乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗制備及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗制備方法，其中，所述方法包括采用鑒定的乳腺癌特異表達(dá)的人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結(jié)構(gòu)域1蛋白的人白細(xì)胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ?ID?NO.1-6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽，并由SEQ?ID?NO.1-6中一項以上多肽負(fù)載樹突狀細(xì)胞，制備成樹突狀細(xì)胞疫苗，可引發(fā)很強(qiáng)的靶向乳腺癌的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明還提供了制備所述乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗的試劑盒。
【專利說明】乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗制備及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗的方法、使用所述方法的試劑盒、以及通過所述方法獲得的樹突細(xì)胞和疫苗。特別地，本發(fā)明涉及采用鑒定的乳腺癌特異表達(dá)的人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結(jié)構(gòu)域I蛋白的人白細(xì)胞抗原A201陽性表位多肽，負(fù)載樹突狀細(xì)胞的制備方法、使用所述方法的試劑盒、以及通過所述方法獲得的樹突細(xì)胞疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，乳腺癌是威脅女性健康最主要的疾病之一，中國是乳腺癌發(fā)病率增長速度最快的國家之一，約有47萬患者，現(xiàn)在乳腺癌發(fā)病率正以每年3%的速度遞增，已成為城市女性的第一殺手?，F(xiàn)有技術(shù)即常規(guī)治療手段手術(shù)、化療和放療等可以去除或殺死機(jī)體大部分乳腺癌，但還存在一些殘余的乳腺癌細(xì)胞或產(chǎn)生耐藥的乳腺癌細(xì)胞成為癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的“元兇”，使得患者不能得到較長的生存期以及預(yù)后不佳。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，臨床治療癌癥的技術(shù)也不斷呈現(xiàn)并發(fā)揮著很好效果，其中細(xì)胞免疫治療癌癥得到很好的發(fā)展，應(yīng)用患者自體免疫細(xì)胞臨床治療乳腺癌取得良好的療效，能有效清除患者機(jī)體內(nèi)殘余腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而且臨床上無任何毒副作用。樹突狀細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)最大的抗原呈遞細(xì)胞，通過吞噬和加工機(jī)體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞，與T淋巴細(xì)胞結(jié)合并將抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞，由該T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。樹突狀細(xì)胞疫苗已在臨床上用于治療乳腺癌病人，樹突狀細(xì)胞如何獲得更佳地抗腫瘤效果，完全取決于腫瘤特異表達(dá)的抗原，因而篩選和找到腫瘤特異表達(dá)的抗原是樹突狀細(xì)胞發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
[0003]人類表皮生長因子受體2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor2, Her2 /neu)是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，由1255個氨基酸組成，720-987位屬于酪氨酸激酶區(qū)，屬于表皮生長因子受體家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，30%以上的人類腫瘤中存在HER2基因的擴(kuò)增/過度表達(dá)(如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、輸卵管癌、胃癌和前列腺癌等)；其中20% -30%的原發(fā)性浸潤性乳腺癌有HER2基因的擴(kuò)增/過度表達(dá)，提示HER2的過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和侵襲有關(guān)，可提高轉(zhuǎn)移的危險；轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和動物模型證實，其可改變腫瘤對激素和化療藥物的敏感性。
[0004]乳腺癌耐藥蛋白(Breastcancer resistance protein,BCRP)含 655 個氨基酸殘基的跨膜蛋白，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員，BCRP僅有6個跨膜區(qū)和I個ATP的結(jié)合位點(diǎn)，BCRP通過組成同二聚體或異二聚體構(gòu)成跨膜通道而發(fā)揮功能，過表達(dá)BCRP的腫瘤細(xì)胞株對米托蒽醌，阿霉素，柔紅霉素，鬼白乙叉甙和拓?fù)涮婵档犬a(chǎn)生交叉耐藥，是導(dǎo)致臨床乳腺癌治療失敗的最主要原因之一。人乳腺癌組織BCRP陽性表達(dá)率為35%以上，而且BCRP陽性表達(dá)率與耐藥和轉(zhuǎn)移正相關(guān)。
[0005]IQ 基序與 Sec7 結(jié)構(gòu)域 I 蛋白(IQ motif and Sec7domainl,GEP100)與促使乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了過高水平，激活A(yù)rf6導(dǎo)致非侵入性細(xì)胞在EGFR的刺激下變成侵入性細(xì)胞。相反地，當(dāng)GEPlOO被抑止時，被注入高水平侵入性乳腺癌細(xì)胞的小鼠體內(nèi)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移被抑止了。取自入侵性乳腺癌患者的臨床樣品中有高水平的GEP100, GEP100和EGFR的同時出現(xiàn)與腫瘤惡性化有關(guān)。
[0006]因而研究確認(rèn)Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白在乳腺癌患者表達(dá)顯著，其可作為乳腺癌耐藥及其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛在的主要標(biāo)志物。
