控制害蟲的構(gòu)建體及其方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種控制害蟲的構(gòu)建體及其方法，所述構(gòu)建體包括Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白。本發(fā)明控制害蟲的構(gòu)建體及其方法通過植物體內(nèi)產(chǎn)生Cry1Ca和Cry1Ab/Ac蛋白來控制害蟲；與現(xiàn)有技術(shù)使用的農(nóng)業(yè)防治方法、化學(xué)防治方法和生物防治方法相比，本發(fā)明不僅毒力強、效果徹底，而且對植物進行全生育期、全植株的保護以防治害蟲的侵害，且無污染、無殘留，效果穩(wěn)定，簡單、方便、經(jīng)濟。
【專利說明】控制害蟲的構(gòu)建體及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種控制害蟲的構(gòu)建體及其方法，特別是涉及一種用在植物中表達CrylCa蛋白和CrylAb/Ac蛋白的構(gòu)建體來控制害蟲為害植物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米和水稻是中國重要的糧食作物，每年因植物蟲害造成的糧食損失巨大，更甚者影響到當?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治植物蟲害，人們通常使用廣譜化學(xué)殺蟲劑和生物殺蟲制劑，但二者在實際應(yīng)用中都具有局限性:化學(xué)殺蟲劑會帶來環(huán)境污染的問題，并導(dǎo)致抗藥性昆蟲的出現(xiàn)；而生物殺蟲制劑在環(huán)境中容易降解，在生產(chǎn)上需要重復(fù)施用，大大增加了生產(chǎn)成本。
[0003]為了解決化學(xué)殺蟲劑和生物殺蟲制劑在實際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲害。CrylCa蛋白和CrylAb/Ac蛋白均為Bt毒素，是不溶性伴孢結(jié)晶蛋白，這類蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性pH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細胞膜內(nèi)外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導(dǎo)致其死亡。[0004]目前CryI Ca蛋白和Cry I Ab/Ac蛋白大部分以單基因的形式在植物中應(yīng)用，尤其是CrylCa蛋白，其以單基因形式存在時對二化螟和大螟的抗性不高，可能會造成二化螟和大螟對這兩個基因單獨抗性的產(chǎn)生，阻礙轉(zhuǎn)基因抗性材料的推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種控制害蟲的構(gòu)建體及其方法，首次提供了通過產(chǎn)生表達CrylCa蛋白和CrylAb/Ac蛋白的構(gòu)建體來控制害蟲為害植物的方法，且有效克服現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等技術(shù)缺陷。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體，包括CrylCa蛋白和CrylA蛋白。
[0007]進一步地，所述構(gòu)建體包括第一表達盒和第二表達盒,所述第一表達盒包括CrylCa蛋白，所述第二表達盒包括CrylA蛋白。
[0008]更進一步地，所述第一表達盒還包括與CrylCa蛋白有效連接的調(diào)控序列，所述第二表達盒還包括與CrylA蛋白有效連接的調(diào)控序列。
[0009]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述CrylCa蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。所述CrylCa蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
[0010]進一步地,所述CrylA蛋白為CrylAb/Ac蛋白。所述CrylAb/Ac蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。所述Cry lAb/Ac蛋白的核苷酸序列具有SEQ IDN0:5所示的核苷酸序列。[0011 ] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述構(gòu)建體的重組載體。
[0012]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，包括:
[0013]獲得包含所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞；
[0014]在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞；
[0015]回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。
[0016]進一步地，所述轉(zhuǎn)基因宿主生物包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
[0017]優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0018]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，包括:將所述構(gòu)建體編碼的殺蟲蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于所述構(gòu)建體編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第三種殺蟲核苷酸一起表達。
[0019]進一步地,所述第三種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。
[0020]可選擇地，所述第三種殺蟲核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0021]在本發(fā)明中，所述構(gòu)建體在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現(xiàn)。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達所述構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。
`[0022]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達。
[0023]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，包括:將所述構(gòu)建體或所述重組載體導(dǎo)入植物。
[0024]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，包括:將所述構(gòu)建體或所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。
[0025]將所述構(gòu)建體或所述重組載體導(dǎo)入植物，在本發(fā)明中為將外源DNA導(dǎo)入植物細胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0026]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制昆蟲害蟲的方法，包括:使昆蟲害蟲與抑制量的所述構(gòu)建體編碼的昆蟲抑制性蛋白接觸。
[0027]進一步地,所述CrylCa蛋白和所述Cry lAb/Ac蛋白存在于產(chǎn)生其的植物細胞中，所述昆蟲害蟲通過攝食所述植物細胞與所述CrylCa蛋白和所述Cry lAb/Ac蛋白接觸。
[0028]更進一步地,所述CrylCa蛋白和所述Cry lAb/Ac蛋白存在于產(chǎn)生其的轉(zhuǎn)基因植物中，所述昆蟲害蟲通過攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述CrylCa蛋白和所述Cry lAb/Ac蛋白接觸，接觸后所述昆蟲害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以實現(xiàn)對昆蟲害蟲為害植物的控制。[0029]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
[0030]所述轉(zhuǎn)基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0031]所述對昆蟲害蟲為害植物的控制不因種植地點的改變而改變。
