一種從水稻秸稈中制備木聚糖和低聚木糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種從水稻秸稈中制備木聚糖和低聚木糖的方法。該方法是粉碎后水稻秸稈加入NaOH溶液，40～80℃下浸提1～9h，離心得上清液；冰醋酸調節(jié)pH值至7.0，加入乙醇溶液2～8℃沉淀24h，烘干得木聚糖粗提物；木聚糖粗提物中加入NaAc-HAc緩沖液混勻，45～65℃下加入木聚糖酶酶解2～10h，酶解后立即煮沸5～10min，得到滅活后的酶解溶液，離心，上清液濃縮得到低聚木糖。本發(fā)明用水稻秸稈作為原料，來源廣泛，價格低廉，成本低廉，且解決秸稈資源浪費問題；采用堿法預處理結合木聚糖酶解法，利用水稻秸稈這一豐富的資源制備低聚木糖，成本較低，工藝過程較短，處理過程環(huán)保。
【專利說明】一種從水稻秸稈中制備木聚糖和低聚木糖的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從水稻秸桿中制備木聚糖和低聚木糖的方法。
【背景技術】
[0002]農作物秸桿等農棄物是一種可再生有機物，儲量相當可觀，據資料顯示世界上每年大約有農作物秸桿20~30億t，在中國農作物秸桿年產量達到8.5億多t，僅吉林省年產秸桿就有154萬t，稻殼年產量超過8000萬噸。農棄物中蘊藏著豐富的能量，作物通過光合作用產生的有機物50 %都存在于秸桿中。
[0003]秸桿等農田棄物是很好的木質纖維材料，主要由纖維素、半纖維素、木質素三大部分組成，是提取木聚糖的理想原料。木聚糖可作為乳化劑及膳食纖維應用在食品中，具有促進有絲分裂和提高免疫力等功能。另外木聚糖通過酶解能得到低聚木糖，低聚木糖能促進雙歧桿菌增長，抑制有害菌，改善微生態(tài)環(huán)境。還具有抗氧化性，預防活性氧自由基引起的老年癡呆、血栓、動脈粥樣硬化等病癥生理功能。
[0004]因此，以秸桿為原料，優(yōu)化木聚糖的提取工藝，不僅解決了資源浪費問題，也為低聚木糖的制備奠定了基礎。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種從水稻秸桿中制備木聚糖和低聚木糖的方法。
[0006]本發(fā)明方法包括以下步驟:
[0007]步驟(1).木聚糖的提取
[0008]將水稻秸桿烘干并進行粉碎，然后將粉碎后的水稻秸桿加入到濃度為I %~3 %的NaOH溶液中，40~80°C下浸提I~9h，離心，得上清液；其中粉碎后的秸桿與NaOH溶液的料液比為1:10~1:30 (g/ml);用冰醋酸調節(jié)上清液的pH值至7.0，得到中性溶液；在中性溶液中加入體積分數為95 %的乙醇溶液置于2~8°C下沉淀24h，取沉淀，烘干至恒重后得到木聚糖粗提物；其中中性溶液與乙醇溶液的體積比為1:3。
[0009]作為優(yōu)選，NaOH溶液的濃度為3 % ；
[0010]作為優(yōu)選，粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比為1:20 (g/ml)；
[0011]作為優(yōu)選，粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液混合后在70°C下浸提3h，離心，得上清液；
[0012]木聚糖提取率(％)=木聚糖含量(g)/水稻秸桿粉末質量(g)；
[0013]步驟(2).酶解法制備低聚木糖:
[0014]在步驟I得到的木聚糖粗提物中加入pH值為4.0~6.0的NaAc-HAc緩沖液混合均勻，然后在45~65°C下 加入木聚糖酶酶解2~10h，酶解后立即煮沸5~lOmin，達到將木聚糖酶滅活的目的；將滅活后的酶解溶液以4000rpm離心10~15min，取上清液，濃縮得到低聚木糖；每克木聚糖粗提物加入20mLNaAC-HAC緩沖液與600~1400U木聚糖酶；[0015]作為優(yōu)選，酶解條件是pH4.5，溫度55°C，酶解時間8h，加酶量1000U.g_l。
[0016]利用DNS法對所購買的商品木聚糖酶進行酶活力測定:
[0017]I)木糖標準曲線的繪制:
[0018]配制Img.mL—1的木糖標準溶液，并梯度稀釋，然后分別與DNS試劑反應后，在540nm波長下測定吸光值，并以吸光值為縱坐標，以木糖的質量濃度(mg.mL—1)為橫坐標繪制標準曲線，并得出回歸方程。
[0019]所述的DNS試劑的制備過程是:
[0020]稱取6.3g3, 5-二硝基水楊酸加入到500mL雙蒸水中并置于45°C水浴，攪拌均勻后加入21.4g氫氧化鈉，不斷攪拌，溫度不宜超過48°C，直到溶液清澈透明；然后加入182g酒石酸鉀鈉、5g苯酚、5g無水亞硫酸鈉，繼續(xù)45°C水浴，不斷攪拌使其完全溶解，冷卻至常溫后定容至1000mL,過濾,置于棕色瓶暗處保存一周后備用。
[0021]2)木聚糖酶活力的測定:將0.1mL木聚糖酶溶液與0.9mL預熱的木聚糖溶液混合后，置于50°C水浴加熱30min，取出加入1.5mL DNS試劑后沸水浴5min，然后冷卻至常溫后加IOmL雙蒸水，混勻后在540nm下測定吸光值。根據木糖標準曲線計算酶活力。
[0022]所述的木聚糖酶溶液為用商品木聚糖酶與pH值為5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制成濃度為5mg.mL—1的木聚糖酶溶液。
[0023]木聚糖酶活性:在pH值為5.0，溫度為50°C，Imin內水解木聚糖底物，產生相當于I μ mo I木糖的還原糖時所用的酶量，單位為U ；
[0024]酶活力(U.g_1) = (X*Df) /(t*150* 樣品質量)；
[0025]其中，X表示在木糖標準曲線上對應的木糖濃度，Df表示稀釋倍數，150是指木糖分子量，t表示反應時間。
[0026]對步驟(2)制備得到的低聚木糖進行還原糖和總糖的含量測定:
[0027]還原糖含量的測定:取ImL步驟(2)離心后的稀釋20倍的上清液，加入1.5mL DNS試劑混勻后沸水浴5min，冷卻加入雙蒸水10mL，混勻后在540nm波長下比色，測得吸光光度值。
[0028]總糖含量的測定:取ImL步驟(2)離心后的稀釋10倍的上清液，加入ImL濃度為6mol.I/1的HCl溶液及1.5mL雙蒸水，置于沸水浴中加熱水解30min，冷卻后用濃度為6mol.L—1的NaOH溶液中和至pH值為7，然后取ImLNaOH溶液中和后的樣液，加入1.5mLDNS試劑混勻后沸水浴5min，冷卻加入雙蒸水10mL，混勻后在540nm波長下比色，測得吸光
光度值。
[0029]對步驟(2)酶解產物進行薄層層析(TLC):
[0030]取步驟(2)離心后的上清液點樣在硅膠板上，將硅膠板置于層析液中展層3~4h后，在60°C下烘干，再均勻地噴上顯色劑后將硅膠板于85°C下加熱IOmin，觀察顯色結果。
[0031]所述的層析液為正丁醇、冰乙酸、蒸餾水按照2:1:1的體積比混合而成的混合液。
[0032]所述顯色劑為4g 二苯胺、4mL苯胺、20mL質量分數為85 %的磷酸溶液、200mL丙酮混合而成的混合液。
[0033]本發(fā)明的有益效果是:
[0034]低聚木糖作為一種新型功能性食品添加劑具有調節(jié)腸道微生態(tài)、降低血壓、血糖、血脂和提高機體免疫力等功能，為很多特殊人群帶來福音，在動物飼料中的應用也很廣泛，具有多方面的功能。本發(fā)明采用水稻秸桿作為原料，秸桿來源廣泛，價格低廉，生產木聚糖和低聚木糖的成本低廉，且解決了秸桿資源浪費問題，變廢為寶，及時有效地處理農林廢料，緩解了地球溫室效應進程，帶來可觀的經濟效益和社會效益，順應了可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略。
[0035]其他的處理方法有:酸水解法，微波消解法，蒸汽爆破法等，這些方法對儀器設備的要求比較高，需要特殊的環(huán)境，如耐酸、耐壓及高溫的環(huán)境。本法采用堿法預處理結合木聚糖酶解法，利用水稻秸桿這一豐富的資源制備低聚木糖，成本較低，工藝過程較短，處理過程環(huán)保，通過單因素及正交試驗可得到高得率的木聚糖和低聚合度低聚木糖產物的最佳處理方式，充分節(jié)約了資源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為實施例5中NaOH濃度對木聚糖提取率的影響；
[0037]圖2為實施例5中粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比對木聚糖提取率的影響；
[0038]圖3為實施例5中浸提溫度對木聚糖提取率的影響；
[0039]圖4為實施例5中浸提時間對木聚糖提取率的影響；
[0040]圖5為實施例6中木糖標準曲線；
[0041 ]圖6為實施例7中pH對酶解的影響；
[0042]圖7為實施例7中酶解溫度對木聚糖酶水解的影響；
