成機(jī)制研究還正處于起步階段，對葉形發(fā)育的調(diào)控機(jī)理研究尚顯不足，在一定程度上阻礙了通過分子調(diào)控來建立理想株型的實(shí)施、超級稻高產(chǎn)育種的機(jī)理的探索和應(yīng)用。這將是擺在我們面前的一項(xiàng)艱巨的任務(wù)和長久的挑戰(zhàn)。
[0004]葉片形態(tài)對大多數(shù)作物來說是一種非常重要的農(nóng)藝性狀，大部分葉片形態(tài)發(fā)生改變之后都會直接或間接影響到植物體的光合作用、蒸騰作用、極性運(yùn)輸和抗逆性等生理功能。研究表明，水稻葉片與其籽粒同化物的形成有密切的聯(lián)系，因此，對水稻產(chǎn)量的形成亦有重要的影響(Yoshida S，1981)。鑒于此作用，水稻中葉片形態(tài)改良一直都是株型育種中至關(guān)重要的一個(gè)目標(biāo)，遺傳學(xué)家與育種家花費(fèi)巨大的精力用來研究葉片形態(tài)的遺傳特性，以期提高水稻的產(chǎn)量，研究中遇到的困難不少，但隨著研究的深入和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及技術(shù)手段的豐富，取得的成績斐然，最值得令人稱贊的是卷葉性狀在水稻品種改良中的成功運(yùn)用。
[0005]上文中涉及的參考文獻(xiàn)如下:
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0025]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與水稻劍葉寬度調(diào)控基因NALl有關(guān)的分子標(biāo)記及其開發(fā)方法和用途，本發(fā)明所得的分子標(biāo)記NALl-Nar I為水稻劍葉寬度調(diào)控基因NALl的基因標(biāo)記，能用于水稻劍葉形態(tài)的輔助選擇育種。
[0026]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種與水稻劍葉寬度調(diào)控基因NALl的基因標(biāo)記，以水稻作為物種，該分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5' —3':
[0027]NALl-Nar I 正向(F):CCCTCTATTCATTTGCATTCATC ；
[0028]反向(R):GGCTGTCCACAATGACAATAAA ；
[0029]本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記的開發(fā)方法，包括以下步驟:
[0030]I)、以粳稻品種日本晴作為寬葉基因供體親本與秈稻高產(chǎn)品種93-11進(jìn)行雜交、回交和自交，從而獲得作為后代的寬劍葉水稻單株(即，從而獲得作為雜交后代的水稻劍葉寬度較93-11增加的寬葉單株)；`
[0031]2)、用 CTAB (十六烷基三乙基溴化銨，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA ；
[0032]3)、采用CAPS (揭示的是特異PGR片段的限制性長度變異的信息)分子標(biāo)記方法進(jìn)行水稻劍葉寬度基因標(biāo)記的篩選；
[0033]4)、開發(fā)出 Iv CAPS 分子標(biāo)記 NALl-Nar I。
[0034]本發(fā)明還同時(shí)提供了上述分子標(biāo)記NALl-Nar I的用途:用于水稻寬劍葉株系/或其后代輔助選擇育種。
[0035]作為本發(fā)明的分子標(biāo)記NALl-Nar I的用途的改進(jìn):當(dāng)篩選日本晴和秈稻93_11的后代時(shí)，選擇后代中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種。
[0036]與水稻劍葉寬度有關(guān)的分子標(biāo)記NALl-Nar I，具體是用下述方法得到的:
[0037]I)、根據(jù)基因NALl的核苷酸序列，設(shè)計(jì)、開發(fā)CAPS分子標(biāo)記，用于檢測日本晴和93-11間劍葉寬度調(diào)控基因的多態(tài)性；通過測序以進(jìn)一步確定引物(分子標(biāo)記)NALl-Nar I區(qū)間的序列在寬葉基因供體日本晴和93-11等位基因之間的差異；通過雜交、回交和自交結(jié)合標(biāo)記輔助選擇，獲得93-11背景的寬葉水稻新種質(zhì)；
[0038]即，通過測序檢測出兩親本的基因序列內(nèi)部在分子標(biāo)記限定的片段上存在差異；
[0039]2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及后代幼苗基因組DNA ；
[0040]3)、采用CAPS分子標(biāo)記方法進(jìn)行水稻劍葉寬度調(diào)控基因標(biāo)記篩選寬葉的水稻新種質(zhì)；