[0032]所述對昆蟲害蟲為害植物的控制不因種植時間的改變而改變。
[0033]所述植物可以來自玉米、水稻、高粱、麥、粟、棉花、蘆葦、甘蔗、茭白、蠶豆或油菜。
[0034]所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylCa蛋白和所述Cry lAb/Ac蛋白的多核苷酸的植物。
[0035]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述昆蟲害蟲為鱗翅目昆蟲害蟲。優(yōu)選地，所述鱗翅目昆蟲害蟲為大螟和/或二化螟。
[0036]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述構(gòu)建體編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)控制昆蟲害蟲的用途。
[0037]本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0038]本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
[0039]本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0040]任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發(fā)明CrylCa基因和/或CrylAb/Ac基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。本發(fā)明中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0041]本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用2.0XSSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0父55(:、501:到高度嚴格條件的約0.2\55(:、501:。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴格條件的約65°C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO: 5發(fā)生特異性雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。
[0042]因此，具有抗蟲活性并在嚴格條件下與本發(fā)明SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO: 5雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約 60%、65% 或 70% 同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同源性。
[0043]本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的殺蟲活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述“等價蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗鱗翅目昆蟲害蟲的生物活性的蛋白。
[0044]本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲毒素。
[0045]使用標準技術(shù)可以修飾基因和容易的構(gòu)建基因變異體。例如，本領(lǐng)域熟知制造點突變的技術(shù)。又例如美國專利號5605793描述了在隨機斷裂后使用DNA重裝配產(chǎn)生其它分子多樣性的方法?？梢允褂蒙虡I(yè)化核酸內(nèi)切酶制造全長基因的片段，并且可以按照標準程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性內(nèi)切酶獲取編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些毒素的活性片段。
[0046]本發(fā)明可以從B.t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價蛋白和/或編碼這些等價蛋白的基因。有多種方法獲取本發(fā)明的殺蟲蛋白。例如，可以使用本發(fā)明公開和要求保護的殺蟲蛋白的抗體從蛋白質(zhì)混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒定和與其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價蛋白?？墒褂帽绢I(lǐng)域標準程序容易的制備本發(fā)明中公開的蛋白或等價蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。
[0047]由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實質(zhì)上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。
[0048]本發(fā)明中氨基酸序列的取代 、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為:小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。
[0049]保守取代的實例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
[0050]對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells, 1989, Science244:1081_1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標記等技術(shù)測定(參見，如de Vos等，1992，Science255:306-312 ；Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899-904 ；fflodaver 等，1992，F(xiàn)EBSLetters309:59_64)。
[0051]在本發(fā)明中，Cry 1A蛋白包括但不限于CrylAb、CrylAc、CrylAb/Ac或CrylAh蛋白，或者與上述蛋白的氨基酸序列具有至少7`0%同源性且對大螟和/或二化螟具有殺蟲活性的殺蟲片段或功能區(qū)域。
[0052]因此，與序列1和/或序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60%，優(yōu)選的大于75%，更優(yōu)選的大于80%，甚至更優(yōu)選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。
[0053]本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運肽、終止子，增強子，前導(dǎo)序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述CrylCa蛋白和所述CrylA蛋白的調(diào)節(jié)序列。
[0054]所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的“植物中可表達的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內(nèi)進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米Ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達模式的啟動子是指當植物經(jīng)受機械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。
[0055]所述轉(zhuǎn)運肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細胞器或細胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0056]所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。
[0057]所述增強子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強子。
[0058]對于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-1內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級泛素”內(nèi)含子。
[0059]所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。
