一株高溫纖維素降解菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高溫纖維素降解菌及其應用。本發(fā)明所提供的耐高溫纖維素降解菌，能在60-80℃溫度范圍內(nèi)生長，且在70℃時生長最快；具有穩(wěn)定的纖維素降解功能，能較快的適應高溫堆肥環(huán)境，快速降解纖維素等難降解有機物，加快堆肥腐熟進程。利用由該菌株制備得到的固態(tài)菌劑對園林廢棄物進行堆肥相對于未接種的纖維素總降解率提高了42.2%，具有成本低、性能好等優(yōu)點。
【專利說明】一株高溫纖維素降解菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領域，具體涉及一株能在70°C快速增長的纖維素降解菌及其在園林廢棄物高溫堆肥中的應用。
【背景技術】
[0002]堆肥化是實現(xiàn)有機廢物無害化、減量化和資源化的常用技術之一。目前堆肥仍存在發(fā)酵周期長、有機物質(zhì)降解不完全、物料穩(wěn)定度程度和腐熟度低的問題。為此，人們將從環(huán)境中分離出高溫菌、中溫菌、放線菌以及真菌等制成接種劑并應用于堆肥體系中，以達到縮短堆肥發(fā)酵時間、提高堆肥腐熟度等目的。園林廢棄物包括枯枝落葉、草坪修剪物、雜草和殘花等，是常見的堆肥物料，纖維素是其主要成分。由于纖維素本身結構致密而不易降解，導致其難以被微生物加以利用，因此，提高纖維素的降解程度有助于解決園林廢棄物堆肥存在的上述問題。
[0003]堆肥過程中纖維素降解主要發(fā)生在高溫階段，然而，目前高溫好氧堆肥過程中接種的微生物菌劑主要成分為中溫菌。隨著堆肥溫度升高，堆體中微生物的種類和數(shù)量逐步減少，接種的嗜溫性微生物的活性也大大降低，這無疑限制了纖維素的快速降解。高溫菌是一類在高溫條件下仍能生長并可以保持生物降解活性的微生物菌群，接種高溫菌，特別是以其制成的纖維素降解菌劑，可以加快堆肥中纖維素的分解，從而提高堆肥效率。最近，耐高溫纖維素降解菌的篩選已成為促進堆肥技術發(fā)展的主要議題之一。張楠等(2010)從牛糞堆肥中分離出6株能降解纖維素的高溫細菌，其中活性最高的為一株枯草芽孢桿菌。薛橋麗等(2012)從堆肥中分離獲得20株耐高溫纖維素分解菌，其產(chǎn)生的纖維素分解酶在50°C具有良好的熱穩(wěn)定性，但隨著溫度增加，熱穩(wěn)定性呈下降趨勢。
[0004]地芽孢桿菌屬{Genus Geobacillus)是一類在表型特征上相似、系統(tǒng)發(fā)育上相近的耐高溫菌群，多數(shù)能夠在55°C以上的高溫中生長。利用具有高溫降解纖維素功能的地芽孢桿菌，并將其作為接種劑應用于有機廢物的堆肥化處理過程中，將有助于彌補堆肥高溫期土著菌纖維素降解能力的不足，同時也可以促進其他有機物的降解，從而加快堆肥腐熟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種具有耐高溫、高效降解纖維素特性的地芽孢桿菌，并將其作為微生物接種劑應用于高溫堆肥體系中。
[0006]本發(fā)明的高溫纖維素降解菌(feo如ci77i/5.kaustophilus.HCDM5),是從園林廢棄物高溫堆肥樣品中分離篩選得到的一株能夠在70°C條件下，降解纖維素的地芽孢桿菌菌株，于2013年11月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC NO:8441o
[0007]本發(fā)明菌株性質(zhì)如下:
菌株具有纖維素降解酶活性，在有輔助碳源存在下可降解纖維素?？稍?0-85°C溫度范圍內(nèi)生長，生長pH值范圍為5.5-8.0，最適pH為6.5，在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h后，其菌落特征是:淡黃色，圓形，直徑約2 mm，表面干燥，中央稍突起，不透明，邊緣完整。其菌體細胞特征為:桿菌，長度約2-3 革蘭氏染色呈陽性。利用引物為(27f):5' -AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3' (SEQ ID ^:1^^(1492^0:5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3/ (SEQ ID NO: 2)經(jīng)PCR擴增該菌株的 16S rRNA基因序列(SEQ ID NO: 3)，經(jīng)與EzTaxon數(shù)據(jù)庫((http://www.eztaxon.0rg/))比對，結果顯不與種 Geobacillus kaustophilusNCIMB8547 (T)的同源性最高，為99.43%。綜上性質(zhì)及特性，將該菌株鑒定為Geobacilluskaus tophiIus,GeobaciIlus kaus tophiIus.HCDM5。
[0008]利用該菌株制備固態(tài)菌劑的方法是:
(1)斜面活化:取菌種斜面，在65-75°C下活化培養(yǎng)16-32h ；
(2)制備種子液:將步驟(1)已活化的菌接種至1-2L的無菌LB液體培養(yǎng)基中，在水浴搖床上以60-70°C溫度、50-200 rpm轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)24-36 h得種子液；
(3)發(fā)酵種子液的制備:取步驟(2)中種子液按5%-20%(v/v)的接種量接種至已滅菌的發(fā)酵罐中，進行擴大發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度為60-70°C，轉(zhuǎn)速為100-200 rpm，培養(yǎng)時間 36-60 h ；
(4)制備固體菌劑:將麥麩與玉米面混合后，接種上述發(fā)酵種子液，接種量為培養(yǎng)基總重量的0.5%-3.5%，調(diào)節(jié)含水率至45%-55%范圍內(nèi)，自然堆置一至兩周后，將堆體攤開陳化使含水率下降至30%以下，即得固態(tài)菌劑。
[0009]利用上述制備得到的固態(tài)菌劑進行堆肥，方法如下:
將上述制備的固體菌劑按干重比5%-10%與堆肥主料即園林廢棄物混合，并添加適量的新鮮雞糞作為輔料，使得混合物料碳氮比為25-35:1、含水率55-60%，即可開始高溫堆肥過程。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明所提供的耐高溫纖維素降解菌，能在60-80°C溫度范圍內(nèi)生長，且在70°C時生長最快；具有穩(wěn)定的纖維素降解功能，能較快的適應高溫堆肥環(huán)境，快速降解纖維素等難降解有機物，加快堆肥腐熟進程。同時，以有機廢物作為本發(fā)明菌株的載體，具有成本低、性能好等優(yōu)點。接種了本發(fā)明所提供的固態(tài)微生物接種劑的堆肥相對于未接種的纖維素總降解率提高了 42.2%，堆肥高溫期(≥50°C )達到10d，在第7天達到最高溫度67 V，而未接種菌劑的堆肥高溫持續(xù)時間僅為7d，在第8天才達到最高溫度60°C。與未接種菌劑對比，接種微生物菌劑的堆肥提早IOd達到腐熟(發(fā)芽指數(shù)> 80%)，在發(fā)酵30d之后堆肥物料發(fā)芽指數(shù)達到了 85%以上，而未接種堆肥則在發(fā)酵40d以后才達到腐熟。接種后的堆肥比未接種的堆肥從第20d起，發(fā)芽指數(shù)均提高在10%以上，最高達17%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1:堆肥溫度變化曲線；
圖2:堆肥過程中纖維素降解率變化曲線。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。[0013]實施例1:耐高溫纖維素降解菌的篩選與鑒定
稱取10 g高溫期園林廢棄物堆肥樣品置于裝有10粒玻璃珠、盛有90 ml無菌水的錐形瓶中，在200 rpm的搖床上搖30 min，使樣品充分散開，70°C下靜置富集培養(yǎng)12h。用無菌吸管吸取I ml上清液轉(zhuǎn)至赫其遜培養(yǎng)液中，70°C靜置培養(yǎng)約30天。取10 ml馴化液轉(zhuǎn)接至新的赫其遜培養(yǎng)液中，繼續(xù)馴化培養(yǎng)，如此傳代3次。
[0014]上述赫其遜培養(yǎng)基成分為:磷酸二氫鉀1.0g，氯化鈉0.lg，硝酸鈉2.5g，硫酸鎂
0.3g,三氯化鐵0.01g,氯化鈣0.1g,無淀粉濾紙條IOg,去離子水1000ml, pH 7.2。
[0015]分別取馴化后的菌懸液I mL，加入到9 mL無菌水中，以梯度稀釋法制成Κ1，10-2，IO-3,10Λ IO-5, IO-6, IO-7的稀釋度，取0.1mL平板涂布到纖維素-剛果紅培養(yǎng)基上，每個稀釋度做三個平行樣。取ImL的無菌水進行同樣的操作，作為對照處理。在70°C下恒溫培養(yǎng)2天，選擇菌落分散較好、菌落周圍出現(xiàn)明顯降解圈的平板，挑取生長旺盛的單菌落，反復劃線分離純化3次，再將形態(tài)一致的菌落制片，進行簡單染色，在油鏡多視野下觀察菌體細胞形態(tài)，確認菌體形態(tài)一致后，接種至LB斜面培養(yǎng)至豐厚，在4°C下保存，備用。
[0016]菌株在LB平板上的菌落特征是:單菌落為淡黃色，圓形，直徑約2 _，表面干燥，中央稍突起，不透明，邊緣完整。菌體細胞特征為:桿菌，長度約2-3 μ m。革蘭氏染色呈陽性。
[0017]將分離得到的純菌在LB斜面上活化培養(yǎng)12h后，點接于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，在70°C下培養(yǎng)至菌落豐厚，觀察有無降解圈及降解圈的大小，并用游標卡尺測定降解圈直徑(D)和菌落直徑(d)。降 解能力大小按公式Up= (D/d)2來判斷,單位為毫米(mm), Up越大，表示水解能力越大。在降解培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)4代，計算與分析每代菌的Up情況，淘汰降解能力不穩(wěn)定菌株，得到降解能力大且穩(wěn)定的菌株，從中選出Up值較大的10株菌，并編號為 HCDMl- HCDM10。
