一種耐鹽并具有低溫生物脫氮功能的施氏假單胞菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領域，具體涉及一種具有低溫脫硝生物學活性的細菌，其特征是：它是施氏假單胞菌DN-3，拉丁名：Pseudomonas?stutzeri。其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC?No.8291，保藏時間：2013年10月08日。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)該細菌的方法，以該菌為主要組成成分的生物脫硝劑的制備，及其在水體氮素降解中的應用。
【專利說明】一種耐鹽并具有低溫生物脫氮功能的施氏假單胞菌
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領域，具體涉及一種具有低溫脫硝生物學活性的細菌，培養(yǎng)該細菌的方法，以該菌為主要組成成分的生物脫硝劑的制備，及其在水體氮素降解中的應用。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著氮肥的使用及高密度水產養(yǎng)殖的發(fā)展，帶來巨大經濟效益，但同時也造成了嚴重的環(huán)境問題。因氮磷元素含量過高而造成的富營養(yǎng)化情況在水產養(yǎng)殖中頻繁出現，導致水質惡化及生物平衡遭到破壞外，其中的氨氮和亞硝態(tài)氮對養(yǎng)殖動物還具有較強毒性，特別是亞硝態(tài)氮，其在養(yǎng)殖條件下轉化速率過低使得水體中的亞硝酸鹽積累量過高，尤其是大雨過后，亞硝酸鹽含量極其容易超標，由此造成的水產養(yǎng)殖動物病害甚至死亡現象已多見報道。如在對蝦養(yǎng)殖中，亞硝酸鹽含量超過0.1ppm達到0.3ppm以上時，很容易造成對蝦中毒，且不易搶救。傳統(tǒng)上采用活性污泥直接投入，后又采用固定化光合細菌進行脫氮處理。人們曾利用硝化菌群除氮，但是硝化作用的最終產物是硝酸鹽，會破壞生物圈氮素的平衡且該產物能誘發(fā)人類的高鐵血紅蛋白癥。由于在魚蝦養(yǎng)殖過程中必須充氧來保證水中的溶解氧量，那么厭氧反硝化細菌的脫氮作用也不能得到充分發(fā)揮。因此，人們將注意力轉移到好氧反硝化細菌，因為其可以在有氧條件下進行反硝化將硝酸鹽和亞硝酸鹽轉化成氣態(tài)氮，與傳統(tǒng)的生物脫氮工藝相比，好氧反硝化細菌的出現可以使生物脫氮在同一反應器中完成，實現真正意義上的同步硝化反硝化。目前關于利用好氧反硝化細菌實現的生物脫氮已經有成功應用的報道。利用好氧反硝化細菌發(fā)展好氧脫氮技術具有以下幾個優(yōu)點:第一、使硝化-反硝化反應在同一個反應器中進行，可以大大減少占地面積和建設資金；第二、使用好氧反硝化細菌可以減少處理過程中加入調節(jié)系統(tǒng)PH的化學物質，降低成本；第三、在處理過程中好氧反硝化細菌更容易控制。
[0003]目前已報道的好氧反硝化細菌大多存在亞硝態(tài)氮的脫除能力不強，溫度對脫除效率影響大(25°C以下脫除效率`不高)，缺乏對高濃度的亞硝酸鹽的耐受性，菌株在高鹽度水體中脫氮活性低，處理時間過長，效率不高等問題。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明公開了一株具有低溫脫氮生物活性細菌，該細菌具有較高的反硝化活性和單株亞硝態(tài)氮脫除能力。這類菌株是好氧反硝化細菌，在低溫條件下即能有效地將no2_-n直接轉化成菌體的自身組成物質，也能將NO2--N通過反硝化作用轉化為各種氮元素的氣體形式如NO，N2O和N2等逸出。更具體地，這類細菌是施氏假單胞菌DN-3，分類命名:施氏假單胞菌，拉丁名:Pseudomonas stutzeri。其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.8291，保藏時間:2013年10月08日，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0005]本發(fā)明以現有的常溫脫硝菌施氏假單胞菌DN-2 (保藏號:CGMCC N0.2917)為原始菌，經長期反復低溫馴化、活性檢驗，獲得了具有低溫脫硝活性的菌株DN-3。具體地，對常溫脫硝菌在18°C的溫度下進行低溫馴化，每一階段馴化后的細菌都進行脫亞硝態(tài)氮活性的測定。
