植物中的靶向基因組工程的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于以一種靶向方式經由細菌轉化在預定義位點處修飾植物細胞或植物的基因組的改進的方法和手段。
【專利說明】植物中的靶向基因組工程 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及農學領域。更具體地，本發(fā)明提供了經由細菌介導的轉化（例如農桿 菌）在植物細胞或植物的基因組中的精確定位的核苷酸序列處引入靶向修飾的方法和手 段，該靶向修飾包括插入、缺失或取代。通過使用一種由T-DNA編碼的雙鏈DNA斷裂誘導酶 在識別核苷酸序列處誘導雙鏈斷裂而在一個第一步驟中觸發(fā)這些修飾，該T-DNA已經被引 入進植物細胞中，同時隨后將包括修復DNA分子的共引入的T-DNA用作修復雙鏈斷裂的模 板。通過經由一種單一的細菌細胞共引入這兩種T-DNA分子增加正確靶向基因組修飾的頻 率。 背景
[0002] 農桿菌介導的DNA轉移是大多數(shù)植物（包括作物）的標準轉化方法。農桿菌方法 優(yōu)于其他方法的優(yōu)點包括轉化的高效率，具有確定末端的DNA片段的轉移，相對較大的DNA 區(qū)段的轉移，以及不存在對原生質體培養(yǎng)技術的需求（Komari (科瑪麗）等人，1996Plant J.(植物雜志）10:165-174)。
[0003] 當多于一種構建體有待轉化時，與使用多于一種農桿菌菌株的同時轉化相比，直 接DNA遞送方法（例如粒子轟擊或電穿孔）由于更高的共轉化頻率可以是更有效的。然而， 這些直接遞送方法的一個缺點在于它們可以導致更加復雜的轉基因整合模式，從而使得單 拷貝轉化體的鑒定過程漫長且費力。
[0004] 為了能夠在預定的位點處引入一個外源DNA(所謂的基因靶向），需要具有兩種構 建體的轉化植物細胞或組織，一種包括編碼在特定靶標位點處誘導雙鏈DNA斷裂（DSB)的 酶的基因并且一種包括用于修復該斷裂的感興趣的DNA。當用修復DNA和編碼雙鏈DNA斷 裂誘導（DSBI)酶的DNA同時轉化植物細胞時，使用直接DNA遞送方法的這一過程比當使用 兩種農桿菌菌株時也可以是更有效的。
[0005] 可以通過使用一種單一的農桿菌菌株共遞送在同一 T-DNA上的修復DNA和DSBI 酶編碼基因改善經由農桿菌介導的轉化的使用感興趣的DNA的DSB誘導和隨后的修復的 頻率。然而，這可以導致DSBI酶編碼基因在雙鏈斷裂誘導的位點處的共整合，這是不令人 希望的。這一共整合可以通過按以下方式構建T-DNA載體來避免：有待引入進基因組中的 DNA的側翼是與基因組靶標位點具有同源性的區(qū)域，從而經由同源重組指導插入，但是由此 DSBI基因位于這些同源區(qū)之外，但是由于需要在一種構建體中包括另外的元件，所以克隆 程序變得更加復雜。
[0006] Wright (賴特）等人（2005, plant J(植物雜志），44:693-705)披露了通過兩種 分別包含ZNF表達構建體和供體DNA的線性化質粒的同時電穿孔，經由同源重組在煙草原 生質體中的工程化靶標基因座處的鋅指核酸酶（ZNF)誘導的染色體斷裂修復。
[0007] Shukla(舒克拉）等人（2009, Nature (自然）459:437-441)、US08/0182332 和 US 10/0199389描述了經由觸須（Whiskers)和粒子轟擊通過將設計的ZNF表達構建體與包含 同源臂的供體質粒共遞送進玉米胚性細胞培養(yǎng)物中而靶向插入玉米中的內源性基因座。
[0008] Lloyd(勞埃德）等人（2005, Proc Natl Acad Sci (國家科學院院刊）， 102:2232-2237)和 Zhang(張）等人（2009, Proc Natl Acad Sci (國家科學院院刊）， 107:12028-1203)以及US 10/0071083描述了被穩(wěn)定轉化進植物基因組中用于在靶向誘變 中使用的可誘導的DSBI酶編碼基因。
[0009] Cai (蔡）等人（2009, Plant Mol Biol (植物分子生物學），69:699-709)和 US 2011008833描述了使用農桿菌，經由兩種農桿菌菌株的共培養(yǎng)，并且還通過包含Ti質粒的 一種單一農桿菌菌株的共培養(yǎng)的向工程化且內源的煙草基因座中的同源性介導的靶向插 入，兩種農桿菌菌株中的一者具有供體DNA并且另一者具有設計的ZNF表達構建體，該Ti 質粒在同一 T-DNA內具有ZNF和供體構建體兩者。
[0010] Komari (科瑪麗）等人（1996, Plant J (植物雜志）10:165-174)和 US 5,731，179 披露了用于生產不含選擇標記的轉化體的超級二元載體。
[0011] 因此，考慮到農桿菌系統(tǒng)針對植物轉化的優(yōu)點，對于使用農桿菌共遞送修復DNA 分子和DSBI酶編碼嵌合基因的更有效的方法存在需要。在下文的詳細的說明書、實施例和 權利要求書中解決了這一問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1 : (a)使用一種雙T-DNA載體向預選的基因組靶標位點中的靶向插入的示意性 圖示，該載體在一組T-DNA邊界之間包括一個具有感興趣的DNA (編碼2mEPSPS和Pf-HPH) 的嵌合基因）的修復DNA分子以及在一個第二對T-DNA邊界之間包括一種編碼識別靶標植 物的基因組中的識別位點的核酸內切酶的嵌合基因?；诜峭葱缘陌邢虿迦氲慕Y果是兩 種可能的事件，取決于插入的感興趣的DNA的方向（隨機的）。指示出用于鑒定這些事件 的引物及其擴增產物。剪刀表示大范圍核酸酶蛋白，該蛋白在由兩個三角形指示的其識別 位點處誘導斷裂（每個三角形表示二分之一部分的識別位點）。RB和LB分別表示右側和 左側T-DNA邊界。（b):與a)中類似的情形，但是在此處，修復DNA另外包括側翼于感興趣 的DNA的DNA區(qū)域（同源區(qū)1和2 :hrl和hr2,由連譜號指示），這些DNA區(qū)域分別與預選 位點/識別位點的上游區(qū)或下游區(qū)具有同源性，也由連譜號指示。在這種情景中，插入的方 向不是隨機的而是由hrl和hr2與預定義位點的上游或下游區(qū)的同源性決定。還取決于同 源區(qū)的選擇，一半部分的識別位點存在或不存在于基因組中。
[0013] 圖2 :候選者正確靶向的插入事件的序列比對。（a)右側插入事件，（b)左側插入 事件。 詳細說明
[0014] 在先前實驗中，當使用直接DNA遞送方法（例如粒子轟擊）時，比當用兩種農桿菌 菌株的共孵育時，修復DNA和DSBI酶編碼DNA的共轉化導致的正確靶向插入事件的頻率高 約十倍。本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)：當用一種單一的農桿菌菌株轉化植物細胞時，經由農桿菌 將修復DNA和編碼DSBI酶的DNA共遞送至這些植物細胞中的靶向插入事件的頻率可以被 增加至與當使用直接DNA遞送方法時的類似的頻率，該菌株在單獨的T-DNA中包括兩種DNA 分子，例如在相同T-DNA載體（雙T-DNA載體）上。這一經由農桿菌轉化共遞送DSBI酶編 碼基因和修復DNA的改善方法因此結合了農桿菌介導的轉化的優(yōu)點與具有與直接遞送方 法的頻率相等的靶向基因組修飾的頻率，并且同時允許任何整合的DSBI酶編碼基因在下 一代中與靶向修飾分離。