[0018]上述LB培養(yǎng)基成分為:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，植物凝膠 10g，蒸餾水 1000ml, pH 7.2-7.4。
[0019]上述纖維素剛果紅培養(yǎng)基的配方是:磷酸二氫鉀0.5g，硫酸銨0.25g，羧甲基纖維素鈉1.88g，剛果紅0.2g，明膠2g，瓊脂15g，植物凝膠10g，去離子水1000ml, pH值為7.0。
[0020]將上述操作得到的HCDM1-HCDM10菌株分別接種至纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，70°C培養(yǎng)3d后，取發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，取上清液即為待測粗酶液，用DNS法測定菌株的纖維素酶活性。得到纖維素酶活較高的五株菌HCDM5、HCDM4、HCDM7、HCDM1、HCDM10。
[0021]上述纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:磷酸二氫鉀3g，硫酸銨2g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合硫酸亞鐵0.01g,玉米面2g,麩皮0.5g,蛋白胨5g,碳酸鈣0.5g,去離子水1000ml,pH值為7.0
將HCDM5、HCDM4、HCDM7、HCDMl、HCDM10五株菌分別接種到赫其遜培養(yǎng)液中，用錫箔紙封口，70°C靜置培養(yǎng)14d后，用稀鹽酸與稀硝酸混合液及去離子水反復洗滌濾紙條數(shù)次，于70°C烘至恒重，稱量，計算濾紙條降解率。計算公式如下:
降解率(%)=(濾紙原重-烘干濾紙重量)/濾紙原重X 100
上述赫其遜培養(yǎng)基成分為:磷酸二氫鉀1.0g，氯化鈉0.lg，硝酸鈉2.5g，硫酸鎂0.3g，三氯化鐵0.01g,氯化鈣0.1g,無淀粉濾紙條IOg,去離子水1000ml, pH 7.2。
[0022]纖維素酶活測定結果和濾紙降解率結果見表1。[0023]表1纖維素酶活測定結果和濾紙降解率結果
【權利要求】
1.一株高溫纖維素降解菌，名稱為kaustophilus.HCDM5,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO:8441。
2.權利要求1所述的高溫纖維素降解菌在降解纖維素中的應用。
3.權利要求1所述的高溫纖維素降解菌在制備堆肥中的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述堆肥的主料為園林廢棄物。
5.一種用于降解纖維素的固體菌劑，由權利要求1所述的保藏編號為CGMCC NO:8441的高溫纖維素降解菌制備得到。
6.根據(jù)權利要求5所述的固體菌劑，其特征在于，制備方法如下: (1)斜面活化:取菌種斜面，在65-75°C下活化培養(yǎng)16-32h ； (2)制備種子液:將步驟(1)已活化的菌接種至無菌LB液體培養(yǎng)基中，在水浴搖床上以60-70°C溫度、50-200 rpm轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)24-36 h得種子液； (3)發(fā)酵種子液的制備:取步驟(2)中種子液按5%-20%(v/v)的接種量接種至已滅菌的發(fā)酵罐中，進行擴大發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度為60-70°C，轉(zhuǎn)速為100-200 rpm，培養(yǎng)時間 36-60 h ； (4)制備固體菌劑:將麥麩與玉米面混合后，接種上述發(fā)酵種子液，接種量為培養(yǎng)基總重量的0.5%-3.5%，調(diào)節(jié)含水率至45%-55%范圍內(nèi)，自然堆置一至兩周后，將堆體攤開陳化使含水率下降至30%以下，即得固態(tài)菌劑。
7.權利要求5或6所述的固體菌劑在制作堆肥中應用。
8.根據(jù)權利要求7所述的應`用，其特征在于，所述堆肥的主料為園林廢棄物。
【文檔編號】C12R1/01GK103820361SQ201410018582
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權日:2014年1月15日
【發(fā)明者】于光輝, 翟曉峰, 張英, 嚴建平, 余震, 喻薇, 田軍建, 高強 申請人:深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司