[0007]綜上，針對特異表達(dá)Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷具有很好的臨床應(yīng)用意義，可以高效準(zhǔn)確地對乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行清除，而且可以靶向惡性程度高的腫瘤細(xì)胞，并有效抑制乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，同時不影響機(jī)體正常細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了高效靶向乳腺癌進(jìn)行殺傷和有效抑制乳腺癌的耐藥性、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，本發(fā)明首先對乳腺癌特異表達(dá)并與腫瘤細(xì)胞的耐藥性、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的腫瘤抗原進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白在乳腺癌中特異表達(dá)，特別是在耐藥性的和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，而正常組織細(xì)胞中不表達(dá)。本發(fā)明通過抗原表位預(yù)測系統(tǒng)分析了 Her2 / neu,BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽，并進(jìn)行細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞實驗鑒定得到6條可引發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的HLA-A201陽性的表位多肽。本發(fā)明是提供了Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的HLA-A201陽性的表位多肽，該多肽可以用于負(fù)載樹突狀細(xì)胞，引發(fā)特異性的靶向乳腺癌的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
[0009]本發(fā)明提供了乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗制備方法，以及提供使用本發(fā)明所述方法的試劑盒，通過本發(fā)明所述方法獲得的樹突細(xì)胞疫苗。
[0010]本發(fā)明提供了乳腺癌腫瘤特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗的方法，其中，所述方法包括采用鑒定的腫瘤特異表達(dá)的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的人白細(xì)胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ ID N0.1-6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽，負(fù)載樹突狀細(xì)胞。通過采集人外周血中白細(xì)胞，經(jīng)體外分離純化獲得的單個核細(xì)胞，在人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白介素4誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得未成熟樹突狀細(xì)胞；未成熟樹突狀細(xì)胞負(fù)載Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的SEQ ID N0.1_6中任一項抗原表位多肽后，并在腫瘤壞死因子a與脂多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下獲得具有抗腫瘤作用的成熟樹突狀細(xì)胞疫苗。
[0011]根據(jù)本發(fā)明提供了一種制備乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞疫苗由SEQ ID N0.1-6中一項以上抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明還提供了一種樹突狀細(xì)胞疫苗，所述樹突狀細(xì)胞疫苗包括樹突狀細(xì)胞，其中，所述樹突狀細(xì)胞為本發(fā)明所述的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的SEQ ID N0.1_6中抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明還提供了一種制備乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗的試劑盒，其中，所述試劑盒包括:
[0014]I)樹突狀細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
[0015]2)Her2 / neu、BCRP 和 GEP100 蛋白 SEQ ID N0.1-6 中一項以上抗原表位多肽；
[0016]3)巨粒細(xì)胞-噬細(xì)胞集落刺激因子；[0017]4)白介素_4、脂多糖和腫瘤壞死因子a ;以及
[0018]5)使用說明書；
[0019]其中，所述使用說明書包括權(quán)利要求1-5所述的方法。
[0020]通過本發(fā)明的方法，通過篩選和鑒定得到的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的人白細(xì)胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ ID N0.1-6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽。由本發(fā)明提供的方法得到的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的人白細(xì)胞抗原A201陽性表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞的藥物，能夠在體內(nèi)和體外引發(fā)免疫應(yīng)答來殺死引起復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞，從而為克服乳腺癌耐受性、根治乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了可能，特別是原發(fā)性乳腺癌等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1表示由實施例1和4所得Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽單負(fù)載的DC引發(fā)的酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像自動分析儀檢測干擾素Y酶聯(lián)斑點(diǎn)計數(shù)結(jié)果。