[0060]本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示:啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異 性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細菌的復(fù)制起點、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。
[0061]本發(fā)明中所述的“殺蟲”是指對農(nóng)作物害蟲是有毒的。更具體地，目標昆蟲是大螟和/或二化螟害蟲。
[0062]本發(fā)明中的植物，特別是水稻和玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含編碼CryICa蛋白和Cry 1A蛋白的核苷酸序列，昆蟲害蟲通過攝食植物組織與該蛋白接觸，接觸后大螟和/或二化螟害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?。抑制是指致死或亞致死。同時，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學(xué)或生物殺蟲劑的需要。
[0063]植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達水平可通過本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法進行檢測，例如通過應(yīng)用特異引物對組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲蛋白質(zhì)的mRNA進行定量，或直接特異性檢測產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)的量。
[0064]可以應(yīng)用不同的試驗測定植物中ICP的殺蟲效果。本發(fā)明中目標昆蟲主要為大螟
和/或二化螟。
[0065]本發(fā)明中，所述CrylCa蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；所述CrylAb/Ac蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。除了包含CrylCa蛋白和CrylA蛋白的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運肽的編碼區(qū)或編碼選擇性標記的蛋白質(zhì)。[0066]此外，包含編碼本發(fā)明CrylCa蛋白和Cry 1A蛋白的構(gòu)建體在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
[0067]本發(fā)明提供了一種控制害蟲的構(gòu)建體及其方法，具有以下優(yōu)點:
[0068]1、毒力強、效果徹底。由于本發(fā)明所述構(gòu)建體包含兩種不同殺蟲機制的CrylCa蛋白和CrylA蛋白，使得包含本發(fā)明所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲毒力強，尤其是大螟和二化螟，對初孵幼蟲的防治效果幾乎為百分之百，極個別存活幼蟲也基本上停止發(fā)育，3天后幼蟲基本仍處于初孵狀態(tài)，且已停止發(fā)育，使得轉(zhuǎn)基因植物大體上只受到輕微損傷。
[0069]2、內(nèi)因防治?，F(xiàn)有技術(shù)主要是通過外部作用即外因來控制昆蟲害蟲的為害，如農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治；而本發(fā)明是通過植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死大螟和二化螟的CrylCa蛋白和CrylA蛋白來控制害蟲的，即通過內(nèi)因來防治。
[0070]3、無污染、無殘留。現(xiàn)有技術(shù)使用的化學(xué)防治方法雖然對控制害蟲的為害起到了一定作用，但同時也對人、畜和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)帶來了污染、破壞和殘留；使用本發(fā)明控制害蟲的構(gòu)建體及其方法，可以消除上述不良后果。
[0071]4、全生育期防治?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制害蟲的方法都是階段性的，而本發(fā)明是對植物進行全生育期的保護，轉(zhuǎn)基因植物(CrylCa蛋白和CrylA蛋白)從發(fā)芽、生長，一直到開花、結(jié)果，都可以避免遭受害蟲的侵害。
[0072]5、全植株防治?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制害蟲的方法大多是局部性的，如葉面噴施；而本發(fā)明是對整個植株進行保護，如轉(zhuǎn)基因植物(CrylCa蛋白和CrylA蛋白)的葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲等都是可以抵抗害蟲侵害的。
[0073]6、效果穩(wěn)定?，F(xiàn)有技術(shù)使用的生物殺蟲劑需要直接噴施到作物表面，因此造成有活性的結(jié)晶蛋白(包括CrylCa蛋白和CrylA蛋白)在環(huán)境中被降解；本發(fā)明是使所述CrylCa蛋白和CrylA蛋白在植物體內(nèi)進行表達，有效地避免了生物殺蟲劑在自然界不穩(wěn)定的缺陷，且本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物(CrylCa蛋白和CrylA蛋白)的防治效果在不同地點、不同時間、不同遺傳背景也都是穩(wěn)定一致的。
[0074]7、簡單、方便、經(jīng)濟?，F(xiàn)有技術(shù)使用的生物殺蟲劑在環(huán)境中易被降解，因此需要重復(fù)生產(chǎn)和重復(fù)應(yīng)用，并為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實際應(yīng)用帶來困難，大大地增加了成本；本發(fā)明只需種植能夠表達CrylCa蛋白和CrylA蛋白的轉(zhuǎn)基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財力。
[0075]下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0076]圖1為本發(fā)明控制害蟲的構(gòu)建體及其方法的重組克隆載體DBN01-T構(gòu)建流程圖；
[0077]圖2為本發(fā)明控制害蟲的構(gòu)建體及其方法的重組表達載體DBN100323構(gòu)建流程圖；
[0078]圖3為本發(fā)明控制害蟲的構(gòu)建體及其方法的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種大螟的抗蟲效果圖；
[0079]圖4為本發(fā)明控制害蟲的構(gòu)建體及其方法的轉(zhuǎn)基因水稻植株接種大螟的抗蟲效果圖；
[0080]圖5為本發(fā)明控制害蟲的構(gòu)建體及其方法的轉(zhuǎn)基因水稻植株接種二化螟的抗蟲效果圖。
【具體實施方式】
[0081]下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明控制害蟲的構(gòu)建體及其方法的技術(shù)方案。
[0082]第一實施例、CrylCa基因和CrylAb/Ac基因的獲得和合成
[0083]1、獲得CrylCa和CrylAb/Ac核苷酸序列
[0084]CrylCa殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(630個氨基酸)，如序列表中SEQ ID N0:1所示；編碼相應(yīng)于所述CrylCa殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(630個氨基酸)的CrylCa-ΟΙ核苷酸序列(1896個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO: 3所示，CrylCa_02核苷酸序列(1896個核苷酸)如序列表中SEQ ID N0:4所示。
[0085]CrylAb/Ac殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(609個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；編碼相應(yīng)于所述Cry lAb/Ac殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(609個氨基酸)的Cry lAb/Ac核苷酸序列(1830個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:5所示。
