菊屬及近緣屬植物通用ssr分子標記cssr2及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2，用于PCR擴增所述標記CSSR2的引物序列如Seq?ID?No.1和2所示。本發(fā)明還提供了所述SSR標記在菊屬與亞菊屬的屬間雜交種鑒定中的應用。另外，本發(fā)明還提供了擴增所述SSR分子標記的方法，建立了一個在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標記技術體系，該標記可以用于進行菊屬，亞菊屬及太行菊屬屬內(nèi)和屬間的雜種鑒定，植物遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種等，應用前景十分廣闊。
【專利說明】菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2及應用。
【背景技術】
[0002]菊屬(Chrysanthemum)屬于雙子葉植物綱菊科，原產(chǎn)于我國的菊屬植物主要有:野菊(C.1ndicum)、神農(nóng)香菊(C.1ndicum var.aromaticum),毛華菊(C.vestitum)、甘菊(C.1avandulifolium)> 小紅菊(C.chanetii )、紫花野菊(C.zawadskii )、菊花腦(C.mankingense)等。其中，菊花(Chrysanthemum morrofolium)是觀賞價值最高的種，菊花是中國十大名花和世界四大切花之一，在中國有三千多年的栽培歷史，形成了花型豐富、花色多樣的品種群。除觀賞價值外，菊屬植物還有很高的藥用價值和食用價值等。菊花含有水蘇堿、刺槐甙、木樨草甙、大波斯菊甙、腺膘呤、膽堿、葡萄糖甙等成分，尤其富含揮發(fā)油，并且油中主要為菊酮、龍腦、龍腦已酸酯等物質。功效作用方面，菊花具有平肝明目、散風清熱、消咳止痛的功效，用于治療頭痛眩暈、目赤腫痛、風熱感冒、咳嗽等病癥效果顯著。
[0003]亞菊屬(Ajania),屬于雙子葉植物綱菊科，主要分布于我國除東南半壁以外的廣大地區(qū)。蒙古、蘇聯(lián)及朝鮮北部和阿富汗北部也有少數(shù)種。亞菊屬的野生種磯菊(A.acificum)，原產(chǎn)于我國臺灣和日本，已經(jīng)較為廣泛的應用于我國東南沿海以及日本、荷蘭等國的園林中， 作為地被以及盆栽植物栽培。其葉片光亮革質具有較高的觀賞價值。菊花育種工作者也把磯菊作為親本和菊屬植物進行雜交育種，以提高菊花的枝葉觀賞性。
[0004]太行菊屬(Opisthopappus),菊科,包括太行菊(0.taihangensis)和長裂太行菊(0.1ongilobus)兩種，主要分布于我國山西、河北、河南等地，植株匍匐生長，多生于陡坡，峭壁的巖石縫隙中，耐瘠薄，耐寒以及耐旱性強，已成為園藝工作者的重要育種材料。
[0005]亞菊屬和太行菊屬作為菊屬的近緣屬，已成為新的種質資源被菊花育種工作者用來與菊花進行遠緣雜交，以提高現(xiàn)有菊花品種群的抗性和觀賞性。
[0006]簡單重復序列(simplesequence repeat, SSR),也稱微衛(wèi)星 DNA(microsatellite),是一種由2~5個核苷酸為單位多次串聯(lián)重復的長達幾十甚至幾百個核苷酸的序列。這些序列廣泛存在于真核生物基因組的不同座位上，每個座位重復單位的數(shù)量可能不完全相同，因而形成多態(tài)性。由于其具有多態(tài)性豐富、重復性高、共顯性遺傳等優(yōu)點，被廣泛應用于植物的群體和進化遺傳研究、種質資源遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建等領域。
[0007]然而，目前菊花的SSR標記開發(fā)處于起步階段，亞菊屬(Ajania)和太行菊屬(Opisthopappus)由于缺乏基因序列信息，尚未發(fā)現(xiàn)SSR標記開發(fā)相關研究的報導；因此目前亞菊屬(Ajania)和太行菊屬(Opisthopappus)還沒有SSR分子標記被開發(fā)出來,也沒有能夠用于菊屬以及近緣屬之間通用的SSR標記；因此，開發(fā)菊屬、亞菊屬和太行菊屬微衛(wèi)星標記，對于菊屬，亞菊屬和太行菊屬的野生資源的開發(fā)利用，開展屬間遠緣雜交育種以及分子水平研究具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2及應用。
[0009]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2，用于PCR擴增分子標記CSSR2的引物對為:
[0010]上游引物:5’-TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3’和
[0011]下游引物:5’-CACATAACCACCACTACCACCA-3’。
[0012]本發(fā)明中涉及的近緣屬植物包括但不限于菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania)、太行菊屬(Opisthopappus)等。
[0013]本發(fā)明還提供所述分子標記在菊屬及近緣屬植物屬內(nèi)或屬間雜種鑒定、植物材料遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建及分子標記輔助育種等方面的應用。
[0014]本發(fā)明進一步提供一種鑒定菊屬及近緣屬植物品種的方法，包括以下步驟:
[0015]I)提取待測植物的基因組DNA ；
[0016]2)以待測植物的基因組DNA為模板，利用上述用于PCR擴增分子標記CSSR2的引物對進行PCR擴增；
[0017]3 )檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0018]步驟2)中PCR反應體系為:引物各0.32 μ Μ/μ L，Taq DNA聚合酶0.2U/μ L，dNTP0.4 μ M/ μ L, Mg2+0.65 μ M/ μ L,模板 DNA2 ~4ng/ μ L，以 ddH20 配制。