[0015] 因此，在一個第一實施例中，本發(fā)明涉及一種用于在預選位點處修飾植物細胞的 基因組的方法，該方法包括以下步驟： a. 使一種植物細胞與一種細菌接觸，該細菌能夠指導來自所述細菌的確定的DNA分子 轉移進所述植物細胞的基因組中，所述細菌包括： i. 一種第一確定的DNA分子，該分子包括一種編碼植物功能性DSBI酶的嵌合基因，所 述DSBI酶能夠在位于所述預選位點處或其附近的識別位點處識別并誘導雙鏈DNA斷裂，所 述嵌合基因包括以下可操作連接的元件： 1. 一種植物可表達的啟動子； 2. -個編碼DSBI酶的DNA區(qū)域； 3. -個植物功能性3'終止和多聚腺苷酸化區(qū)域；以及 ii. 一種第二確定的DNA分子，該分子包括一種用作修復所述雙鏈DNA斷裂的模板的修 復DNA分子； b. 選擇一種植物細胞，其中所述修復DNA被用作修復雙鏈DNA斷裂的模板，所述雙鏈 DNA斷裂的所述修復導致在所述預選位點處的所述基因組的修飾，其中所述修飾選自 i. 至少一個核苷酸的替代； ii. 至少一個核苷酸的缺失； iii. 至少一個核苷酸的插入；或 iv. i. -iii.的任何組合。
[0016] 如在此使用，"雙鏈DNA斷裂誘導酶"是一種能夠在被稱作"識別位點"的具體核苷 酸序列處誘導雙鏈DNA斷裂的酶。稀有切割性核酸內切酶是具有14至40或甚至至70個 連續(xù)核苷酸的識別位點的DSBI酶，并且因此具有非常低的剪切頻率，甚至在較大的植物基 因組中。也稱為大范圍核酸酶的尋靶核酸內切酶構成了此類稀有切割性核酸內切酶家族。 它們可以由內含子、獨立基因或插入序列編碼，并且呈現(xiàn)了將它們和更經典的限制性內切 酶（通常來自細菌限制修飾II型系統(tǒng)）區(qū)分的顯著結構和功能特性。它們的識別位點具 有與大多數(shù)限制性內切酶識別位點的特征性二重對稱形成對比的一般不對稱性（general asymmetry)。若干由內含子或內含肽編碼的尋靶核酸內切酶已經示出促進它們對應的遺傳 元件尋靶進入等位基因的無內含子的或無內含肽位點。通過在無內含子或無內含肽等位基 因中制造一種位點特異性雙鏈斷裂，這些核酸酶產生了引起重組的末端，這些末端參與基 因轉換過程，該過程復制了編碼序列并且導致了內含子或插入序列在DNA水平的插入。
[0017] 其他稀有切割性大范圍核酸酶以及它們對應的識別位點的列表提供在W0 03/004659的表I中（17頁至20頁）（通過引用結合在此）。這些包括I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce ΙΙΙ、Η0、 Pi-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、 PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I 或PI-Tsp I。
[0018] 此外，對設計定制的稀有切割性核酸內切酶（基本上識別任何選擇的核苷酸序 列），方法是可用的。簡言之，可以使用雜合體制備嵌合限制性內切酶，該雜合體是在設計 用于識別特異核苷酸序列的鋅指結構域和來自天然限制性內切酶（例如FokI)的非特異 性DNA-切割結構域之間的雜合體。此類方法已經描述于例如WO 03/080809、W0 94/18313 或 TO 95/〇9233 中并且描述在 Isalan (艾莎蘭）等人，2〇01，Nature Biotechnology (自 然生物技術）19,656-660 ;Liu(劉）等人，1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學 院院刊）94,5525-5530中。通過從變體文庫中進行選擇來產生定制大范圍核酸酶，描述于 W02004/067736中。具有改變的序列特異性和DNA結合親和力的定制大范圍核酸酶也可 以通過如描述于W0 2007/047859中的合理設計來獲得。定制設計的核酸內切酶的另一個 實例包括所謂的TALE核酸酶，該酶基于來自融合至例如F0KI的核酸酶的催化結構域的細 菌屬黃單胞菌屬的轉錄激活因子樣效應物（TALE)。這些TALE的DNA結合特異性由串聯(lián) 排列的34/35-氨基酸重復單元的重復可變雙殘基（RVD)定義，這樣使得一種RVD特異性 識別靶標DNA中的一種核苷酸。這些重復單元可以被裝配為基本上識別任何靶標序列并 且可以被融合至核酸酶的催化結構域以產生序列特異性核酸內切酶（參見例如，Boch(博 赫）等人，2009, Science (科學）326 :p 1509-1512 ;Moscou (莫斯考）和 Bogdanove (保格丹 威），2009, Science (科學）326 :pl501 ;Christian (克里斯蒂安）等人，2010, Genetics (遺 傳學）186:757-761，W0 10/079430, W011/072246，W0 2011/154393, W0 11/146121， W0 2012/001527, W02012/093833, TO 2012/104729, TO 2012/138927, TO 2012/138939)。 TO 2012/138927進一步描述了單體型（緊湊型）TALEN和具有不同催化結構域的TALEN及其組 合。近來，描述了一種新型的可定制的核酸內切酶系統(tǒng)；所謂的CRISPR/Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)利 用一種賦予序列特異性的專用RNA分子（CrRNA)指導相關核酸酶Cas9的切割（Jinek (季 聶克）等人，2012, Science (科學）337:p816-821)。此類定制設計的核酸內切酶還被稱為 非天然發(fā)生的核酸內切酶。
[0019] 位點特異性重組酶是不同于核酸內切酶的酶，但是也可以用于進行本發(fā)明的方 法。與核酸內切酶形成對比，位點特異性重組酶需要兩個識別位點，在其之間發(fā)生重組。 因此，包括至少一個這樣的識別位點的修復DNA可以祀向也包括至少一個這樣的位點的 基因組座。位點特異性重組酶的實例在本領域是熟知的，并且包括例如來自噬菌體P1的 Cre-Lox系統(tǒng)（Austin(奧斯?。┑热?，1981，Cell (細胞），25:729-736)，來自釀酒酵母的 Flp-Frt系統(tǒng)（Broach(布羅奇）等人，1982, Cell(《細胞》），29:227-234)，來自魯氏接 合酵母的R-RS系統(tǒng)（Araki (阿拉基）等人，1985, J. MoL Biol.(分子生物學雜志），182 : 191-203)以及來自鏈霉菌噬菌體PhiC31的整合酶（Thorpe(索普）&Smith(史密斯），1998， Proc. Natl. Acad. Sci.，（國家科學院院刊）95 :5505-5510 ;Groth(格羅思）等人，2000， Proc. Natl. Acad. Sci.，（國家科學院院刊）97 :5995-6000)。
[0020] 如在此使用，"預選位點"或"預定義位點"指示植物基因組（例如核基因組）中的 具體的核苷酸序列，在該位置處希望插入、取代或缺失一個或多個核苷酸。這可以例如是內 源基因座或先前引入的外源DNA或轉基因中的具體核苷酸序列。
[0021] 如在此使用，相對于DSBI酶的識別位點的位置，"在預選位點處或附近"是指識 別位點與預選位點重疊（在此處）或遠離預選位點（在附近）。這可以例如遠離預選位點 10bp、20bp、30bp、40bp、50bp，但是還可以是 100bp、、200bp、300bp、400bp、500bp、lkb、2kb 或5kb。本領域的普通技術人員將能夠選擇一種識別在預選位點處或附近的識別位點的雙 鏈DNA斷裂誘導（"DSBI"）酶或工程化這樣的一種DSBI酶。可替代地，可以使用任何常規(guī) 轉化方法或通過使用在其基因組中具有DSBI酶識別位點的植物株系的常規(guī)育種，將DSBI 酶識別位點引入進植物基因組中，并且然后可以將任何所希望的DNA引入進那一識別位點 中或附近。
