一種kras基因突變檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒,包括:帶盒蓋的盒體、擋板、2個(gè)海綿、1個(gè)裝有蒸餾水的試管、2個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子1PCR引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2PCR引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子1測(cè)序引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2測(cè)序引物的試管,本試劑盒結(jié)構(gòu)完全基于一種新的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì),結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單合理、使用方便、分區(qū)設(shè)計(jì)使得檢測(cè)過(guò)程不易受污染;本試劑盒在檢測(cè)KRAS基因第2號(hào)外顯子突變時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn);本試劑盒中設(shè)置的擋板,使得一個(gè)空間變?yōu)閮蓚€(gè)空間,能有效防止試劑交叉等引起的污染,使得實(shí)驗(yàn)更準(zhǔn)確。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]1)KRAS基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌中的臨床意義
[0003]近年來(lái),隨著人民生活水平的不斷提高,飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化,我國(guó)結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢(shì)。其中,結(jié)腸癌的發(fā)病率上升尤為顯著。大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于中晚期。結(jié)直腸癌發(fā)病率22.1萬(wàn),死亡率11萬(wàn),5年生存率63.7%。
[0004]KRAS是EGFR (表皮生長(zhǎng)因子受體)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的一個(gè)關(guān)鍵的下游調(diào)節(jié)因子,參與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié),在癌變發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。KRAS基因產(chǎn)物參與了控制基因轉(zhuǎn)錄的激酶信號(hào)傳導(dǎo)路徑,從而能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。KRAS基因的改變使KRAS蛋白發(fā)生變化,其結(jié)果KRAS蛋白不再具有裂 解GTP分子和釋放GTP分子的能力。這樣的改變導(dǎo)致這條信號(hào)傳導(dǎo)路徑始終處于“開(kāi)”通的狀態(tài)。這種“開(kāi)”的信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)和增生。因此KRAS的過(guò)度表達(dá)與擴(kuò)增導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞增殖,這是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵一步。
[0005]西妥昔單抗和帕尼單抗是作用于EGFR的單克隆抗體,可以抑制下游的信號(hào)通路傳導(dǎo)。2008年6月,美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)年會(huì)上CRYSTAL、OPUS等研究了西妥昔單抗聯(lián)合F0LFIRI和FOLFOX作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的初始治療作用,結(jié)論為:KRAS野生型患者在加用西妥昔單抗治療后PFS得到了顯著改善。若KRAS有突變,則無(wú)論單藥或聯(lián)合均不應(yīng)使用西妥昔單抗或帕尼單抗,因?yàn)椴粌H無(wú)效,還增加副反應(yīng),浪費(fèi)金錢(qián)。
[0006]2008年10月,KRAS基因檢測(cè)被寫(xiě)入《美國(guó)國(guó)立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》,專(zhuān)家組強(qiáng)烈推薦所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行KRAS基因型檢測(cè),原發(fā)灶或繼發(fā)灶組織均可,對(duì)于KRAS野生型的患者可考慮進(jìn)一步檢測(cè)BRAF分型。
[0007]2010年版中國(guó)《結(jié)直腸癌診療規(guī)范》指出:完整的病理報(bào)告內(nèi)容應(yīng)該包括K-ras基因狀態(tài)的檢測(cè),同時(shí)晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌靶向藥物治療前應(yīng)檢測(cè)KRAS。
[0008]2) KRAS基因突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌NSCLC的臨床意義
[0009]原發(fā)性肺癌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)肺癌)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。2012年WHO統(tǒng)計(jì)顯示,肺癌是我國(guó)目前發(fā)病率和死亡率第I位的惡性腫瘤?;诜伟┑纳飳W(xué)特性、治療和預(yù)后,WHO將其分為兩大類(lèi):非小細(xì)胞肺癌NSCLC和小細(xì)胞肺癌SCLC。其中NSCLC占肺癌的85%以上。雖然治療肺癌技術(shù)有了很大的提高,但5年生存率沒(méi)有明顯改善,而且大多數(shù)肺癌患者死于無(wú)法控制的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,傳統(tǒng)的化療和放療由于缺乏特異性,取得療效的同時(shí)也往往給患者帶來(lái)較大的副作用。因此,選擇肺癌細(xì)胞特異的分子靶點(diǎn),應(yīng)用針對(duì)該靶點(diǎn)的藥物進(jìn)行治療,在取得明顯療效的同時(shí)又避免對(duì)正常細(xì)胞的傷害的治療模式,已經(jīng)被腫瘤學(xué)術(shù)界和廣大患者所認(rèn)同和采用。