[0086]2、合成上述核苷酸序列
[0087]所述CrylCa-ΟΙ核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:3所示)、所述CrylCa-02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 4所示)和所述Cry lAb/Ac核苷酸序列(如序列表中SEQ IDN0:5所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述CrylCa-ΟΙ核苷酸序列(SEQID NO: 3)的5’端還連接有Spel酶切位點，所述CrylCa-ΟΙ核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)的3’端還連接有Pvul酶切位點；合成的所述CrylCa-02核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的5’端還連接有Spel酶切位點，所述CrylCa-02核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的3’端還連接有Pvul酶切位點；合成的所述Cry lAb/Ac核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的5’端還連接有Ncol酶切位點，所述Cry lAb/Ac核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的3’端還連接有ΚρηΙ酶切位點。
[0088]第二實施例、重組表達載體的構(gòu)建及重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0089]1、構(gòu)建含有CrylCa基因和Cry lAb/Ac基因的重組克隆載體
[0090]將合成的CrylCa-ΟΙ核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；CrylCa-01為CrylCa-01核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) ；MCS為多克隆位點)。
[0091]然后將重組克隆載體DBN01-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其熱激條件為:50 μ 1大腸桿菌ΤΙ感受態(tài)細胞、10 μ 1質(zhì)粒DNA (重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；冰浴細胞1_2分鐘；37°C在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中振蕩培養(yǎng)1小時(lOOrprn轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG (異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal (5-溴-4-氯-3- Π引哚-β _D_半乳糖苷)的氨節(jié)青霉素(100毫克/升)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin,去上清液，沉淀菌體用100 μ 1冰預(yù)冷的溶液I (25mM Tris-HCl,10mM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸??；加入200 μ 1新配制的溶液II (0.2Μ NaOH, 1%SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒5次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ 1冰冷的溶液III (3Μ醋酸鉀，5Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速·12000rpm條件下離心5min,取適量上清，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min,棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入30 μ 1含RNase (20 μ g/ml)的TE (10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH8.0)溶解沉淀；于溫度 37°C下水浴 30min，消化 RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0092]提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoRV和Smal酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述CrylCa-ΟΙ核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，即CrylCa-ΟΙ核苷酸序列正確插入。
[0093]按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylCa-02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，CrylCa-02為CrylCa-02核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN02-T中所述CrylCa-02核苷酸序列正確插入。
[0094]按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述Cry lAb/Ac核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，Cry lAb/Ac為Cry lAb/Ac核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN03-T中所述Cry lAb/Ac核苷酸序列正確插入。
[0095]2、構(gòu)建含有CrylCa基因和Cry lAb/Ac基因的重組表達載體
[0096]用限制性內(nèi)切酶Spel和Pvul分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達載體DBNBC-01 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的CrylCa-ΟΙ核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-01的Spel和Pvul位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達載體DBN100323，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID N0:6)；CrylCa-01:CrylCa-01核苷酸序列(SEQ ID N0:3) ；Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQID NO: 7) ；PM1:磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO:8) ；LB:左邊界)。
[0097]將重組表達載體DBN100323用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，其熱激條件為:50μ 1大腸桿菌Τ1感受態(tài)細胞、10 μ 1質(zhì)粒DNA (重組表達載體DBN100323)，42°C水浴30秒；冰浴細胞1-2分鐘；37°C在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1小時(lOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L,卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRV和Smal酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達載體DBN100323在Spel和Pvul位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列，即CrylCa-ΟΙ核苷酸序列。 [0098]按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100323的方法，將Spel和Pvul酶切重組克隆載體DBN02-T切下的所述CrylCa-02核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100060。