[0041]4)、鑒定出一個(gè)CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I，經(jīng)多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)其與水稻劍葉寬度相關(guān)聯(lián)。利用該標(biāo)記可以用來鑒定水稻葉片寬度。
[0042]采用CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I進(jìn)行水稻劍葉寬度篩選的方法具體是:
[0043](I)、CAPS標(biāo)記在不同劍葉寬度品種日本晴和93-11間的DNA多態(tài)性分析:
[0044]根據(jù)基因NALl的核苷酸序列，設(shè)計(jì)、開發(fā)CAPS分子標(biāo)記NALl-NarI，用于檢測日本晴和93-11之間劍葉寬度的多態(tài)性。備注說明:引物(分子標(biāo)記)可委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0045]PCR 反應(yīng)體系為:20ng/ul 水稻基因組 DNAlul, 10XPCR Buffer2.0ul, 25mMMgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 正反向引物各 1.0ul, 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.2ul，ddH2010.8ul，總體系 20ul。
[0046]反應(yīng)程序:95°C變性5分鐘；94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，40個(gè)循環(huán)；72°C補(bǔ)齊10分鐘；產(chǎn)物檢測:在含有0.5% ug/ul EB的2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。
[0047](2) ,CAPS標(biāo)記NALl-Nar I的序列區(qū)間在不同葉寬的日本晴和93_11間的基因組序列差異:
[0048]根據(jù)獲得的CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I，用于PCR擴(kuò)增不同葉寬的日本晴和93_11間的基因組序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。PCR擴(kuò)增參照上述(I)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物的回收選用北京百泰克生物技術(shù)有限公司開發(fā)的PCR產(chǎn)物回收試劑盒(離心柱型，目錄號:DP1403)。
[0049](3)、利用CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I開展寬葉水稻的輔助選擇育種:
[0050]寬葉基因供體親本日本晴，與93-11進(jìn)行雜交，通過回交、自交結(jié)合標(biāo)記輔助選擇，將日本晴的寬葉基因NALl導(dǎo)入到93-11中，選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種改良，獲得了若干份93-11背景的帶日本晴NALl基因的材料在齊穗期檢測劍葉寬度，發(fā)現(xiàn)其劍葉寬度比93-11顯著增加。
[0051]水稻葉寬是水稻劍葉形態(tài)的重要指標(biāo)，是理想株型的重要組成部分。本發(fā)明采用分子生物學(xué)方法以帶有寬葉基因的日本晴為材料，發(fā)展和篩選新的、而且穩(wěn)定的能增加水稻劍葉寬度的分子標(biāo)記及其方法，用于理想株型的輔助選擇育種；由于研究所用的材料寬葉基因能增加秈稻背景的劍葉寬度，其對我國水稻葉形改良和理想株型的分子設(shè)計(jì)育種具
有普遍性。
[0052]本發(fā)明創(chuàng)造了水稻劍葉寬度調(diào)控基因NALl的CAPS標(biāo)記NALl-Nar I。利用這種方法，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時(shí)間周期長等缺點(diǎn)，可以有目標(biāo)地將日本晴的寬葉基因NALl在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)選擇獲得并有目的地進(jìn)行多個(gè)理想株型基因的聚合，從而培育出具有理想株型的水稻新品種。在本發(fā)明中，當(dāng)所得植株經(jīng)檢測出現(xiàn)日本晴的條帶時(shí)，我們判定其屬于寬葉水稻；當(dāng)所得植株經(jīng)檢測出現(xiàn)93-11的條帶或同時(shí)出現(xiàn)特青+日本晴的條帶時(shí)，我們判定其屬于窄葉的水稻。
[0053]本發(fā)明可適用大部分的秈稻(如93-11)和粳稻(如日本晴)之間的標(biāo)記選擇。
[0054]因此，本發(fā)明結(jié)果在水稻理想株型育種實(shí)踐中具有重要意義。其優(yōu)點(diǎn)具體歸納如下:[0055](I)本發(fā)明的能調(diào)控水稻劍葉寬度調(diào)控基因NALl分子標(biāo)記，是在通過含寬葉基因的粳稻日本晴與秈稻93-11的雜交、回交中篩選獲得的，能顯著增加劍葉寬度，而且穩(wěn)定存在，可用于寬葉水稻理想株型的輔助選擇育種。