[0022] 也稱為直接DNA遞送方法的非基于細菌的（non-bacteria-based)基因轉移和轉 化方法描述于例如US 2011008833中，包括但不限于，通過鈣-、聚乙二醇（PEG)-或電穿 孔介導的裸DNA的攝取的原生質體轉染（參見Paszkowski (帕克沃斯基）等人（1984), EMBO J(歐洲分子生物學學會雜志）3:2717-2722 ;P〇trykus (波特里庫斯）等人（1985)， Molec. Gen. Genet.(普通遺傳學）199:169-177 ;From(弗羅姆）等人（1985)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學院院刊）825824-5828 ;和 Shimamoto (島本町）（1989)， Nature(自然）338:274-276)以及植物組織的電穿孔（D'Halluin(德阿呂安）等人（1992)， Plant Cell (植物細胞）4:1495-1505)。植物細胞轉染的另外的方法包括微注射，碳化硅 介導的DNA攝?。↘aeppler (凱普勒）等人（1990), PlantCell Reporter (植物細胞報 道）9:415-418)，以及微彈轟擊（參見 Klein (克萊因）等人（1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院院刊）85:4305-4309 ;和Gordon-Kim(戈登-金）等人（1990)，Plant Cell (植物細胞）2:603-618)。
[0023] 可以用于進行本發(fā)明的細菌可以是任何能夠指導被包含在該細菌中的確定 的DNA片段穩(wěn)定地轉移進植物細胞的基因組中的細菌，優(yōu)選是不致病的或消除傷害力的 (disarmed)(不包含癌基因）。此類細菌具有一個或多個質粒，例如瘤誘導質粒（Ti質粒） 或根誘導質粒（Ri質粒），這些質粒的所謂的轉移DNA(T-DNA)在轉化后被轉移進植物細 胞中并摻入在植物基因組中。根瘤菌目的某些土壤細菌具有這一能力，如根瘤菌科（例 如，根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、農桿菌屬）；葉桿菌科（例如，中慢生根瘤菌屬、葉桿菌屬）； 布魯氏菌科（例如，蒼白桿菌屬）；慢生根瘤菌科（例如，慢生根瘤菌屬），以及黃色桿菌 科（例如，氮根瘤菌屬），農桿菌屬，根瘤菌屬，中華根瘤菌屬，中慢生根瘤菌屬，葉桿菌屬， 蒼白桿菌屬和慢生根瘤菌屬，其實例包括蒼白桿菌屬、根瘤菌屬、中慢生型百脈根根瘤菌 (Mesorhizobium loti)、苜猜中華根瘤菌。根瘤菌的實例包括豌豆根瘤菌三葉草生物變異 型（R. leguminosarum bv，trifolii)、豌豆根瘤菌菜豆生物變異型（R. leguminosarum bv， phaseoli)以及豌豆根瘤菌香豆生物變異型（Rhizobium leguminosarum，bv，viciae)(美 國專利 7, 888, 552)。
[0024] 能夠轉化植物細胞并誘導外源DNA摻入進植物基因組中的可以用于進行本發(fā)明 的其他細菌是固氮菌屬（好氧），菱形藻屬（嚴格厭氧），克雷伯氏菌屬（可選擇好氧） 以及紅螺菌屬（厭氧，有光合活性）的細菌。還發(fā)現(xiàn)Ti質粒的轉移為若干根瘤菌科成員 賦予瘤誘導能力，這些根瘤菌科成員是例如三葉草根瘤菌、豌豆根瘤菌和紫金牛葉瘤桿菌 (Phyllobacterium myrsinacearum)，而根瘤菌屬NGR234、苜猜中華根瘤菌和中慢生型百脈 根根瘤菌的確可以被修飾以介導至多種不同植物的基因轉移（Broothaerts (布魯塞爾特 斯）等人，2005, Nature (自然），433:629-633)。
[0025] 通過農桿菌等將T-DNA轉移至植物細胞的機理已經被很好地記錄（參見例如， Tzfira(特茲菲拉）和 Citovsky (奇圖斯基）（2006) Curr. Opin. Biotechnol.(生物技術 現(xiàn)行觀點）17:147-154 ;Gelvin(格爾林）（2003)Microbiol. Molec. Biol. Rev.(微生物 學與分子生物學綜述）67:16-37 ;Gelvin(格爾林）（2009)Plant Physiol.(植物生理 學）150:1665-1676)。簡言之，T-DNA被兩個稱作右邊界（RB)和左邊界（LB)的邊界區(qū)限定。 這些邊界被毒性蛋白VirD2斷口，從而在其5'末端產生具有40個VirD2的共價附接的單鏈 轉移DNA ("T-鏈")。該蛋白-DNA復合體（還包括農桿菌VirE2蛋白）通過所謂的4型分泌 系統(tǒng)（T4SS，毒性蛋白和ssDNA運載蛋白兩者）退出農桿菌細胞，并且被轉移進植物細胞中 并在農桿菌毒性蛋白和植物因子的幫助下整合進植物基因組中。正常地發(fā)現(xiàn)作為Ti或Ri 質粒上的一系列操縱子的vir基因。不同的Ti和Ri質粒在vir基因的互補體方面多少有些 不同，例如通常不存在virF。使用農桿菌介導的載體將DNA引入進植物細胞中在本領域是 熟知的。參見例如，F(xiàn)raley (弗雷利）等人，（1985 ;Biotechnology (生物技術）3:629-635)、 Rogers(羅杰斯）等人，（1987 Methods Enzymol (酶學方法）153:253-277)以及美國專利 號 5, 563, 055。
[0026] LB并不為T-DNA轉移所嚴格需要，因為包含缺少LB但含有RB的T-DNA的癌基因 是高毒性的，而包含LB但不包含RB的這樣的T-DNA是完全無毒性的（Jen (珍）等人，1986， J Bacteriol (細菌學雜志）166:491-499)。因此，如在此使用，T-DNA是指一種可以被細菌 轉移進植物細胞中的DNA分子，該分子除包括用于修復DNA斷裂的DNA (修復DNA)之外，還 包括至少一種T-DNA邊界，優(yōu)選至少右側T-DNA邊界。然而，為了阻止所不希望的載體元件 的摻入，左邊界和右邊界兩者都應該被包括，即側翼于感興趣的DNA，因為這些邊界定義了 T-DNA分子的末端。
[0027] 已經描述到，左邊界比右邊界更易于"通讀（read through)"（參考（ref))。因 此，為了減少一個載體中的兩個DNA被加工為一個單一 T-DNA分子的可能性，這兩個T-DNA 被如此定向，以使得在這兩個T-DNA在該載體上彼此最靠近的點處，不存在兩個面對面的 左邊界（頭對頭；RB-LB ;LB-RB)。因此，在一個實施例中，在該載體上的這兩個T-DNA的方 向是這樣的，以使得在這兩個T-DNA在該載體上彼此最靠近的點處，存在兩個面對面的右 邊界（這些T-DNA處于尾對尾的方向：LB-RB ;RB-LB)。在一個更優(yōu)選的實施例中，在該載 體上的這兩個T-DNA的方向是處于同一方向的，這樣使得一個T-DNA的左邊界對著另一個 T-DNA的右邊界，即這兩個T-DNA處于頭對尾方向（LB-LB ;RB-LB)。