[0019]步驟2)中 PCR 擴增程序為-MV 5min ；94°C 0.5min，50 ~62°C 0.5min，72°C lmin,共 30 個循環(huán)；72°C 5min。優(yōu)選地，PCR 擴增程序為-MV 5min ；94°C 0.5min,58°C 0.5min,72 °C lmin，共 30 個循環(huán)；72°C 5min。
[0020]本發(fā)明首次提供一種在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標記一CSSR2。本發(fā)明還提供了該SSR標記在菊屬與亞菊屬的屬間雜交種鑒定中的應用。另外，本發(fā)明還提供了擴增該SSR位點的引物序列和擴增方法，建立了一個在菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料之間通用的SSR分子標記技術體系，該標記可以用于進行菊屬，亞菊屬及太行菊屬屬內(nèi)和屬間的雜種鑒定，植物遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種等，應用前景十分廣闊。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明CSSR2位點的SSR引物擴增的菊屬、亞菊屬及太行菊屬植物材料基因組DNA的STR分型圖；其中，I~28分別對應表1中列出的菊屬、亞菊屬及太行菊屬的28種植物材料，橫坐標代表擴增產(chǎn)物大小，縱坐標代表擴增強度。
[0022]圖2為亞菊屬野生種磯菊(母本)，菊屬地被菊品種“鋪地淡粉”(父本)，及其雜交后代 AP1、AP2、AP3。
【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于說明 本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。[0024]實施例1菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2的獲得
[0025](I)在美國國家生物技術信息中心(NCBI)網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Genbank/)下載網(wǎng)站上截至2012年4月公布的所有菊屬植物的7180個EST序列，應用CAP3軟件進行拼接處理，得到拼接基因序列。然后利用SSRIT軟件(http://www.gramene.0rg/db/markers/ssrtool)進行SSR位點搜索,然后利用Primer Premier5.0軟件進行SSR位點上、下游引物的設計。
[0026]其中擴增所述分子標記CSSRl和CSSR2的引物為如下引物對:
[0027]CSSR2 上游引物 F: 5’ -TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3’
[0028]CSSR2 下游引物 R: 5，-CACATAACCACCACTACCACCA-3’
[0029](2)提取了菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania),太行菊屬(Opisthopappus)的常見植物材料的DNA樣品(見表1)。
[0030]表1菊屬、亞菊屬和太行菊屬的植物材料
[0031]
【權利要求】
1.菊屬及近緣屬植物通用SSR分子標記CSSR2，其特征在于，用于PCR擴增分子標記CSSR2的引物對為: 上游引物:5，-TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3，和 下游引物:5’-CACATAACCACCACTACCACCA-3’。
2.根據(jù)權利要求1所述的分子標記，其特征在于，所述近緣屬植物包括但不限于菊屬(Chrysanthemum)、亞菊屬(Ajania)、太行菊屬(Opisthopappus)。
3.權利要求1或2所述分子標記在菊屬及近緣屬植物屬內(nèi)或屬間雜種鑒定、植物材料遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建及分子標記輔助育種中的應用。
4.一種鑒定菊屬及近緣屬植物品種的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取待測植物的基因組DNA； 2)以待測植物的基因組DNA為模板，利用權利要求1所述的用于PCR擴增分子標記CSSR2的引物對進行PCR擴增； 3)檢測PCR擴增產(chǎn)物。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR反應體系為:引物各0.32 μ M/ μ L, Taq DNA 聚合酶 0.2U/ μ L, dNTP0.4 μ M/ μ L, Mg2+0.65 μ M/ μ L,模板 2 ~4ng/μ L,以ddH20配制。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR擴增程序為:94°C5min ；94°C 0.5min，50 ~62°C 0.5min,72°C lmin，共 30 個循環(huán)；72°C 5min。`
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中PCR擴增程序為:94°C5min ；94°C 0.5min,58°C 0.5min,72°C lmin，共 30 個循環(huán)；72°C 5min。
8.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述近緣屬植物包括但不限于菊屬、亞菊屬、太行菊屬。
【文檔編號】C12N15/11GK103773762SQ201410016955
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權日:2014年1月14日
【發(fā)明者】張啟翔, 劉華, 孫明, 高亦珂, 潘會堂, 程堂仁, 王佳, 楊煒茹 申請人:北京林業(yè)大學