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100060含有序列表中SEQ ID N0:4所示核苷酸序列，即CrylCa-02核苷酸序列，所述CrylCa-02核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0099]按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100323的方法，將Ncol和ΚρηΙ酶切重組克隆載體DBN03-T切下的所述Cry lAb/Ac核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100056。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100056含有序列表中SEQ ID N0:5所示核苷酸序列，即Cry lAb/Ac核苷酸序列，所述Cry lAb/Ac核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0100]按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100323的方法，將Spel和Pvul、Ncol和ΚρηΙ分別酶切重組克隆載體DBN01-T和DBN03-T切下的所述CrylCa-ΟΙ核苷酸序列和CrylAb/Ac核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100062。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100062含有序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，SPCrylCa-01核苷酸序列和Cry lAb/Ac核苷酸序列，所述CrylCa-01核苷酸序列和Cry lAb/Ac核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0101]3、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0102]對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達載體DBN100323、DBN100060、DBN100056和DBN100062用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404 (Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為:100μ L農(nóng)桿菌LBA4404、3y L質(zhì)粒DNA(重組表達載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Ahdl和EcoRV對重組表達載體DBN100323、DBN100060、DBN100056和DBN100062酶切后進行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100323、DBN100060、DBN100056和DBN100062結(jié)構(gòu)完全正確。
[0103]第三實施例、轉(zhuǎn)入CrylCa-ΟΙ和Cry lAb/Ac基因的玉米植株的獲得及驗證
[0104]1、獲得轉(zhuǎn)入CrylCa-ΟΙ和CrylAb/Ac基因的玉米植株
[0105]按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實施例中3所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實施例中2構(gòu)建的重組表達載體DBN100323、DBN100060、DBN100056 和 DBN100062 中的 T-DNA (包括玉米 Ubiquitin 基因的啟動子序列、CrylCa-ΟΙ核苷酸序列、CrylCa-02核苷酸序列、Cry lAb/Ac核苷酸序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入CrylCa-ΟΙ核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylCa-02核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Cry lAb/Ac核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入Cry 1 Ca-01 -CrylAb/Ac核苷酸序列的玉米植株；同時以野生型玉米植株作為對照。 [0106]對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)rylCa-ΟΙ核苷酸序列、CrylCa-02核苷酸序列和/或Cry lAb/Ac核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個細胞(步驟1:侵染步驟)，在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(0D660=0.4-0.6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS) 40mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)lmg/L，pH5.3))中以啟動接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖 20g/L、葡萄糖 10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個選擇性的“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L,pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3:恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5:再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。
[0107]篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。
[0108]2、用TaqMan驗證轉(zhuǎn)入CrylCa和CrylAb/Ac基因的玉米植株
[0109]分別取轉(zhuǎn)入CrylCa-ΟΙ核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylCa-02核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Cry lAb/Ac核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入Cry lCa_01-Cry lAb/Ac核苷酸序列的玉米植株的葉片約lOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測CrylCa基因和Cry lAb/Ac基因的拷貝數(shù)。同時以野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
[0110]檢測CrylCa基因和Cry lAb/Ac基因拷貝數(shù)的具體方法如下:
[0111]步驟11、分別取轉(zhuǎn)入CrylCa-οι核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylCa-02核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Cry lAb/Ac核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Cry lCa_01-Cry lAb/Ac核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；
[0112]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0113]步驟13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0114]步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ 1 ；
[0115]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0116]以下引物和探針用來檢測CrylCa-ΟΙ核苷酸序列:
[0117]引物1 (CF 1):CAGGACTGGATCACCTATAATCGG 如序列表中 SEQ ID NO:9 所示；
[0118]引物2 (CR1):AAAGAACGCGGCAATGTCC 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