[0028] 可以用于本發(fā)明的屬于農桿菌屬的細菌的實例包括但不限于，根癌農桿菌、 發(fā)根農桿菌、放射形土壤桿菌、懸鉤子農桿菌（Agrobacterium rubi)、葡萄農桿菌 (Agrobacterium vitis)。使用的農桿菌物種可以是一種野生型（例如，有毒性的）或消除 傷害力的菌株。適合的農桿菌菌株包括野生型菌株（例如，如根癌農桿菌）或其中的一個或 多個基因被突變以增加轉化率的菌株，例如，如由于突變的或嵌合的virA或virG基因的存 在，其中的vir基因表達和/或其誘導被改變的農桿菌菌株（例如Chen (陳）和Winans (懷 南斯），1991，J.Bacteriol.(細菌學雜志）173:1139-1144 ;和 Scheeren-Groot (舍 人-格魯特）等人，1994, J. Bacteriol.(細菌學雜志）176:6418-6246)，包括一個 額外的virG基因拷貝的農桿菌菌株，如衍生自pTiB 〇542的超級virG基因，優(yōu)選地 連接至一個多拷貝質粒，如例如在美國專利號6, 483, 013中所描述。其他適合的菌 株包括但不限于：根癌農桿菌GV3101 (pMP90)) (Konc (柯妮科）和Schell (謝爾）， 1986, Mol Gen Genet.(分子與普通遺傳學）204:383-396)，LBA4404(Hoekema(胡艾 克瑪）等人，Nature(自然）303:179-180(1983)) ;EHA101 (Hood(霍德）等人，J.Bac. (細菌學雜志）168:1291-1 3〇1(1986)) ;EHAl〇5(Hood(霍德）等人，Trans Res.(轉 基因研究）2:208-218(1993)) ;AGL1 (Lazo(拉索）等人，Bio Technology(生物技 術）2:963-967(1991))。
[0029] 用于農桿菌介導的植物轉化，可以將有待插入進植物中的DNA克隆進特定質粒 中，例如克隆進中間（穿梭）載體中或克隆進二元載體中。中間載體不能在農桿菌細胞中 獨立復制，但是可以在常見大腸桿菌分子克隆菌株中進行操縱和復制。此類中間載體包括 常見地由右和左T-DNA邊界重復區(qū)加框的序列，這些序列可以包括一種用于選擇轉化的植 物細胞的選擇性標記基因、一種克隆接頭、一種克隆多接頭、或可以作為注定用于植物細胞 轉化的基因的引入位點的其他序列。因此，希望有待轉移進植物中的基因的克隆和操縱可 以通過標準方法容易地在大腸桿菌中進行，使用穿梭載體作為克隆載體。隨后地，可以將最 終操縱地穿梭載體引入進農桿菌植物轉化菌株中，用于進一步工作。中間穿梭載體可以借 助輔助質粒（經由細菌接合）、通過電穿孔、通過化學介導的直接DNA轉化、或通過其他已知 的方法轉移進農桿菌中。由于在Ti或Ri質?；蚱溲苌锱c中間質粒之間同源的序列，可 以通過同源重組將穿梭載體整合進Ti或Ri質?；蚱溲苌镏?。這一同源重組（即質粒整 合）事件從而提供了一種在農桿菌中穩(wěn)定維持改變的穿梭載體的手段，由共整合的質粒的 Ti或Ri質粒部分來提供復制起點以及其他質粒維持功能。Ti或Ri質粒還包括含有T-DNA 的轉移所必需的vir基因的vir區(qū)。攜帶vir區(qū)的質粒常見地是一種突變的Ti或Ri質粒 (輔助質粒），T-DNA區(qū)域（包括右和左T-DNA邊界重復）已經被從其中缺失。在此將此類 具有功能性vir基因并且缺少全部或基本上全部T-區(qū)以及相關元件的pTi-衍生的質粒描 述性地稱為輔助質粒。
[0030] 還可以使用所謂的超級二元系統(tǒng)制備用于植物轉化的T-DNA載體。這是穿梭載 體/同源重組系統(tǒng)的一種特化實例（由Komari (科瑪麗）等人，（2006)綜述于：Methods in Molecular Biology(分子生物學方法）（Κ· Wang(王），編）第 343 期：Agrobacterium Protocols (農桿菌方案）（第 2 版，第 1 卷）HUMANA PRESS Inc. (HUMANA 出版公司）， Totowa(特圖瓦市），新澤西州，第15-41頁；以及Komori (科瑪麗）等人，（2007)Plant Physiol.(植物生理學）145:1155-1160中）。與超級二元系統(tǒng)一起使用的根癌農桿菌宿主 菌株是LBA4404 (pSBl)。菌株LBA4404 (pSBl)具有兩個獨立復制的質粒pAL4404和pSBl。 PAL4404是一種Ti質粒衍生的輔助質粒，該輔助質粒包含一整組的vir基因（來自Ti質粒 pTiACH5)，但是不具有T-DNA區(qū)域（并且因此不具有T-DNA左和右邊界重復序列）。質粒 pSBl提供了另外部分組的衍生自pTiBo542的vir基因；這一另外的vir基因組包括virB 操縱子和virC操縱子以及基因 virG和virDl。用于超級二元系統(tǒng)中的穿梭載體的一個實 例是pSBl 1，它包含作為注定用于植物細胞轉化的基因的引入位點的克隆多接頭，側翼是 右和左T-DNA邊界重復區(qū)。穿梭載體pSBl 1不能在農桿菌中獨立復制，但是當借助存在于 pSBl和pSBl 1上的共有序列之間的同源重組整合進pSBl中時，穩(wěn)定地維持為共整合質粒。 因此，被引入進修飾的PSB11載體上的LBA4404(pSBl)中的完全修飾的T-DNA區(qū)域通過衍 生自兩種不同的農桿菌Ti質粒源（pTiACH5和pTiB 〇542)的Vir蛋白有成效地作用于并且 轉移進植物細胞中。已經證明超級二元系統(tǒng)在單子葉植物物種的轉化中是特別有用的。參 見，Hiei (江井）等人，（1994)Plant J.(植物雜志）（6:271-282)和 Ishida(石田）等人， (1996)Nat.Biotechnol.(自然生物技術）14:745-750。
[0031] 將清楚的是，還可以通過如在下文描述的常規(guī)的克隆技術而非經由上述二元同源 重組系統(tǒng)制備本發(fā)明的雙T-DNA載體。
[0032] 使用農桿菌或任何其他細菌轉化植物細胞可以經由原生質體共培養(yǎng)、外植體接 種、花序轉染（floral dipping)以及真空滲入而發(fā)生。此類技術描述于例如美國專利號 5, 177, 010、美國專利號5, 104, 310、歐洲專利申請?zhí)?131624B1、歐洲專利申請?zhí)?20516、 歐洲專利申請?zhí)?59418B1、歐洲專利申請?zhí)?76112、美國專利號5, 149, 645、美國專利號 5, 469, 976、美國專利號5, 464, 763、美國專利號4, 940, 838、美國專利號4, 693, 976、歐洲 專利申請?zhí)?16718、歐洲專利申請?zhí)?90799、歐洲專利申請?zhí)?20500、歐洲專利申請?zhí)?604662、歐洲專利申請?zhí)?27752、歐洲專利申請?zhí)?267159、歐洲專利申請?zhí)?292435、美國 專利號5, 231，019、美國專利號5, 463, 174、美國專利號4, 762, 785、美國專利號5, 004, 863、 以及美國專利號5, 159, 135中。使用包含T-DNA的載體用于轉化植物細胞已經被集中研 究并充分描述于歐洲專利申請120516 ;An(安）等人，（1985, EMBO J.(歐洲分子生物學學 會雜志）4:277-284)，F(xiàn)raley (弗雷利）等人，（1986, Crit. Rev. Plant Sci.(植物科學評 論性綜述）4:1-46)，以及Lee(李）和Gelvin(格爾林）（2008, Plant Physiol.(植物生理 學）146:325-332)中。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，可以被轉化的不同組織外植體包括來自下胚軸、子葉、不成熟的合子 胚，葉、花藥、花瓣、胚珠、根、以及分生組織、干細胞和葉柄的外植體。根據(jù)本發(fā)明，愈傷組織 也可以被轉化。如在此使用，術語"愈傷組織"是指作為植物組織培養(yǎng)的結果產生的胚性細 胞和細胞群的無組織團塊。脆弱愈傷組織是指具有脆弱質地的愈傷組織，它具有形成芽和 根并最終再生成完整植物的潛力。致密愈傷組織也可以具有形成芽和根的潛力。愈傷組織 可以再生/誘導自如上提及的不同組織外植體。
[0034] 在一個實施例中，其基因組被根據(jù)本發(fā)明進行修飾的植物細胞經由（脆弱）胚性 愈傷組織細胞的轉化進行轉化，即該細胞是一種（脆弱）胚性愈傷組織細胞（被包含在（脆 弱）胚性愈傷組織內），如下所述。