[0010]EGFR (epidermal growth factor receptor,表皮生長(zhǎng)因子受體)是目前用于NSCLC分子靶向治療的最主要靶點(diǎn)。EGFR受體抑制劑TKI小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor),通過(guò)阻斷細(xì)胞受體的ATP結(jié)合位點(diǎn),阻止下游信號(hào)傳遞而產(chǎn)生抑制腫瘤作用。
[0011] 三種EGFR-TKI (吉非替尼/易瑞沙,厄羅替尼/特羅凱,和凱美鈉)是目前用于NSCLC分子靶向治療的主要藥物,但在不同的病人中EGFR-TKI的療效差異很大。大量臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),除了 EGFR突變,KRAS突變能幫助NSCLC病人更好的預(yù)測(cè)吉非替尼療效;KRAS突變的NSCLC病人用厄洛替尼聯(lián)合處理后臨床預(yù)后較差。
[0012]2012年《美國(guó)國(guó)立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》病理評(píng)估原則中明確=KRAS突變和內(nèi)源性TKI耐藥有關(guān),確定KRAS基因狀態(tài)有助于選擇適合TKI治療的病人。同時(shí)指出,KRAS基因狀態(tài)是NSCLC生存的預(yù)后指標(biāo),也是EGFR-TKI藥物的療效預(yù)測(cè)指標(biāo);還和順鉬/長(zhǎng)春瑞濱化療療效相關(guān)。
[0013]目前臨床檢測(cè)KRAS基因突變的檢測(cè)試劑原料配備較多,實(shí)驗(yàn)過(guò)程較為繁瑣,設(shè)計(jì)的原料種類(lèi)較多,耗時(shí)較長(zhǎng),容易污染,準(zhǔn)確性不高,另外冷凍的試劑反復(fù)凍融多次會(huì)造成試劑失效,所以探索一種檢測(cè)KRAS基因快速可靠的方法已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)不得不解決的問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0014]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒,本試劑盒結(jié)構(gòu)完全基于一種新的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì),結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單合理、使用方便、分區(qū)設(shè)計(jì)使得檢測(cè)過(guò)程不易受污染。
[0015]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下:一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒,包括:帶盒蓋的盒體、擋板、2個(gè)海綿、I個(gè)裝有蒸餾水的試管、2個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子IPCR引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2PCR引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子I測(cè)序引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2測(cè)序引物的試管,
[0016]其中,所述擋板置于盒體內(nèi),將盒體分成兩個(gè)部分,所述2個(gè)海綿分別置于擋板兩側(cè)的盒體內(nèi),在海綿上打有容器孔,所述I個(gè)裝有蒸餾水的試管、2個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子IPCR引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2PCR引物的試管置于擋板一側(cè)海綿的容器孔內(nèi),所述3個(gè)裝有KRAS外顯子I測(cè)序引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2測(cè)序引物的試管置于擋板另一側(cè)海綿的容器孔內(nèi)。
[0017]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上,本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
[0018]進(jìn)一步,所述兩個(gè)海綿中的一個(gè)打有9個(gè)容器孔,另一個(gè)海綿打有6個(gè)容器孔。
[0019]進(jìn)一步,所述容器孔在海綿上平行排列。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有產(chǎn)品相比有如下積極有益的效果:
[0021]本試劑盒完全基于一種新的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì),結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單合理、使用方便、分區(qū)設(shè)計(jì)使得檢測(cè)過(guò)程不易受污染;
[0022]本試劑盒在檢測(cè)KRAS基因第2號(hào)外顯子突變時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn);
[0023]本試劑盒中設(shè)置的擋板,使得一個(gè)空間變?yōu)閮蓚€(gè)空間,能有效防止試劑交叉等引起的污染,將所有引物試劑分成兩管存儲(chǔ),可以有效減少試劑反復(fù)凍融的風(fēng)險(xiǎn),使得實(shí)驗(yàn)更準(zhǔn)確?!緦?zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖;
[0025]附圖中,各標(biāo)號(hào)所代表的部件列表如下:
[0026]1、盒體,2、海綿、3、擋板,4、裝有蒸餾水的試管,5、裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管,6、裝有KRAS外顯子IPCR引物的試管,7、裝有KRAS外顯子2PCR引物的試管,8、裝有KRAS外顯子I測(cè)序引物的試管,9、裝有KRAS外顯子2測(cè)序引物的試管,10、容器孔。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述,所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明,并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1
