一株富含甘油酯型DHA的破囊壺菌Aurantiochytrium sp.及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一株經(jīng)過選育可用于生產(chǎn)甘油酯型DHA的破囊壺菌Aurantiochytrium?sp.及其應(yīng)用。所述破囊壺菌分離自中國深圳沿海水域，已于2013年12月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（China?General?Microbiological?Culture?Collection?Center，CGMCC），保藏編號(hào)為CGMCC?No.8575。所述破囊壺菌菌體的非極性脂質(zhì)占總脂質(zhì)的含量高，為富含甘油酯型DHA的菌株，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)甘油酯型DHA。
【專利說明】—株富含甘油酯型DHA的破囊壺菌
sp.及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物破囊壺菌CGMCC N0.8575,其脂質(zhì)的主要成分為非極性脂質(zhì)，其中DHA占總脂質(zhì)含量高，可以獲得高產(chǎn)量的甘油酯型DHA，適用于甘油酯型DHA的工業(yè)生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是保持人體健康重要的營養(yǎng)成分之一，特別是DHA和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acids,EPA)具有非常重要的醫(yī)藥應(yīng)用和營養(yǎng)價(jià)值。
[0003]在食品行業(yè)中，甘油酯型DHA可添加至牛奶或奶粉中，用作功能性營養(yǎng)物質(zhì)。
[0004]目前，DHA的商業(yè)來源主要是海洋魚油，沙丁魚、鰭魚等含有較高的脂肪組織，在很多國家都被用來生產(chǎn)魚油，魚油中DHA的含量可以達(dá)到20-30%。但是以魚油為原料生產(chǎn)DHA具有很多缺點(diǎn)，如魚油產(chǎn)量不穩(wěn)定，成分復(fù)雜，含有魚腥味，可能存在重金屬污染。
[0005]在海洋環(huán)境中，微生物如海洋微藻、真菌等才是DHA的原始生產(chǎn)者。在這些微生物中，DHA的相對(duì)含量要遠(yuǎn)高于魚油中的含量。
[0006]破囊壺菌是 一類異養(yǎng)的真菌類原生生物，近年來由于其廣闊的生物技術(shù)應(yīng)用前景而備受關(guān)注。破囊壺菌可以用來生產(chǎn)胞外酶、胞外多糖、類胡蘿卜素、ω-3多不飽和脂肪酸如DHA和ΕΡΑ，以及其他一些工業(yè)應(yīng)用的生物活性物質(zhì)。
[0007]破囊壺菌的脂肪酸組成簡(jiǎn)單、培養(yǎng)條件成本低，利用破囊壺菌生產(chǎn)DHA，可以有效地解決魚油DHA存在的問題。因此，作為多不飽和脂肪酸新的生產(chǎn)來源，破囊壺菌是極具潛力進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)DHA的微生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供甘油酯型DHA含量高的破囊壺菌Jarafliioc及Firiw? sp.CGMCC N0.8575，可用于工業(yè)化生產(chǎn)DHA，添加于牛奶、奶粉或保健品中。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，提供了一種甘油酯型DHA產(chǎn)量高，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8575的破囊壺菌。該菌株的分類命名為應(yīng)sp.;保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期為2013年12月13日。
[0010]該菌株于2012年7月，分離自深圳大鵬灣沿海水域。分離方法的特點(diǎn)在于:采用不同的抗生素組合，利用松花粉垂釣選育。當(dāng)破囊壺菌富集于松花粉邊緣時(shí)，挑取松花粉粒，劃線培養(yǎng)于瓊脂平板上，3-5天后，挑取單菌落劃線培養(yǎng)于新的瓊脂平板上，以獲得純種破囊壺菌。根據(jù)此分離方法，從一個(gè)采樣點(diǎn)共獲得8株破囊壺菌。
[0011]在本發(fā)明中，涉及破囊壺菌脂質(zhì)的提取和分析。其特點(diǎn)在于:利用氯仿:甲醇=1:2體系的混合物作為抽提溶劑，提取細(xì)胞內(nèi)的總脂質(zhì)，通過氣象色譜對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，從而選育出 DHA 含量高的菌株，即sp.CGMCC N0.8575。
[0012]在本發(fā)明中，還包括破囊壺菌非極性脂質(zhì)的分離鑒定。利用尼羅紅染色，在熒光顯微鏡下觀察顯示，破囊壺菌sp.CGMCC N0.8575胞內(nèi)非極性脂質(zhì)含量高，定量分析顯示，凍干的破囊壺菌sp.CGMCC N0.8575每克包含
0.65-0.85g脂質(zhì)，其中約有75%為非極性脂質(zhì)，其中甘油酯型DHA約占總DHA的73%。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，破囊壺菌sp.CGMCC N0.8575細(xì)胞內(nèi)脂肪酸主要為DHA和十六烷酸，兩者之和為脂肪酸含量的80-90%，即十六烷酸含量可達(dá)35-65%。高含量的十六烷酸說明該菌株也適用于生物柴油的工業(yè)生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了存在于中國深圳沿海水域中的破囊壺菌，并從中挑選出了一株富含甘油酯型DHA的菌株。18S rRNA測(cè)序結(jié)果顯示該破囊壺菌為應(yīng)sp.,該菌株被命名為Aurantiochytrium sp.PKU#SW7,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC),保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8575。
