一種刺參科17種經(jīng)濟(jì)海參基于coi基因的pcr-rflp鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種刺參科17種經(jīng)濟(jì)海參基于COI基因的PCR-RFLP鑒別方法。它包括a、以待檢測(cè)刺參科海參作為檢測(cè)樣品，提取其DNA，以其作為模板，利用引物COIe-F:5`-ATA?ATGATAGGAGGRTTTGG-3`，COIe-R:5`-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3`PCR擴(kuò)增出CO?I片段，所述的R為A/G；b、用限制性內(nèi)切酶組合DdeI/SfcI或BstNI/Sau3AI對(duì)COI片段進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，估算待檢測(cè)樣品各電泳條帶大小，將電泳圖中的電泳條帶數(shù)量及條帶大小的估算值與17種海參的標(biāo)準(zhǔn)帶譜進(jìn)行對(duì)比，查找到電泳條帶數(shù)量及大小均與標(biāo)準(zhǔn)譜帶匹配的，該標(biāo)準(zhǔn)譜帶所代表的種類即為被檢測(cè)樣品的種類。本發(fā)明適用范圍廣，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)準(zhǔn)確、快速，尤其適用于大批量商品海參的鑒定，從而為刺參科海參樣品的鑒定提供科學(xué)方法，為規(guī)范海參商品市場(chǎng)和保護(hù)海參資源提供技術(shù)支持。
【專利說(shuō)明】—種刺參科1 7種經(jīng)濟(jì)海參基于COI基因的PCR-RFLP鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)便的海參種類分子鑒定方法，具體涉及一種刺參科17種經(jīng)濟(jì)海參基于COI基因的PCR-RFLP鑒別方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]海參具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，在我國(guó)被認(rèn)為是傳統(tǒng)的美味和滋補(bǔ)品，位列“八珍”之一。全球記錄的海參種類有1400多種，而可供食用的海參種類約50多種，主要是海參科(Holothuriidae)和刺參科(Stichopodidae)種類。與海參科種類相比，刺參科海參背面有較大疣足，骨片多為桌形體，無(wú)扣狀體，但有C形體或雙分枝桿狀體，或簡(jiǎn)單顆粒體。作為名貴的海產(chǎn)品，海參在市場(chǎng)上通常加工為干品或凍品出售，海參經(jīng)過(guò)多道工序加工成干品后，很難從外部形體上分辨出其種類。目前在市面上銷(xiāo)售的海參產(chǎn)品，大多根據(jù)其顏色和產(chǎn)地來(lái)命名貼標(biāo)，如“美國(guó)紅參”、“非洲海參”等，缺乏規(guī)范的商品命名，海參市場(chǎng)貼標(biāo)混亂。因此，非常有必要開(kāi)發(fā)出準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定海參種類的方法。
[0003]線粒體DNACOI序列被廣泛應(yīng)用在海參系統(tǒng)進(jìn)化和種類鑒定的研究中，C0IPCR-RFLP是一種操作簡(jiǎn)單、快捷的種類鑒別方法，目前該方法在海參種類鑒定中應(yīng)用較少，缺乏系統(tǒng)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種適用范圍廣，操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求低，檢測(cè)準(zhǔn)確、快速，尤其適用于大批量商品海參鑒定的刺參科17種經(jīng)濟(jì)海參基于COI基因的PCR-RFLP鑒別方法。
[0005]本發(fā)明的刺參科17種經(jīng)濟(jì)海參基于COI基因的PCR-RFLP鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]a、以待檢測(cè)刺參科海參作為檢測(cè)樣品，提取其DNA，然后以其作為模板，利用引物COIe-F: 5' -ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3'，COIe-R: 5' -GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3' PCR 擴(kuò)增出COI片段，所述的R為A/G;
[0007]b、用限制性內(nèi)切酶組合Ddel/Sfcl或BstNI/Sau3AI對(duì)COI片段進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，估算待檢測(cè)樣品各電泳條帶大小，將電泳圖中的電泳條帶數(shù)量及條帶大小的估算值與下表所示17種海參的標(biāo)準(zhǔn)帶譜進(jìn)行對(duì)比，查找到電泳條帶數(shù)量及大小均與標(biāo)準(zhǔn)譜帶匹配的，
[0008]該標(biāo)準(zhǔn)譜帶所代表的種類即為被檢測(cè)樣品的種類:
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種刺參科17種經(jīng)濟(jì)海參基于COI基因的PCR-RFLP鑒別方法，其特征在于，包括以下 步驟: a、以待檢測(cè)刺參科海參作為檢測(cè)樣品，提取其DNA，然后以其作為模板，利用引物COIe-F: 5' -ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3'，COIe-R: 5' -GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3'PCR 擴(kuò)增出 COI片段，所述的R為A/G; b、用限制性內(nèi)切酶組合Ddel/Sfcl或BstNI/Sau3AI對(duì)COI片段進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，估算待檢測(cè)樣品各電泳條帶大小，將電泳圖中的電泳條帶數(shù)量及條帶大小的估算值與下表所示17種海參的標(biāo)準(zhǔn)帶譜進(jìn)行對(duì)比，查找到電泳條帶數(shù)量及大小均與標(biāo)準(zhǔn)譜帶匹配的， 該標(biāo)準(zhǔn)譜帶所代表的種類即為被檢測(cè)樣品的種類:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺參科17種經(jīng)濟(jì)海參基于COI基因的PCR-RFLP鑒別方法，其特征在于，所述的步驟a的PCR擴(kuò)增出COI片段為:PCR反應(yīng)體積為50 μ L，包含 37.6μ L 無(wú)菌 7jC, 5 μ LlOXPCRBuffer, I μ LlOuMCOIe-F 引物，I μ LlOuMCOIe-R 引物，4μ L2.5mMdNTPmixture，0.4μ L5U/y LTaq?酶，I μ LDNA模板；PCR反應(yīng)條件為，先94°C預(yù)變性2分鐘，而后94°C變性30秒，48°C復(fù)性30秒和72°C延伸45秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘，得COI片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺參科17種經(jīng)濟(jì)海參基于COI基因的PCR-RFLP鑒別方法，其特征在于，所述的步驟b的用限制性內(nèi)切酶組合Ddel/Sfcl或BstNI/Sau3AI對(duì)COI片段進(jìn)行酶切具體為:限制性內(nèi)切酶Ddel/Sfcl酶切反應(yīng)體積為20 μ L，包含2 μ LlO X buffer，SfcI和DdeI各3U，16 μ LCOI片段，余量為水，反應(yīng)條件為37°C溫浴2個(gè)小時(shí)；限制性內(nèi)切酶 BstNI/Sau3AI 酶切反應(yīng)體積為 20 μ L，包含 2 μ LlO X buffer，BstNI 和 Sau3AI 各 4U,16 μ LCOI片段，余量為水，反應(yīng)條件為先37°C溫浴I個(gè)小時(shí)，隨后60°C溫浴I個(gè)小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103923972SQ201410010808
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】夏建軍, 胡超群, 任春華, 羅鵬, 于宗赫 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所