[0056](2)本發(fā)明依據(jù)的是水稻劍葉寬度調(diào)控基因NALl的核苷酸序列發(fā)展而獲得的CAPS分子標(biāo)記，極大提高了輔助選擇的效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0058]圖1是CAPS標(biāo)記NALl-Nar I在粳稻日本晴、秈稻93_11、Fl的電泳譜帶圖；
[0059]其中，圖1-1是未經(jīng)Nar I酶切前CAPS標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增片段；圖1_2是CAPS標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增片段用Nar I酶切后的片段多態(tài)性。
[0060]圖2是引物NALl-NarI的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在日本晴和特青間的Nar I酶切序列差
巳
升；
[0061]圖2-1是CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I日本晴擴(kuò)增片段序列及Nar I酶切差異位
占.[0062]圖2-2是CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar 193-11擴(kuò)增片段序列及Nar I酶切差異位點(diǎn)；
[0063]圖2-3是93-11的CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增片段Nar I酶切后片段大小。
[0064]圖3是CAPS標(biāo)記NALl-Nar I鑒定獲得的13份日本晴和93_11雜交后用93_11連續(xù)回交后不同株系的電泳譜帶圖(不同葉片寬度的后代選擇單株及其CAPS標(biāo)記NALl-NarI多態(tài)性)；`
[0065]其中，圖3-1是不同株系的未經(jīng)Nar I酶切前CAPS標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增片段；圖3-2是不同株系的CAPS標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增片段用Nar I酶切后的片段多態(tài)性；
[0066]注:NPB-日本晴；WL-寬葉單株；NL_窄葉純合單株；NF_窄葉雜合單株。
[0067]圖4是CAPS標(biāo)記NALl-NarI輔助選育的13份材料在齊穗期的葉寬數(shù)據(jù)()不同Nar I酶切帶型的后代單株劍葉寬度；
[0068]注:WL-寬葉單株；NL-窄葉純合單株；NF-窄葉雜合單株。
[0069]對上述圖1~4中符號分別作如下說明:
[0070]NPB代表:寬葉基因供體親本的粳稻日本晴；
[0071]93-11代表:寬葉基因供體親本秈稻93-11 ；
[0072]Fl代表:日本晴/93-11的Fl植株；
[0073]WL代表:日本晴和93-11雜交Fl代，連續(xù)用93_11回交后代，經(jīng)CAPS標(biāo)記NALl-NarI篩選后獲得寬葉基因純合植株；
[0074]NL代表:日本晴和93-11雜交Fl代，連續(xù)用93_11回交后代，經(jīng)CAPS標(biāo)記NALl-NarI篩選后獲得窄葉基因純合植株；
[0075]NF代表:日本晴和93-11雜交Fl代，連續(xù)用93_11回交后代，經(jīng)CAPS標(biāo)記NALl-NarI篩選后獲得窄葉雜合植株。
【具體實(shí)施方式】
[0076]實(shí)施例1、用CAPS標(biāo)記NALl-Nar I鑒定粳稻日本晴和秈稻93_11的多態(tài)性[0077]具體做法是:從中國水稻研究所種質(zhì)資源庫中選取水稻材料日本晴和93-11，用日本晴和93-11雜交獲得其Fl，利用引物CAPS標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增并用Nar I酶切鑒定其多態(tài)性(圖1)。
[0078]一、提取 DNA
[0079]I)、配制DNA提取緩沖液:
[0080]按順序依次加I 體積的 DNA 提取溶液(0.35M sorbitol; 0.1M Tris, pH8.2; 0.005MEDTA ;其余為水)，I 體積的核裂解液(0.2M Tris, pH7.5;0.05M EDTA;2M NaCl;0.055MCTAB ;其余為水)和0.4體積的5% (質(zhì)量濃度)sarkosyl溶液(即十二酰-N-甲基甘氨酸鈉的水溶液);最后加入亞硫酸氫鈉，配制成DNA提取緩沖液；亞硫酸氫鈉在DNA提取緩沖液中的終濃度為0.02M。
[0081]上述DNA提取溶液的制備方法為:在0.35mol的sorbitol (山梨糖醇)、0.Imol的Tris (三羥甲基氨基甲烷，pH8.2),0.005mol的EDTA (乙二胺四乙酸)加水定容至1L。