[0043]圖8為實施例7中酶解時間對木聚糖酶水解的影響；
`[0044]圖9為實施例7中加酶量對酶解的影響；
[0045]圖10為實施例8中酶解產物的薄板層析圖。
【具體實施方式】
[0046]下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的分析。
[0047]實施例1.[0048]步驟(1).木聚糖的提取
[0049]將水稻秸桿烘干并進行粉碎，然后將100g粉碎后的水稻秸桿加入到1000ml濃度為3 %的NaOH溶液中，40°C下浸提9h，離心，得上清液；用冰醋酸調節(jié)上清液的pH值至7.0，得到中性溶液；取IOml中性溶液中加入30ml體積分數為95 %的乙醇溶液混合均勻后，2°C下沉淀24h，取沉淀，烘干至恒重后得到木聚糖粗提物。
[0050]步驟(2).酶解法制備低聚木糖:
[0051]在IOg木聚糖粗提物中加入200mL pH值為4.0的NaAc-HAc緩沖液混合均勻，然后在45°C下加入600U木聚糖酶酶解10h，酶解后立即煮沸5in，達到將木聚糖酶滅活的目的；將滅活后的酶解溶液以4000rpm離心lOmin，取上清液，濃縮得到低聚木糖。
[0052]實施例2.[0053]步驟(1).木聚糖的提取
[0054]將水稻秸桿烘干并進行粉碎，然后將100g粉碎后的水稻秸桿加入到3000ml濃度為I %的似0!1溶液中，80°C下浸提lh，離心，得上清液；用冰醋酸調節(jié)上清液的pH值至7.0，得到中性溶液；取IOml中性溶液中加入30ml體積分數為95 %的乙醇溶液混合均勻后，8°C下沉淀24h，取沉淀，烘干至恒重后得到木聚糖粗提物。
[0055]步驟(2).酶解法制備低聚木糖:
[0056]在IOg木聚糖粗提物中加入200mL pH值為6.0的NaAc-HAc緩沖液混合均勻，然后在65°C下加入1400U木聚糖酶酶解2h，酶解后立即煮沸l(wèi)Omin，達到將木聚糖酶滅活的目的；將滅活后的酶解溶液以4000rpm離心15min，取上清液，濃縮得到低聚木糖。
[0057]實施例3.[0058]步驟(1).木聚糖的提取
[0059]將水稻秸桿烘干并進行粉碎，然后將100g粉碎后的水稻秸桿加入到2000ml濃度為3 %的NaOH溶液中，70°C下浸提3h，離心，得上清液；用冰醋酸調節(jié)上清液的pH值至7.0，得到中性溶液；取IOml中性溶液中加入30ml體積分數為95 %的乙醇溶液混合均勻后，8°C下沉淀24h，取沉淀，烘干至恒重后得到木聚糖粗提物。
[0060]步驟(2).酶解法制備低聚木糖:
[0061]在IOg木聚糖粗提物中加入200mL pH值為4.5的NaAc-HAc緩沖液混合均勻，然后在55°C下加入1000U木聚糖酶酶解8h，酶解后立即煮沸l(wèi)Omin，達到將木聚糖酶滅活的目的；將滅活后的酶解溶液以4000rpm離心12min，取上清液，濃縮得到低聚木糖。
[0062]實施例4.[0063]步驟(1).木聚糖的提取
[0064]將水稻秸桿烘干并進行粉碎，然后將100g粉碎后的水稻秸桿加入到2500ml濃度為2 %的NaOH溶液中，50°C下浸提5h，離心，得上清液；用冰醋酸調節(jié)上清液的pH值至7.0，得到中性溶液；取IOml中性溶液中加入30ml體積分數為95 %的乙醇溶液混合均勻后，8°C下沉淀24h，取沉淀，烘干至恒重后得到木聚糖粗提物。
[0065]步驟(2).酶解法制備低聚木糖:
[0066]在IOg木聚糖粗提物中加入pH值為5.0的NaAc-HAc緩沖液混合均勻，然后在50°C下加入800U木聚糖酶酶解5h，酶解后立即煮沸8min，達到將木聚糖酶滅活的目的；將滅活后的酶解溶液以4000rpm離心12min，取上清液，濃縮得到低聚木糖。
[0067]實施例5.不同因素對木聚糖提取率的影響
[0068]I) NaOH濃度對木聚糖提取率的影響
[0069]選取NaOH濃度I %、1.5 %、2 %、2.5 %、3 %，粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比為1:20^/1111)，浸提溫度701:，浸提時間311條件下進行實驗，結果如圖1所示。據圖1可知，木聚糖提取率隨著堿液濃度的增加而提高，其中以NaOH濃度為3 %時提取率最高。據此，選定木聚糖制備最佳NaOH濃度為3 %。
[0070]2)料液比對木聚糖提取率的影響