[0006]本發(fā)明的施氏假單胞菌DN-3可以在15~30°C、90~150r/min的搖瓶轉速、ρΗ7.0 ~10.0 的條件下，在每升含 0.5 ~4.0g NaNO2, 2 ~IOg CH3COONa, 0.01 ~0.05gMgSO4,0.01 ~0.05gMnS04,0.01 ~0.05g FeSO4,0.5 ~1.0g K2HPO4,0.1 ~0.5g NaH2PO4 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0007]更優(yōu)選的培養(yǎng)條件是:施氏假單胞菌DN-3在30°C、120r/min的搖瓶轉速、pH8.5條件下，在每升含 0.5g NaNO2, 5g CH3C00Na,0.03g MgSO4,0.01g MnSO4,0.01g FeSO4,0.75gK2HPO4,0.25g NaH2PO4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0008]本發(fā)明公開了一種大規(guī)模高密度培養(yǎng)施氏假單胞菌DN-3的方法:在30°C，80~120r/min的攪拌轉速，0.04~0.06vvm的通氣量，3~6%的接菌量，初始pH8.5的條件下發(fā)酵罐培養(yǎng)細菌。優(yōu)選的方法為在30°C、100r/min的攪拌轉速、0.05vvm的通氣量、5%的接菌量，初始PH8.5的條件下發(fā)酵罐培養(yǎng)細菌。
[0009]本發(fā)明的施氏假單胞菌DN-3是具有出色的亞硝態(tài)氮脫除能力的細菌，在常規(guī)的生長條件下就可表現出反硝化活性，在合適的PH值、溫度、唯一碳源、C/N比等組合培養(yǎng)條件下，施氏假單胞菌DN-3能體現更強的亞硝態(tài)氮脫除能力。
[0010]施氏假單胞菌DN-3的培養(yǎng)及亞硝態(tài)氮還原活性:
[0011]好氧反硝化細菌為異養(yǎng)菌，因此在培養(yǎng)過程中須添加有機碳源才能正常生長和進行反硝化作用。在反硝化培養(yǎng)基中，分別以5.0g/L乙酸鈉、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉為唯一碳源，0.5g/L NaNO2為唯一氮源時，30°C，120rpm搖床培養(yǎng)12h后，萘乙二胺法定量測定殘余Ν02_-Ν的濃度，考查其對還原活性的影響，見表1。
[0012]表1不同碳源培養(yǎng)時的Ν02_-Ν還原率(12h)
【權利要求】
1.一種施氏假單胞菌，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是:CGMCC N0.8291。
2.一種培養(yǎng)權利要求1的施氏假單胞菌的方法，包括:在15~30°C，90~150rpm的搖瓶轉速，ρΗ7.0~10.0條件下，在每升含0.5~4.0g NaNO2,2~IOg CH3COONa^0.01~0.05g MgS04、0.01 ~0.05g MnS04、0.01 ~0.05g FeS04、0.5 ~1.0g K2HPO4 和 0.I ~0.5gNaH2PO4的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
3.權利要求2的方法，包括:在30°C,120rpm的搖瓶轉速，pH8.5的條件下，在每升含0.5g NaNO2,5g CH3COONa^0.03g MgS04、0.01g MnS04、0.01g FeS04、0.75g K2HPO4 和 0.25gNaH2PO4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
4.一種規(guī)?；囵B(yǎng)權利要求1的施氏假單胞菌的方法，包括:在30°C,80~120r/min的攪拌轉速，0.04~0.06vvm的通氣量，3~6%的接菌量，初始pH8.5的條件下，發(fā)酵罐培養(yǎng)細菌，所述百分比為重量百分比。
5.權利要求4的方法，包括:在30°C、100r/min的攪拌轉速、0.05vvm的通氣量、5%的接菌量、初始PH8.5的條件下發(fā)酵罐培養(yǎng)細菌。
6.權利要求1的施氏假單胞菌在脫除水體中的亞硝態(tài)氮中的應用。
7.一種脫除水體中的亞硝態(tài)氮的方法，包括:將權利要求1的施氏假單胞菌培養(yǎng)后，懸浮于脫脂牛奶并凍干，將凍干粉直接投入水體，在自然環(huán)境PH7~9，培養(yǎng)3~4天后，即可脫除水體的亞硝態(tài)氮。
8.權利要求7的方法:包括將權利要求1的施氏假單胞菌培養(yǎng)后，懸浮于脫脂牛奶并凍干，將凍干粉直接投入水體，菌體的投入量為IO5~106CFU/m3，在自然環(huán)境pH7~9，溫度15~20°C，培養(yǎng)3~4天后，即`可脫除水體體的亞硝態(tài)氮。
【文檔編號】C12N1/20GK103773723SQ201410022561
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權日:2014年1月17日
【發(fā)明者】周長林, 賈源賓, 張寧 申請人:南京曜動節(jié)能環(huán)?？萍加邢薰?br>