[0082]上述核裂解液的制備方法為:在0.2mol的Tris (三羥甲基氨基甲烷，pH7.5)、0.05mol的EDTA (乙二胺四乙酸)、2mol的NaCl (氯化鈉)、0.055mol的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)加水定容至1L。
[0083]2)、對上述日本晴、93-11、Fl (日本晴和93_11雜交一代)的水稻劍葉分別進(jìn)行如下處理:)
[0084]①、稱取0.1g的水稻劍葉用液氮研磨成粉狀，然后加入700 μ I的上述步驟I)配制的DNA提取緩沖液，65°C水浴40分鐘。再加700 μ I的氯仿:異戊醇(24:1的體積比)，并混勻。10，OOOrpm離 心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
[0085]②、在上述步驟①離心后所得的上清液中加2/3~I倍體積預(yù)冷(至4°C)的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀。13，OOOrpm離心8分鐘,倒出上清液。
[0086]③、再用70% (體積％)的已醇200 μ I洗滌上述步驟②所得的DNA沉淀物。
[0087]④、將上述洗滌后的DNA晾干并溶于100 μ I TE緩沖液或純水中。
[0088]⑤、紫外分光光度法檢測上述步驟④所得的DNA樣品的濃度，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。完整合適的DNA用于PCR擴(kuò)增，不完整的DNA則重新提取，直至獲得完整的DNA。
[0089]二、PCR 擴(kuò)增
[0090]I)、反應(yīng)體系:
[0091]水稻基因組DNA20ng/ulIul，10XPCR Buffer2.0ul,25mM MgCl22.0ul,2mMdNTP2.0ul，IOuM 正反向引物各 l.0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.2ul，ddH2010.8ul，總體系20ul。
[0092]NALl-Nar I 正向(F):CCCTCTATTCATTTGCATTCATC ；
[0093]反向(R):GGCTGTCCACAATGACAATAAA ；
[0094]2)、反應(yīng)程序:
[0095]95°C變性5分鐘；94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，40個(gè)循環(huán)；72°C補(bǔ)齊10分鐘。
[0096]三、電泳檢測 及回收
[0097]I)電泳檢測:[0098]取擴(kuò)增產(chǎn)物20ul，用2.0 %的瓊脂糖凝膠(含有0.5% ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。如圖1-1所示。
[0099]在圖1-1中，日本晴、93-11和日本晴與93-11雜交獲得的Fl均為607bp的條帶。
[0100]2) PCR產(chǎn)物回收:
[0101]PCR產(chǎn)物(607bp的目標(biāo)條帶)的回收選用北京百泰克生物技術(shù)有限公司開發(fā)的PCR產(chǎn)物回收試劑盒(離心柱型，目錄號:DP1403)，參照產(chǎn)品說明要求進(jìn)行。
[0102]四、Nar I酶切反應(yīng)及酶切產(chǎn)物電泳檢測:
[0103]I )、Nar I酶切反應(yīng)體系:
[0104]取PCR 回收產(chǎn)物 IOul (20ng/ul), 10XPCR NEBuffer2.0ul (美國 NEB 公司生產(chǎn)，型號:B7001S)，限制性內(nèi)切酶Nar Il.0ul (5U/ul ;美國NEB公司生產(chǎn)，型號:SR0191S)，ddH207.0ul，總體系20ul。在37°C的水浴鍋中酶切2小時(shí)。
[0105]2)、酶切產(chǎn)物電泳檢測:
[0106]取酶切產(chǎn)物20ul，用2.0 %的瓊脂糖凝膠(含有0.5% ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。如圖1-2所示。
[0107]根據(jù)圖1，我們能得出下述結(jié)論:CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I能夠檢測93_11和日本晴之間的多態(tài)性，日本晴的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段不能被限制性內(nèi)切酶Nar I酶切，酶切后只含已個(gè)607片段；而93-11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段含有限制性內(nèi)切酶Nar I識別位點(diǎn)，能被Nar I酶切為212bp和395bp大小的兩個(gè)片段。由此表明CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I能用于93-11和日本晴之間的分子檢測及其后代的標(biāo)記輔助選擇。