[0071]選取粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 (g/ml), NaOH溶液的濃度為3 %，浸提溫度70°C，浸提時間3h條件下進行實驗，結果如圖2所示。據圖2可知，隨著粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比增加，木聚糖提取率提高。
[0072]當粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比為1:20時，木聚糖提取率達到20.97%。之后隨著料液比增加，木聚糖提取率未見明顯提高，導致堿液過量，造成浪費，加重廢水處理壓力。綜合各因素，選定木聚糖制備最佳料液比為1:20 (g/ml)。[0073]3)浸提溫度對木聚糖提取率的影響
[0074]選取浸提溫度40°c、50°c、6(rc、7(rc、8(rc，固定粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比1:20(g/ml)，Na0H濃度3 %，浸提時間3h條件下進行實驗，結果如圖3所示。據圖3可知，在所選取的溫度范圍內，木聚糖提取率隨著溫度的升高變化不大，適當提高溫度對木聚糖提取有一定的促進作用。但由于溫度升高后提取液的顏色逐漸加深，綜合各因素條件考慮，選定木聚糖制備最佳浸提溫度為70°C。
[0075]4)浸提時間對木聚糖提取率的影響
[0076]選取浸提時間lh、3h、5h、7h、9h，固定粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比1:20 (g/ml)，NaOH溶液的濃度3 %，浸提溫度70°C條件下進行實驗，結果如圖4所示。據圖可知，隨著浸提時間的延長，木聚糖提取率降低，在3h時木聚糖的提取率最高。據此，選定木聚糖制備最佳浸提時間為3h。
[0077]5)設計正交實驗確定木聚糖提取的最佳工藝
[0078]基于上述單因素實驗，選定4因素3水平采用L9 (34)正交表進行正交實驗，實驗重復3次，并在5 %水平下進行多重比較。正交實驗因素水平如表1所示，正交實驗結果如表2所示。
[0079]表1正交實驗水平因素表
【權利要求】
1.一種從水稻秸桿中制備木聚糖和低聚木糖的方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 步驟(1).木聚糖的提取: 將水稻秸桿烘干并進行粉碎，然后將粉碎后的水稻秸桿加入到濃度為I %~3 %的NaOH溶液中，40~80°C下浸提I~9h，離心，得上清液；其中粉碎后的秸桿與NaOH溶液的料液比為1:10~1:30，單位為g/ml ;用冰醋酸調節(jié)上清液的pH值至7.0，得到中性溶液；在中性溶液中加入體積分數為95 %的乙醇溶液置于2~8°C下沉淀24h，取沉淀，烘干至恒重后得到木聚糖粗提物；其中中性溶液與乙醇溶液的體積比為1:3 ； 步驟(2).酶解法制備低聚木糖: 在步驟I得到的木聚糖粗提物中加入pH值為4.0~6.0的NaAc-HAc緩沖液混合均勻，然后在45~65°C下加入木聚糖酶酶解2~10h，酶解后煮沸5~lOmin，得到滅活后的酶解溶液；滅活后的酶解溶液以4000rpm離心10~15min，取上清液，濃縮得到低聚木糖；每克木聚糖粗提物加入20mL NaAc-HAc緩沖液與600~1400U木聚糖酶。
2.如權利要求1所述的一種從水稻秸桿中制備木聚糖和低聚木糖的方法，其特征在于步驟(1)中NaOH溶液的濃度為3 %。
3.如權利要求1所述的一種從水稻秸桿中制備木聚糖和低聚木糖的方法，其特征在于步驟(1)中粉碎后的水稻秸桿與NaOH溶液的料液比為1:20，單位為g/ml。
4.如權利要求1所述的一種從水稻秸桿中制備木聚糖和低聚木糖的方法，其特征在于步驟(1)浸提溫度為70°C，浸提時間為3h。
5.如權利要求1所述的一種從水稻秸桿中制備木聚糖和低聚木糖的方法，其特征在于步驟(2)酶解條件為ρΗ4.5， 溫度55°C，酶解時間8h，加酶量1000U.g—1。
【文檔編號】C12P19/04GK103757072SQ201410013087
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權日:2014年1月10日
【發(fā)明者】張曉勤, 薛大偉, 方哈哈, 王敏敏, 楚單單, 戴歡歡 申請人:杭州師范大學