[0119]探針1 (CPI):CAGGCGCGATCTTACTTTGACGGTCC 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；
[0120]以下引物和探針用來檢測CrylCa-02核苷酸序列:
[0121]引物3 (CF2):CAAGGAATGGGAAGAAGATCCTAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
[0122]引物4 (CR2):TTCAAGAAGTCCATCAAGGATACG 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
[0123]探針2 (CP2):CCAGCAACCAGGACCAGAGTGATCGATAG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；
[0124]以下引物和探針用來檢測Cry lAb/Ac核苷酸序列:
[0125]引物5 (CF3):TGCGTATTCAATTCAACGACATG 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；
[0126]引物6 (CR3):CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
[0127]探針3 (CP3):CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC 如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示；
[0128]PCR反應(yīng)體系為:
[0129]
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建體，其特征在于，包括CrylCa蛋白和CrylA蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體包括第一表達盒和第二表達盒，所述第一表達盒包括CrylCa蛋白，所述第二表達盒包括CrylA蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述構(gòu)建體,其特征在于,所述第一表達盒還包括與CrylCa蛋白有效連接的調(diào)控序列，所述第二表達盒還包括與CrylA蛋白有效連接的調(diào)控序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述構(gòu)建體，其特征在于，所述CrylCa蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述構(gòu)建體，其特征在于，所述CrylCa蛋白的核苷酸序列具有SEQID N0:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述構(gòu)建體,其特征在于,所述CrylA蛋白為CrylAb/Ac蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述構(gòu)建體，其特征在于，所述CrylAb/Ac蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述構(gòu)建體，其特征在于，所述CrylAb/Ac蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
9.一種包含權(quán)利要求1-8任一項所述構(gòu)建體的重組載體。
10.一種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括: 獲得包含權(quán)利 要求1-8任一項所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞； 在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞； 回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因宿主生物包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大S.、棉花、水稻或小麥。
13.一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1-8任一項所述構(gòu)建體編碼的殺蟲蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于權(quán)利要求1-8任一項所述構(gòu)建體編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第三種殺蟲核苷酸一起表達。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第三種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α _淀粉酶或過氧化物酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第三種殺蟲核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
16.—種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1-8任一項所述構(gòu)建體或權(quán)利要求9所述重組載體導(dǎo)入植物。
17.一種用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1-8任一項所述構(gòu)建體或權(quán)利要求9所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。
18.—種控制昆蟲害蟲的方法,其特征在于,包括:使昆蟲害蟲與抑制量的權(quán)利要求1-8任一項所述構(gòu)建體編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)接觸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述CrylCa蛋白和所述CrylAb/Ac蛋白存在于產(chǎn)生其的植物細胞中，所述昆蟲害蟲通過攝食所述植物細胞與所述CrylCa蛋白和所述CrylAb/Ac蛋白接觸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述CrylCa蛋白和所述CrylAb/Ac蛋白存在于產(chǎn)生其的轉(zhuǎn)基因植物中，所述昆蟲害蟲通過攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述CrylCa蛋白和所述CrylAb/Ac蛋白接觸，接觸后所述昆蟲害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以實現(xiàn)對昆蟲害蟲為害植物的控制。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述對昆蟲害蟲為害植物的控制不因種植地點的改變而改變。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述對昆蟲害蟲為害植物的控制不因種植時間的改變而改變。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24任一項所述的控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述植物可以來自玉米、水稻、高粱、麥、粟、棉花、蘆葦、甘蔗、茭白、蠶豆或油菜。
26.根據(jù)權(quán)利要求19-25任一項所述的控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylCa蛋白和所述CrylAb/Ac蛋白的多核苷酸的植物。
27.根據(jù)權(quán)利要求18-26任一項所述控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述昆蟲害蟲為鱗翅目昆蟲害蟲。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述鱗翅目昆蟲害蟲為大螟和/或二化螟。
29.一種權(quán)利要求1-8任一項所述構(gòu)建體編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)控制昆蟲害蟲的用途。
【文檔編號】C12N15/63GK103725704SQ201410023313
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】韓超, 龐潔, 丁德榮, 李勝兵, 岳健婷 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司生物技術(shù)中心