[0035] 在另一個實施例中，其基因組被根據(jù)本發(fā)明進行修飾的植物細胞經由下胚軸轉化 進行轉化，即該植物細胞是一種下胚軸細胞（被包含在下胚軸內）。認為下胚軸轉化導致更 純粹的修飾事件（較低百分比的嵌合事件）。
[0036] 在預選位點處誘導雙鏈斷裂的能力打開了若干潛在的應用，即一個或多個核苷酸 的插入、取代或缺失。假如存在于修復DNA分子中的感興趣的DNA有待插入進預選位點中， 這可以通過同源重組或通過非同源末端連接的過程而發(fā)生。還可以使用雙鏈斷裂來在預 選位點處誘導小缺失或插入的形成，從而潛在地鈍化包括該預選位點的核苷酸序列的基因 或調控元件。在預選位點處或附近的雙鏈斷裂也將促進使用修復DNA將雙鏈斷裂誘導位 點附近的DNA區(qū)域取代為感興趣的DNA，例如如描述于W0 06/105946、W0 08/037436或W0 08/148559 中。
[0037] 如果雙鏈DNA斷裂誘導伴隨著用作模板的修復DNA分子的引入，那么雙鏈斷裂修 復基本上可以按三種方式發(fā)生。修復DNA可以在DSB位點處通過在兩端的非同源末端連接 整合進基因組DNA中，或者如果在修復DNA中存在一個或兩個與預選位點的上游和/或下 游區(qū)域具有同源性的側翼區(qū)域（同源區(qū)），那么修復DNA的整合也可以（部分地）通過同源 重組發(fā)生。照此，在預選位點附近的雙鏈斷裂也將促進將該斷裂附近的DNA區(qū)域取代為感 興趣的DNA區(qū)域，例如如描述于W006/105946、W0 08/037436或W0 08/148559中。
[0038] 為了通過同源重組在預選位點處插入一個感興趣的DNA，該修復DNA可以包括至 少一個側翼DNA區(qū)域，該側翼DNA區(qū)域具有與預選位點上游或下游的DNA區(qū)域的核苷酸序 列相似的核苷酸序列。外源DNA也可以包括位于該分子相反端的兩個側翼DNA區(qū)域，并且這 些區(qū)域分別與預選位點上游和下游的DNA區(qū)域的核苷酸序列具有充分同源性，以允許所述 側翼區(qū)域與所述上游和下游區(qū)域之間的重組。修復T-DNA中的同源區(qū)可以進一步阻止DSBI T-DNA的偶然性共整合。
[0039] 如在此使用，"側翼DNA區(qū)域"是具有以下核苷酸序列的修復DNA中的DNA區(qū)域，該 核苷酸序列分別與靶標DNA序列或預選位點的上游和/或下游的DNA區(qū)域具有同源性（即 高序列一致性）（同源區(qū)）。這允許更好地控制感興趣的DNA的插入。的確，通過同源重組 的整合將允許上升至核苷酸水平的感興趣的DNA精確連接至植物核基因組。優(yōu)選地，DSBI 酶的識別位點然后被定位在兩個同源區(qū)之間。為了促進取代/缺失，也可以存在多于一個 DSBI酶識別位點。
[0040] 為了具有充分同源性用于重組，修復DNA的側翼DNA區(qū)域可以在長度方面變 化并且應至少約10個核苷酸長。然而，側翼區(qū)域在實際中可以盡可能長（例如高達 約100-150kb)，例如完全細菌人工染色體（BAC)。優(yōu)選地，該側翼區(qū)域將是約25bp至約 2000bp，例如約 50bp、100bp、200bp、500bp、1000 或 1500bp。此外，側翼于感興趣的 DNA 的 區(qū)域不需要和同源區(qū)（側翼于預選位點的DNA區(qū)域）相同，并且可以與側翼于預選位點的 DNA區(qū)域具有約80%至約100%之間的序列一致性，優(yōu)選約95%至約100%的序列一致性。 側翼區(qū)域越長，對于同源性的要求越不嚴格。此外，優(yōu)選的是在實際中在DSB附近序列一致 性盡量高。此外，為了達到在預選位點處交換靶標DNA序列而不改變毗鄰DNA序列的DNA 序列，側翼DNA序列應優(yōu)選與側翼于預選位點的上游或下游DNA區(qū)域或與有待交換的靶標 DNA序列相同。
[0041] 此外，修復DNA的一個或多個側翼區(qū)域不需要與緊側翼于DSBI酶的識別位點的區(qū) 域具有同源性，但是可以與距離那一位點更遠的核基因組的DNA區(qū)域具有同源性。感興趣 的DNA的插入將然后導致預選插入位點與DNA同源區(qū)域之間的靶標DNA的移除。換言之， 位于這些同源區(qū)（即與修復DNA的側翼區(qū)域具有同源性的基因組區(qū)域）之間的靶標DNA將 被取代為位于修復DNA的兩個側翼區(qū)域之間的感興趣的DNA。當修復DNA僅由兩個側翼區(qū) 域組成時，即缺少任何插入序列（感興趣的DNA)，可以使用這種方法特異地缺失位于這兩 個同源區(qū)域之間的基因組區(qū)域。
[0042] 有待插入的感興趣的DNA還可以包括一種在插入后可以被或可以不被移除的可 選擇的或可篩選的標記，例如如描述于W0 06/105946、W0 08/037436或W0 08/148559中， 用于促進潛在正確靶向事件的鑒定。同樣地，編碼DSBI酶的T-DNA也可以包括一種可選擇 的或可篩選的標記基因，該基因優(yōu)選地不同于感興趣的DNA中的標記基因，以允許在分離 后進行（負或逆）選擇。
[0043] 如在此使用，"可選擇的或可篩選的標記"具有其本領域通常的含義并且包括但 不限于，植物可表達的草丁膦乙酰轉移酶、新霉素磷酸轉移酶、草甘膦氧化酶、草甘膦耐 受EPSP酶、腈水解酶基因、突變型乙酰乳酸合酶或乙酰羥酸合酶基因 、β -葡萄糖醛酸酶 (GUS)、R-基因座基因、綠色熒光蛋白等。
[0044] 將清楚的是，根據(jù)本發(fā)明的這些方法允許任何感興趣的DNA的插入，這些感興趣 的DNA包括：包括具有具體核苷酸序列簽名的核苷酸序列的DNA，例如用于隨后的鑒定，或 包括（可誘導的）增強子或沉默子的DNA，例如用于調節(jié)已存在的精英（elite)事件的表 達。感興趣的DNA還可以包括一種或多種植物可表達的感興趣的基因，這些基因包括但不 限于除草劑耐受性基因、昆蟲抗性基因、疾病抗性基因、非生物脅迫抗性基因、涉及油類生 物合成或碳水化合物生物合成的酶、涉及纖維強度和/或纖維長度的酶、涉及次級代謝產 物的生物合成的酶。
[0045] 除草劑耐受性基因包括編碼酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS)的基 因。此類EPSPS基因的實例是鼠傷寒沙門桿菌的AroA基因（突變體CT7) (Comai (措美） 等人，1983, Science(科學）221，370-371)，農桿菌屬的CP4基因（Barry(巴里）等人， 1992，Curr. Topics Plant Physiol.(當代熱帶植物生理學）7，139_145,編碼矮牽?；?EPSPS 的基因 （Shah (沙阿）等人，1986, Science (科學）233,478-481)，編碼番茄 EPSPS 的基因 （Gasser (加塞）等人，1988, J. Biol. Chem.(生物化學雜志）263,4280-4289)，或 編碼蟋蟀草屬EPSPS的基因（W001/66704)。它還可以是如描述于例如EP 0837944、W0 00/66746、W000/66747或W0 02/26995中的突變的EPSPS。草甘膦耐受性植物還可以通 過表達一種基因獲得，該基因編碼如描述于美國專利號5, 776, 760和5, 463, 175中的草甘 膦氧化還原酶。草甘膦耐受性植物還可以通過表達一種基因獲得，該基因編碼如描述于例 如 TO 02/36782、W0 03/092360、W0 05/012515 和 W0 07/024782 中的草甘膦乙?；D移 酶。草甘膦耐受性植物還可以通過選擇包含以上提到基因的天然發(fā)生突變的植物來獲得， 如描述于例如W0 01/024615或W0 03/013226中。賦予草甘膦耐受性的EPSPS基因描述 于例如美國專利申請?zhí)?11/517, 991、10/739, 610、12/139, 408、12/352, 532、11/312, 866、 11/315, 678、12/421，292、11/400, 598、11/651，752、11/681，285、11/605, 824、12/468, 205、 11/760, 570、11/762, 526、11/769, 327、11/769, 255、11/943801 或 12/362, 774 中。賦予草甘 膦耐受性的其他基因，例如脫羧酶基因描述于例如美國專利申請11/588, 811、11/185, 342、 12/364, 724、11/185, 560 或 12/423, 926 中。