[0108]實(shí)施例2、用CAPS分子標(biāo)記NALl-`Nar I鑒定含寬葉基因的粳稻日本晴和窄葉基因93-11的序列差異
[0109]具體做法是:應(yīng)用CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I對日本晴和93-11的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物及擴(kuò)增產(chǎn)物的Nar I酶切后產(chǎn)物均委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，比較其序列的差異(圖2)。
[0110]一、提取 DNA
[0111]同實(shí)施例1。
[0112]二、PCR 擴(kuò)增
[0113]同實(shí)施例1。
[0114]三、電泳檢測、回收及測序
[0115]電泳檢測、回收同實(shí)施例1 ;回收的PCR產(chǎn)物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果見圖2-1和2-2。
[0116]四、Nar I酶切反應(yīng)及酶切產(chǎn)物電泳檢測
[0117]同實(shí)施例1。
[0118]五、Nar I酶切片段回收及測序
[0119]I個(gè)日本晴和2個(gè)93-llNar I酶切產(chǎn)物電泳后各片段分別回收(同實(shí)施例1);回收的PCR產(chǎn)物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。日本晴擴(kuò)增片段酶切前后序列大小一致；而93-11被Nar I酶切為212bp和395bp大小的兩個(gè)片段(圖2_3)。
[0120]根據(jù)圖2，我們能得出以下結(jié)論:日本晴和93-11的CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增產(chǎn)物存在單堿基差異(如圖2-1和圖2-2方框所示)，這是我們能夠使用CAPS分子標(biāo)記NALl-NarI檢測出其多態(tài)性的原因所在，該差異正位于限制性內(nèi)切酶Nar I識別位點(diǎn)(GG/CGCC)上(如圖2-1和圖2-2方框所示)。日本晴方框中的序列GGTGCC不能被限制性內(nèi)切酶Nar I所識別，而93-11方框中的序列GGCGCC能被所識別，也就是說日本晴的CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增片段不能被限制性內(nèi)切酶Nar I酶切，而93-11的CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I擴(kuò)增片段則能被限制性內(nèi)切酶Nar I酶切為兩個(gè)大小不等的片段。這正是我們能用于其后代標(biāo)記輔助選擇的遺傳基礎(chǔ)。
[0121]實(shí)施例3、利用CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I開展寬葉水稻的輔助選擇育種
[0122]具體做法是:含寬葉基因的供體親本日本晴，與秈稻品種93-11依次進(jìn)行雜交、回交和自交，對所得后代結(jié)合CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I的輔助選擇，選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株用于劍葉寬度的育種改良。
[0123]一、提取 DNA
[0124]同實(shí)施例1。
[0125]二、PCR 擴(kuò)增
[0126]同實(shí)施例1。
[0127]三、電泳檢測及回收
[0128]同實(shí)施例1。
[0129]四、Nar I酶切反應(yīng)及酶切產(chǎn)物電泳檢測
[0130]同實(shí)施 例1。
[0131]五、CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I開展寬葉的輔助選擇育種
[0132]寬葉基因的供體粳稻品種日本晴與普通秈稻品種93-11進(jìn)行雜交、回交和自交，結(jié)合CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I的輔助選擇,選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株(WL)進(jìn)一步用于育種改良(圖3-2)，淘汰帶型與93-11的帶型一致和同時(shí)具有日本晴和93-11帶型的個(gè)體(NL和NF單株)，育種材料的劍葉寬度根據(jù)齊穗期劍葉的平均寬度進(jìn)行檢測。
[0133]分析表明，所選擇的帶日本晴帶型的8個(gè)單株均比輪回親本93-11及雜合帶型的單株劍葉寬度明顯增加(圖4)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I可以用于水稻劍葉寬度的輔助選擇育種。
[0134]備注說明:
[0135]圖3和圖4中的“WL、NL和NF”均為日本晴和93-11依次進(jìn)行雜交、回交和自交獲得的，選擇了代表三種不同帶型的單株與其劍葉寬度進(jìn)行比較驗(yàn)證。
[0136]對比例1、利用CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I判別水稻劍葉寬度
[0137]具體做法是:將實(shí)施例3中被淘汰的帶型，即與93-11的帶型一致和雜合帶型(同時(shí)具有日本晴和93-11帶型)的個(gè)體繼續(xù)進(jìn)行種植，通過對其后代在齊穗期時(shí)劍葉的劍葉寬度進(jìn)行測定，進(jìn)一步分析CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I輔助選擇的可靠性。
[0138]一、提取 DNA
[0139]同實(shí)施例1。
[0140]二、PCR 擴(kuò)增
[0141]同實(shí)施例1。
[0142]三、電泳檢測及回收[0143]同實(shí)施例1。
[0144]四、Nar I酶切反應(yīng)及酶切產(chǎn)物電泳檢測
[0145]同實(shí)施例1。
[0146]五、CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I判別水稻劍葉寬度
[0147]隨機(jī)選擇了在實(shí)施例3中被淘汰3個(gè)帶型與93-11 —致的單株NL_1、NL_2和NL_3繼續(xù)種植，經(jīng)CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I檢測，其后代均表現(xiàn)與93-11 —致的帶型，分別收獲這些單株齊穗期時(shí)的劍葉寬度。另外，隨機(jī)選擇其中I個(gè)雜合帶型(H—同時(shí)具有日本晴和93-11帶型)的個(gè)體NF-2用于繼續(xù)種植，在其后代中隨機(jī)選取16個(gè)單株，CAPS分子標(biāo)記NALl-NarI檢測表明，該16個(gè)單株中有4個(gè)單株表現(xiàn)93-11帶型(Y)，8個(gè)單株表現(xiàn)雜合帶型(H)，4個(gè)表現(xiàn)日本晴帶型(N)，符合1:2:1的分離關(guān)系；待植株齊穗后，分別檢測這些單株的劍葉寬度。表1是這19個(gè)單株(株系)的劍葉平均寬度，3個(gè)與93-11帶型一致的單株均表現(xiàn)與93-11的劍葉寬度；而在帶型雜合NF-2的16個(gè)后代單株中，有12個(gè)單株表現(xiàn)類似與93-11的劍葉寬度(其中，4個(gè)單株的帶型表現(xiàn)93-11帶型，8個(gè)單株的帶型表現(xiàn)雜合帶型);4個(gè)呈日本晴帶型的單株，其劍葉平均寬度顯著高于93-11。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CAPS分子標(biāo)記NALl-Nar I可以用于判別93-11和日本晴雜交后代的劍葉寬度。
[0148]表1.水稻劍葉平均寬度及其對應(yīng)的基因型
【權(quán)利要求】
1.水稻劍葉寬度調(diào)控基因NALl的CAPS分子標(biāo)記NALl-NarI，以水稻作為物種，其特征是:所述分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5' —3'，
NALl-Nar 1:正向(F):CCCTCTATTCATTTGCATTCATC ； 反向(R):GGCTGTCCACAATGACAATAAA。
2.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記NALl-NarI的開發(fā)方法，其特征是包括以下步驟: 1)、以粳稻品種日本晴作為劍葉寬度基因供體親本與秈稻93-11進(jìn)行雜交、回交和自交，從而獲得作為后代的寬劍葉水稻單株； 2)、提取水稻親本幼苗及后代幼苗的基因組DNA； 3)、米用CAPS分子標(biāo)記方法進(jìn)行水稻寬劍葉單株分子標(biāo)記的篩選； 4)、鑒定出CAPS分子標(biāo)記NALl-NarI。
3.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記NALl-NarI的用途，其特征是:用于水稻寬劍葉株系/或其后代輔助選擇育種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記NALl-NarI的用途，其特征是:當(dāng)篩選日本晴和秈稻93-11的后代時(shí)，選擇后代中`帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種。
【文檔編號】C12N15/11GK103865925SQ201410083623
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月9日
【發(fā)明者】張光恒, 錢前, 王莉, 曾大力, 饒玉春, 胡江, 朱麗, 徐杰, 郭龍彪, 高振宇, 董國軍, 任德勇, 顏美仙, 胡興明 申請人:中國水稻研究所