[0022]圖2表示由實施例1和4所得Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽分別負(fù)載的DC引發(fā)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)產(chǎn)生的應(yīng)答結(jié)果對比圖。
[0023]圖3表示由實施例1和5所得Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽多負(fù)載樹突狀細(xì)胞引發(fā)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對表達(dá)Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)產(chǎn)生的應(yīng)答結(jié)果對比圖。
【具體實施方式】
[0024]本發(fā)明提供了一種制備乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗的方法，其中，所述方法包括采用鑒定的腫瘤特異表達(dá)的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的人白細(xì)胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ ID N0.1-6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽，負(fù)載樹突狀細(xì)胞。通過采集人外周血中白細(xì)胞，經(jīng)體外分離純化獲得的單個核細(xì)胞，在人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白介素4誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得未成熟樹突狀細(xì)胞；未成熟樹突狀細(xì)胞負(fù)載Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的SEQ ID N0.1_6中任一項抗原表位多肽后，并在腫瘤壞死因子a與脂多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下獲得具有抗腫瘤作用的成熟樹突狀細(xì)胞疫苗，見下表。
【權(quán)利要求】
1.一種乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述方法包括采用鑒定的乳腺癌特異表達(dá)的人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結(jié)構(gòu)域I蛋白的人白細(xì)胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ ID N0.1_6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽，負(fù)載樹突狀細(xì)胞，可引發(fā)特異性的靶向乳腺癌的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞疫苗為由SEQIDN0.1-6中人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結(jié)構(gòu)域I蛋白中任一項以上抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞疫苗，優(yōu)選地由SEQID N0.1-6中人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結(jié)構(gòu)域I蛋白三項抗原表位多肽組成的多肽組合物負(fù)載。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞通過以下方法獲取: 取IOOmL外周血經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個核細(xì)胞；外周血單個核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，并加入6孔板中貼壁； 在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育90min后，未貼壁細(xì)胞洗滌收集下來，用于誘導(dǎo)CIK細(xì)胞；貼壁細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基RPMI1640誘導(dǎo)培養(yǎng)，含有5%的自體血清、2000IU / mL重組人粒細(xì)胞巨噬集落刺激因子和1500IU / mL IL-4 ； 在培養(yǎng)到第三天時細(xì)胞 更換新鮮培養(yǎng)基； 培養(yǎng)到第五天收獲未成熟樹突狀細(xì)胞(DCs);成熟DCs采用完全RPMI1640培養(yǎng)基再誘導(dǎo)到第七天得到，含0.1 ii g / mL脂多糖和20ng / mL腫瘤壞死因子a。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述負(fù)載DCs通過以下方法獲取: 培養(yǎng) 5 天后，3 X 106 個未成熟 DCs 用 HER2 / NEU,BCRP 和 GEP100 蛋白 SEQ ID N0.1-6中一項以上抗原表位多肽組合物在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中負(fù)載2小時；抗原負(fù)載的DCs通過離心收獲得到；所得DCs經(jīng)生理鹽水洗滌3次，后重懸到生理鹽水中，至濃度為3 X IO6成熟DC / mL，并添加終濃度為質(zhì)量體積比2%的人血白蛋白，從而制備成負(fù)載的DC疫苗。
6.一種含權(quán)利要求1-5中任一項所述的制備乳腺癌特異抗原表位多肽負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 1)樹突狀細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基； 2)SEQ ID N0.1-6中人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結(jié)構(gòu)域I蛋白中任一項以上抗原表位多肽； 3)巨粒細(xì)胞-噬細(xì)胞集落刺激因子； 4)白介素-4、脂多糖和腫瘤壞死因子a;以及 5)使用說明書； 其中，所述使用說明書包括權(quán)利要求1-5任一項所述的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒，優(yōu)選地包括由SEQIDN0.1-6中人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結(jié)構(gòu)域I蛋白三項抗原表位多肽組成的多肽組合物。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的樹突狀細(xì)胞疫苗在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/0784GK103784950SQ201410030180
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】沈麗, 黃啟明, 郝麗敏 申請人:北京弘潤源生物技術(shù)有限公司