[0046] 其他除草劑耐受性基因可以編碼一種使除草劑脫毒的酶或者對抑制有抗性的突 變型谷氨酰胺合酶，例如描述于美國專利申請?zhí)?1/760,602中。一種此類有效脫毒酶是編 碼草丁膦乙酰轉移酶（例如來自鏈霉菌屬物種的bar或pat蛋白）的酶。草丁膦乙酰轉 移酶是例如描述于美國專利號 5, 561，236、5, 648, 477、5, 646, 024、5, 273, 894、5, 637, 489、 5, 276, 268、5, 739, 082、5, 908, 810 和 7, 112, 665 中。
[0047] 除草劑耐受性基因還可以賦予對抑制酶羥基苯丙酮酸雙氧化酶（HPH))的除草劑 的耐受性。羥基苯丙酮酸雙氧化酶是催化其中對羥基苯丙酮酸（HPP)被轉化成尿黑酸鹽的 反應的多種酶?？梢杂镁幋a天然發(fā)生的抗HPro酶的一種基因或編碼突變的或嵌合的HPro 酶的一種基因轉化對HPro抑制劑耐受的植物，如描述于W0 96/38567、W099/24585以及TO 99/24586、10 2009/144079、10 2002/046387、或舊 6,768,044 中。還可以通過用編碼某些 使得能夠形成尿黑酸鹽的酶的基因轉化植物獲得對HPH)抑制劑的耐受性，盡管被HPH)抑 制劑抑制了天然的HPro酶。這樣的植物和基因描述于W0 99/34008和W002/36787中。還可 以通過用除了一種編碼HPH)耐受酶的基因之外的一種編碼具有酶預苯酸脫氫酶（PDH)活 性的基因轉化植物來改進對HPro抑制劑的耐受性，如描述于W0 2004/024928中。另外，可 以通過向它們的基因組中添加編碼夠使HPH)抑制劑代謝或降解的酶（例如W02007/103567 和TO 2008/150473中示出的CYP450酶）的基因來使植物對HPH)抑制劑除草劑更具耐受 性。
[0048] 仍另外的除草劑耐受性基因編碼變體ALS酶（也稱為乙酰羥酸合成酶， AHAS)，如例如描述于Tranel (特瑞納）和Wright (賴特）（2002, Weed Science (《雜 草科學》）50:700-712)中，而且在美國專利號 5,605,011、5,378,824、5, 141,870、以 及5, 013, 659中。硫酰脲耐受植物以及咪唑啉酮耐受植物的生產描述于美國專利 號 5, 605, 011、5, 013, 659、5, 141，870、5, 767, 361、5, 731，180、5, 304, 732、4, 761，373、 5, 331，107、5, 928, 937、以及5, 378, 824、以及國際公開W0 96/33270中。其他的咪唑 啉酮耐受性基因還描述于例如 W0 2004/040012、W0 2004/106529、W0 2005/020673、W0 2005/093093、W0 2006/007373、W0 2006/015376、W0 2006/024351、以及 W0 2006/060634 中。另外的磺酰脲以及咪唑啉酮耐受性基因描述于例如W0 07/024782和美國專利申請?zhí)?61/288958 中。
[0049] 昆蟲抗性基因可以包括一種編碼序列，該序列編碼： 1) 一種來自蘇云金桿菌的殺昆蟲晶體蛋白或其殺昆蟲部分，例如由Crickmore (克 里克莫爾）等人列舉的殺昆蟲晶體蛋白（1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews (微生物學和分子生物學綜述），62:807-813),由（克里克莫爾）等人（2005)在蘇 云金桿菌毒素命名法中更新，聯(lián)機在： http://www. lifesci. sussex. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)，或其殺昆蟲部分， 例如 Cry 蛋白類 CrylAb、CrylAc、CrylB、CrylC、CrylD、CrylF、Cry2Ab、Cry3Aa、或 Cry3Bb 的蛋白或其殺昆蟲部分（例如EP1999141和W0 2007/107302)，或由如例如描述于美國專利 申請?zhí)?2/249,016中的合成基因編碼的此類蛋白；或 2) -種來自蘇云金桿菌的晶體蛋白或其部分，該部分在一個第二其他的來自蘇云金桿 菌的晶體蛋白或其部分的存在下是殺昆蟲的，例如由Cry34和Cry35晶體蛋白組成的二元 毒素（Moellenbeck(默勒本克）等人，2001，Nat. Biotechnol.(自然生物技術）19:668-72 ; Schnepf (史捏夫）等人 2006，Applied Environm. Microbiol.(應用與環(huán)境微生物 學）71，1765-1774)或由 CrylA 或 CrylF 蛋白和 Cry2Aa 或 Cry2Ab 或 Cry2Ae 蛋白組成的二 元毒素（美國專利申請?zhí)?2/214, 022和EP 0801079L 5);或 3) -種包括來自蘇云金桿菌的不同的殺昆蟲晶體蛋白的部分的雜交殺昆蟲蛋白， 例如以上1)的蛋白的雜交體或以上2)的蛋白的雜交體，例如由玉米事件M0N89034(W0 2007/027777)生產的 CrylA. 105 蛋白；或 4) 以上1)至3)中任一的蛋白，其中一些特別是1至10個氨基酸已經被另一氨基酸取 代以便獲得一個對目標昆蟲物種的更高殺昆蟲活性、和/或用以擴大所影響的目標昆蟲物 種的范圍、和/或由于在克隆或轉化期間引入編碼DNA的變化，例如在玉米事件M0N863或 M0N88017中的Cry3Bbl蛋白、或在玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；或 5) -種來自蘇云金桿菌或蠟樣芽胞桿菌的殺昆蟲分泌蛋白或其殺昆蟲部分，例如列舉 在： http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip. html 的營養(yǎng)期殺 昆蟲蛋白（VIP)，例如來自VIP3Aa蛋白類的蛋白；或 6) -種來自蘇云金桿菌或蠟樣芽胞桿菌的分泌蛋白，該分泌蛋白在來自蘇云金桿菌或 蠟樣芽胞桿菌的一個第二分泌蛋白的存在下是殺昆蟲的，例如由VIP1A和VIP2A蛋白構成 的二元毒素 （TO 94/21795);或 7) -種包括來自蘇云金桿菌或蠟樣芽胞桿菌的不同的分泌蛋白的部分的雜交殺昆蟲 蛋白，例如以上1)中的蛋白的一種雜交體或以上2)中的蛋白的一種雜交體；或 8) 以上5)至7)中任一的蛋白，其中一些特別是1至10個氨基酸已經被另一氨基酸取 代以便獲得一個對目標昆蟲物種的更高殺昆蟲活性、和/或用以擴大所影響的目標昆蟲物 種的范圍、和/或由于在克隆或轉化期間引入編碼DNA的變化（盡管仍然編碼一種殺昆蟲 蛋白），例如在棉花事件C0T102中的VIP3Aa蛋白；或 9) 一種來自蘇云金桿菌或蠟樣芽胞桿菌的分泌蛋白，該分泌蛋白在來自蘇云金桿菌的 一種晶體蛋白的存在下是殺昆蟲的，例如由VIP3和CrylA或CrylF構成的二元毒素（美國 專利申請?zhí)?1/126083和61/195019)，或由VIP3蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白 構成的二元毒素（美國專利申請?zhí)?2/214, 022和EP 08010791. 5); 10) 以上9)的一種蛋白，其中一些特別是1至10個氨基酸已經被另一氨基酸取代以便 獲得一個對目標昆蟲物種的更高殺昆蟲活性、和/或用以擴大所影響的目標昆蟲物種的范 圍、和/或由于在克隆或轉化期間引入編碼DNA的變化（盡管仍然編碼一種殺昆蟲蛋白）。