[0015]破囊壺蔑Aurantiochytriuni sp.CGMCC N0.8575保藏于瓊脂平板上。瓊脂培養(yǎng)基組成如下:每100ml過濾海水中含葡萄糖Ig,蛋白胨0.15g,酵母提取物0.01g,瓊脂lg。將劃線培養(yǎng)的破囊壺菌^?/'<3/?0'0<^_7(/^_8卩.CGMCC N0.8575置于室溫保藏。
[0016]可以根據(jù)如下方案制備接種培養(yǎng)液。
[0017]從保藏的瓊脂平板中挑取生長(zhǎng)良好的菌落，接入10_20ml海水培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用作接種液。接種液在培養(yǎng)2天后，以大于5%的比例接種于新鮮的海水培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件溫度為25-30°C，轉(zhuǎn)速為160rpm，在培養(yǎng)4天后，收集生物質(zhì)。
[0018]培養(yǎng)過程中，利用尼羅紅染料對(duì)破囊壺菌sp.CGMCC N0.8575細(xì)胞進(jìn)行染色，于熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞體內(nèi)的金黃色熒光顯示其非極性脂質(zhì)含量聞。
[0019]稱取一定量的凍干生物質(zhì)樣品，可以利用氯仿:甲醇=1:2體系的混合物作為抽提溶劑，提取細(xì)胞內(nèi)的總脂質(zhì)。首先，將稱取的干燥生物質(zhì)放置具塞三角瓶中，添加抽提溶劑后，160rpm振蕩I小時(shí)后添加氯仿:甲醇=1:1體系溶劑，混合均勻后靜置lh，轉(zhuǎn)移出氯仿層，氮吹濃縮即得到總脂質(zhì)。獲得總脂質(zhì)含量為細(xì)胞干重的65-85%，即每克破囊壺菌Aurantiochytrium sp.CGMCC N0.8575 凍干細(xì)胞含有脂質(zhì)的量為 0.65-0.85g。
[0020]對(duì)提取的總脂質(zhì)進(jìn)行柱色譜分離。采用sigma Discovery DSC-NH2固相萃取柱，利用正己烷老化柱子，以正己烷:氯仿:甲醇=95:3:2的體系上樣。非極性脂質(zhì)部分首先通過氯仿洗脫得到，極性脂質(zhì)部分通過兩步洗脫得到，第一步采用甲醇:氯仿=6:1洗脫，第二步采用0.05M醋酸鈉溶液(溶劑為甲醇:氯仿=6:1)洗脫。結(jié)果顯示非極性脂質(zhì)占總脂質(zhì)的75%左右。
[0021]對(duì)柱色譜分離獲得的非極性脂質(zhì)進(jìn)行薄層色譜分析。采用G型薄層層析硅膠板，進(jìn)行二維色譜分離。在第一個(gè)方向，采用正己烷:乙醚=80:20為展開劑，第二個(gè)方向，采用正己烷:乙醚:甲醇=70:20:10為展開劑。結(jié)果顯示非極性脂質(zhì)中的主要成分為甘油三酯。[0022]對(duì)總脂質(zhì)、非極性脂質(zhì)和極性脂質(zhì)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。采用4%的硫酸甲醇溶液，于80°C酯交換反應(yīng)I小時(shí)，冷卻至室溫后，用正己烷抽提，用于氣象色譜分析。發(fā)現(xiàn)DHA占總脂質(zhì)含量的28-35%，非極性脂質(zhì)中DHA的含量為20_25%，即甘油酯型DHA達(dá)到總DHA含量的73%左右,表明破囊壺菌sp.CGMCC N0.8575是一株非常適用于生產(chǎn)甘 油酯型DHA的菌株。
【權(quán)利要求】
1.一株富含甘油酯型DHA的破囊壺菌sp.CGMCC N0.8575,其特征在于:保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center, CGMCC)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，從深圳大鵬灣沿海水域分離出破囊壺菌，并從中挑選出了一株富含甘油酯型DHA的菌株，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為及Firiws sp.PKU#SW7，保藏編號(hào)為CGMCCN0.8575。
3.權(quán)利要求2中所述的分離方法，其特點(diǎn)在于:采用不同的抗生素組合，利用松花粉垂釣選育，當(dāng)破囊壺菌富集于松花粉邊緣時(shí)，挑取松花粉粒，劃線培養(yǎng)于瓊脂平板上，3-5天后，挑取單菌落劃線培養(yǎng)于新的瓊脂平板上，以獲得純種破囊壺菌。
4.權(quán)利要求1和2中所述的破囊壺菌CGMCCN0.8575,其生產(chǎn) DHA的特征在于:DHA為總脂肪酸含量的25-45%，其中甘油酯型DHA占總DHA的73%左右。
5.根據(jù)權(quán)利要求4，其包含在海水培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，利用尼羅紅染色法，在顯微鏡下檢測(cè)非極性脂質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4，收集生物質(zhì)后進(jìn)行冷凍干燥，從干燥細(xì)胞中提取脂質(zhì)，將提取的脂質(zhì)通過柱色譜分離，分別得到非極性脂質(zhì)(脂肪酸甘油酯)和極性脂質(zhì)(磷酸甘油酯)，對(duì)非極性脂質(zhì)部分進(jìn)行薄層色譜分析，發(fā)現(xiàn)甘油三酯為非極性脂質(zhì)的主要成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6,破囊壺菌sp.CGMCC N0.8575的細(xì)胞脂質(zhì)中，75%左右為非極性脂質(zhì)，甘油酯型DHA占總DHA的73%左右。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103725617SQ201410000036
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月1日
【發(fā)明者】劉瑛, 李晶晶, 張善發(fā), 成家楊, 溫志友, 袁文橋 申請(qǐng)人:北京大學(xué)深圳研究生院