[0029]如圖1所示,一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒,包括:帶盒蓋的盒體1、擋板3、2個(gè)海綿2、I個(gè)裝有蒸餾水的試管4、2個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管5、3個(gè)裝有KRAS外顯子IPCR引物的試管6、3個(gè)裝有KRAS外顯子2PCR引物的試管7、3個(gè)裝有KRAS外顯子I測(cè)序引物的試管8、3個(gè)裝 有KRAS外顯子2測(cè)序引物的試管9,
[0030]其中,所述擋板3置于盒體I內(nèi),將盒體I分成兩個(gè)部分,所述2個(gè)海綿2分別置于擋板3兩側(cè)的盒體I內(nèi),在海綿2上打有容器孔10,所述I個(gè)裝有蒸餾水的試管4、2個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管5、3個(gè)裝有KRAS外顯子IPCR引物的試管6、3個(gè)裝有KRAS外顯子2PCR引物的試管7置于擋板3 —側(cè)海綿2的容器孔10內(nèi),所述3個(gè)裝有KRAS外顯子I測(cè)序引物的試管8、3個(gè)裝有KRAS外顯子2測(cè)序引物的試管9置于擋板3另一側(cè)海綿2的容器孔10內(nèi)。
[0031]所述兩個(gè)海綿2中的一個(gè)打有9個(gè)容器孔10,另一個(gè)海綿2打有6個(gè)容器孔10。
[0032]所述容器孔10在海綿2上平行排列。
[0033]操作方法:
[0034]1、DNA提取:(使用天根公司基因組DNA提取試劑盒,貨號(hào)DP331)按照提取試劑盒說(shuō)明書(shū)做常規(guī)DNA提取,最終DNA的洗脫體積50ul,若DNA當(dāng)天不使用,則要保存在_20°C。
[0035]2、PCR:將PCR反應(yīng)預(yù)混液、雙蒸水及KRAS PCR引物,室溫融化并混勻,2000rpm
離心3秒。
[0036]所述PCR反應(yīng)預(yù)混液為2XTaq mix (novoprotein公司,產(chǎn)品貨號(hào):E005)
[0037]試劑盒包含2套PCR引物。一套能夠擴(kuò)增KARS基因外顯子1,包含12、13密碼子在內(nèi)的片段,另一套能夠擴(kuò)增KARS基因外顯子2,包含61密碼子在內(nèi)的片段。每套PCR引物中均有一條引物標(biāo)記了生物素的引物,它能保證在測(cè)序反應(yīng)中正確分離出待測(cè)DNA鏈。同時(shí),該試劑盒還含有2條不同的測(cè)序引物,一條用于12、13密碼子,另一條用于61密碼子,它們用于后續(xù)的焦磷酸序列分析中檢測(cè)并定量者最常見(jiàn)的3個(gè)密碼子突變。
[0038]基因KRAS第I外顯子的正向引物、反向引物和測(cè)序引物:
[0039]F:5/ -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3' (SEQ ID N0.1);
[0040]R:5/ -GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3' (SEQ ID N0.2),5'端生物素標(biāo)記;
[0041]測(cè)序引物:5'-AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3' (SEQ ID N0.5),檢測(cè)密碼子 12、13 ;[0042]基因KRAS第2外顯子的正向引物、反向引物和測(cè)序引物:
[0043]F:5/ -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3/ (SEQ ID N0.3);
[0044]R:5/ -AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' (SEQ ID N0.4),5'端生物素標(biāo)記;
[0045]測(cè)序引物:5'-TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID N0.6),檢測(cè)密碼子 61 ;
[0046]所述基因KRAS外顯子IPCR引物和KRAS外顯子2PCR引物的濃度均為10 μ mol/L ;
[0047]所述基因KRAS外顯子I測(cè)序引物和KRAS外顯子2測(cè)序引物的濃度均為IOymol/L ;
[0048]每個(gè)樣本需要做兩管PCR擴(kuò)增,體系配制如表1和表2,基因KRAS外顯子I和外顯子2PCR擴(kuò)增的總體積均為25ul。
[0049]表1
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒,其特征在于,包括:帶盒蓋的盒體、擋板、2個(gè)海綿、I個(gè)裝有蒸餾水的試管、2個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子IPCR引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2PCR引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子I測(cè)序引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2測(cè)序引物的試管, 其中,所述擋板置于盒體內(nèi),將盒體分成兩個(gè)部分,所述2個(gè)海綿分別置于擋板兩側(cè)的盒體內(nèi),在海綿上打有容器孔,所述I個(gè)裝有蒸餾水的試管、2個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子IPCR引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2PCR引物的試管置于擋板一側(cè)海綿的容器孔內(nèi),所述3個(gè)裝有KRAS外顯子I測(cè)序引物的試管、3個(gè)裝有KRAS外顯子2測(cè)序引物的試管置于擋板另一側(cè)海綿的容器孔內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒,其特征在于,所述兩個(gè)海綿中的一個(gè)打有9個(gè)容器孔 ,另一個(gè)海綿打有6個(gè)容器孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒,其特征在于,所述容器孔在海綿上平行排列。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK103937664SQ201410078862
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】王彤, 陳大方 申請(qǐng)人:瑞?;蚩萍迹ū本┕煞萦邢薰?br>