[0050] 如在此使用，"昆蟲抗性基因"，進一步包括轉基因，這些轉基因包含一個在表達時 生產雙鏈RNA的序列，該雙鏈RNA被植物昆蟲有害生物攝取時抑制這種昆蟲有害生物的生 長，如例如描述于 W02007/080126、W0 2006/129204、W0 2007/074405、W0 2007/080127 和 W0 2007/035650 中。
[0051] 非生物脅迫耐受性基因包括 1) 在植物細胞或植物中能夠減少聚（ADP核糖）聚合酶（PARP)基因的表達和/或活性 的一種轉基因，如描述于 WO 00/04173、TO/2006/045633、EP 04077984. 5 或 EP 06009836.5 中。 2) 能夠減少植物或植物細胞的PARG編碼基因的表達和/或活性的一種轉基因，如例如 描述于 W0 2004/090140 中。 3) 編碼一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成通路的植物功能性酶的一種轉基因， 這些酶包括煙酰胺酶、煙酰酸磷酸核糖基轉移酶、煙酸單核苷酸腺嘌呤轉移酶、煙酰胺 腺嘌呤二核苷酸合成酶或煙酰胺磷酸核糖基轉移酶，如例如描述于EP 04077624. 7、TO 2006/133827、PCT/EP07/002433、EP 1999263 或 TO 2007/107326 中。
[0052] 涉及碳水化合物生物合成的酶包括描述于以下的那些，例如：EP0571427、 WO 95/04826、EP 0719338、TO 96/15248、TO 96/19581、TO 96/27674、 TO 97/11188、 TO 97/26362、TO 97/32985、TO 97/42328、TO 97/44472、TO 97/45545、TO 98/27212、 TO 98/40503、TO 99/58688、TO 99/58690、TO 99/58654、TO 00/08184、TO 00/08185、 TO 00/08175、TO 00/28052、TO 00/77229、TO 01/12782、TO 01/12826、W002/101059、 W0 03/071860, W0 2004/056999, W0 2005/030942, W02005/03094U W0 2005/095632, W0 2005/095617, W0 2005/095619, W0 2005/095618, W0 2005/123927, W0 2006/018319, TO 2006/103107、TO 2006/108702、TO 2007/009823、TO 00/22140、TO 2006/063862、 TO 2006/072603、TO 02/034923、EP 06090134. 5、EP 06090228. 5、EP06090227. 7、EP 07090007. 1、EP 07090009. 7、TO 01/14569、TO 02/79410、TO 03/33540、TO 2004/078983、 TO 01/19975、TO 95/26407、W096/34968、TO 98/20145、TO 99/12950、TO 99/66050、TO 99/53072、 US 6,734,341、TO 00/11192、TO 98/22604、TO 98/32326、TO 01/98509、TO 01/98509, WO 2005/002359, US 5, 824, 790, US 6, 013, 86U W094/04693, WO 94/09144, WO 94/11520、WO 95/35026或WO 97/20936,或涉及多聚果糖，尤其是菊粉和果聚糖型的生 產的酶，如披露于 EP0663956、W0 96/01904、W0 96/21023、W0 98/39460、和 W0 99/24593 中，如披露于 WO 95/31553、US 2002031826、US 6, 284, 479、US 5, 712, 107、TO 97/47806、 TO 97/47807、WO 97/47808和WO 00/14249中的a -1，4-葡聚糖的生產，如披露于 TO 00/73422中的a-1，6分支a-1，4-葡聚糖的生產，如披露于例如WO 00/47727、TO 00/73422、EP 06077301. 7、US5, 908, 975 和 EP 0728213 的 alternan 的生產，如例如披露于 TO2006/032538、W0 2007/039314、W0 2007/039315、W0 2007/039316、JP 2006304779、和 W0 2005/012529中的透明質酸的生產。
[0053] 提供包括修復DNA的T-DNA和包括DSBI酶編碼基因的T-DNA的組合以及包括這 兩種DNA的雙T-DNA載體（Ti或Ri質粒）以及提供包括T-DNA的組合或包括如在以上方 法中所述的雙T-DNA載體的農桿菌細胞和菌株也是本發(fā)明的一個實施例。包括以上T-DNA 組合的植物或植物細胞也被涵蓋在本發(fā)明內。
[0054] 將領會的是，可以將本發(fā)明的方法應用于任何植物（被子植物綱或裸子植物綱）， 包括但不限于，棉花、卡諾拉（canola)、油菜（oilseed rape)、大豆、蔬菜、馬鈴薯、浮萍屬、 煙草屬、擬南芥、紫花苜蓿、大麥、菜豆、玉米、棉花、亞麻、粟、豌豆、油菜（rape)、水稻、黑麥、 紅花、高粱、大豆、向日葵、煙草、草坪草、小麥、蘆筍、甜菜和糖甜菜、西蘭花、卷心菜、胡蘿 卜、菜花、芹菜、黃瓜、茄子、生菜、洋蔥、油菜、辣椒、馬鈴薯、南瓜、蘿卜、菠菜、南瓜、甘蔗、番 茄、西葫蘆、扁桃、蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可、搜桃、椰子、蔓越橘、麥、葡萄、葡萄柚、番 石槽、稱猴桃、梓檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、橙、番木瓜、西番蓮果、桃、花生、梨、菠蘿、阿月 渾子、李子、覆盆子、草莓、橘子、核桃以及西瓜。
[0055] 提供根據(jù)本發(fā)明的方法產生的植物細胞、植物部分以及植物也是本發(fā)明的一個目 的，例如果實、種子、胚、生殖組織、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、花、纖維、維管組織、配 子體、孢子體、花粉以及小孢子，其特征在于它們在基因組中包括一種具體修飾（插入、取 代和/或缺失）。通過傳統(tǒng)育種方法產生的包括DNA修飾事件的植物的配子、種子、胚（合 子亦或體細胞的）、后代或雜合體也包括在本發(fā)明的范圍內。此類植物可以包含插入在靶 標序列處或替代靶標序列的感興趣的DNA或可以缺失一種具體的DNA序列（甚至單個核苷 酸），并且與其祖先植物的區(qū)別將僅在于交換后這一異源DNA或DNA序列的存在或被具體缺 失的序列（即預期的修飾）的不存在。
[0056] 在一些實施例中，本發(fā)明的植物細胞，即包括T-DNA組合的植物細胞以及根據(jù)本 發(fā)明的方法產生的包括預期的基因組修飾的植物細胞，可以是非繁殖細胞，或不能再生成 植物的植物細胞，或不能經由光合作用通過從無機物（例如水、二氧化碳以及無機鹽）合成 碳水化合物和蛋白質來維持其生活的植物細胞。
[0057] 通過在此描述的方法獲得的植物可以進一步通過傳統(tǒng)育種技術與其他植物雜交， 以獲得包括根據(jù)本發(fā)明獲得的靶向DNA插入事件的后代植物。以此方式，還可以分離出編 碼 DSBI 酶的 T-DNA。
[0058] 本發(fā)明進一步提供了一種用于產生以下植物的方法，該植物在基因組的預定義位 點處包括一種修飾，該方法包括使根據(jù)以上方法產生的植物與另一種植物或自身雜交并且 任選地收獲種子的步驟。
[0059] 本發(fā)明進一步提供了一種用于生產飼料、食物或纖維的方法，該方法包括提供根 據(jù)以上方法產生的植物群體并收獲種子的步驟。
[0060] 本發(fā)明進一步提供了一種用于生產棉籽或棉纖維的方法，該方法包括根據(jù)以上方 法種植棉花植物并將所述種子或所述纖維與所述植物分離的步驟。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的植物和種子可以進一步用化學化合物處理，例如如果對這樣的一種 化學品具有耐受性。
[0062] 因此，本發(fā)明還提供了一種種植根據(jù)以上方法產生的植物的方法，該方法包括向 所述植物或所述植物在其中生長的基質施用一種化學品的步驟。
[0063] 進一步提供了一種在大田中種植植物的方法，該方法包括向根據(jù)以上方法產生的 植物施用一種化學化合物的步驟。
[0064] 還提供了一種生產處理的種子的方法，該方法包括向根據(jù)上述方法產生的植物的 種子施用一種化學化合物（例如上述化學品）的步驟。
[0065] 如在此使用，"包括"將被解釋為指定如提及的陳述的特征、整體、步驟或組分的存 在，但是并不預先排除一個或多個特征、整體、步驟或組分、或它們的組的存在或添加。因 此，例如一種包括一個核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白可以包括比實際引用的一個序 列更多的核苷酸或氨基酸，即被包含在一個更大的核酸或蛋白中。一種包括功能上或結構 上定義的DNA區(qū)域的嵌合基因可以包括另外的DNA區(qū)域等。
[0066] 如在此使用，"植物部分"包括任何植物器官或植物組織，包括但不限于，果實、種 子、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、花、配子體、孢子體、花粉以及小孢子。
[0067] 出于本發(fā)明的目的，兩個相關的核苷酸或氨基酸序列的"序列一致性"（表示為一 個百分數(shù)）是指在這兩個最佳比對序列中的具有相同殘基的位置的數(shù)目（X100)除以所比 較的位置的數(shù)目。一個缺口（即一個比對中的一個位置，其中一個殘基在一個序列中存在 但是在另一個序列中不存在）被視為具有不相同殘基的一個位置。通過Needleman(尼德 曼）和Wunsch (翁施）算法來實施這兩個序列比對（Needleman (尼德曼）和Wunsch (翁 施）1970)。可以使用標準軟件程序（例如是部分的威斯康星軟件包版本10. 1(遺傳學計算 機組，麥迪遜（Madison)、威斯康星州（Wisconsin),美國）的缺口（GAP),使用具有空位創(chuàng)建 罰分50和空位延伸罰分3的默認評分矩陣）方便地實施以上的計算機輔助序列比對。
[0068] 如在此使用，核酸或核苷酸是指DNA和RNA兩者。DNA還包括cDNA和基因組DNA。 核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，并且可以用化學方法合成或通過體外或甚至體內生物表 達而產生。
[0069] 將清楚的是，每當通過提及相應DNA分子的核苷酸序列來定義RNA分子的核苷酸 序列時，該核苷酸序列中的胸腺嘧啶（T)應當由尿嘧啶（U)替換。是否指稱DNA分子或RNA 分子將從本申請的上下文顯而易見。
[0070] 以下非限制性實例描述了一種雙T-DNA載體的構建，該載體包括編碼DSBI酶的 T-DNA和包含修復DNA的T-DNA，以及它們用于有效產生具有靶向基因組修飾的植物的用 途。
[0071] 除非在實例中另行說明，否則所有的重組DNA技術是根據(jù)如描述于Sambrook(薩 姆布魯克）等人（1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克?。簩嶒炇沂?冊），第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實驗室出版社），紐約和在 Ausubel(奧蘇貝爾）等人，（1994)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學 現(xiàn)行方案），Current Protocols(現(xiàn)行方案），美國中卷1和卷2的標準方案來進行的。用于 植物分子工作的標準材料和方法描述于由R. D. D. Croy (克羅伊）撰寫的Plant Molecular Biology Labfax(植物分子生物學實驗）（1993)中，由 BIOS Scientific Publications Ltd (UK) (BIOS科學出版有限公司（英國））和 Blackwell Scientific Publications, UK (布 萊克威爾科學出版物，英國）聯(lián)合出版。其他用于標準分子生物技術的參考文獻包括 Sambrook(薩姆布魯克）和 Russell (拉塞爾）（2001)，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆：實驗手冊），第三版，冷泉港實驗室出版社，紐約，Brown (布朗）（1998)， Molecular Biology LabFax (分子生物學實驗），第二版，Academic Press (學術出版社） (英國）的卷I和Π 。用于聚合酶鏈式反應的標準材料和方法可以在Dieffenbach(迪 芬巴赫）和 Dveksler (德?？滤紭罚?995)，PCR Primer :A Laboratory Manual (PCR 引 物：實驗室手冊），冷泉港實驗室出版社中，以及在McPherson(麥克弗森）等人（2000)， PCR-Basics:From Background 至 Bench (PCR 基礎：從背景到平臺），第一版，Springer Verlag(施普林格），德國中找到。
[0072] 在此提到的所有專利、專利申請和出版物，都出于所有目的通過引用以其全文結 合在此。
[0073] 包含在命名為"BCS12-2004-W01_ST25"的文件中，為54千字節(jié)（大小如在微軟視 窗操作系統(tǒng)（Microsoft Windows⑧）中所測量），包含SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:11的 11個序列的序列表通過電子提交特此歸檔并且通過引用結合在此。
[0074] 將參照在此描述的這些實例進一步描述本發(fā)明；然而，應明白的是，本發(fā)明并不局 限于這些實例。 序列表
[0075] 貫穿本說明書和實例，對以下序列進行了引用：
[0076] SEQ ID NO. 1 :雙 T-DNA 載體 pCTV231 的核苷酸序列
[0077] SEQ ID N0. 2 :雙 T-DNA 載體 pTCV237 的核苷酸序列
[0078] SEQ ID N0. 3:C0IV6 識別序列
[0079] SEQ ID NO. 4 :包括C0T5/6識別位點的棉花基因組序列
[0080] SEQ ID NO. 5 :PCR 引物 IB527
[0081] SEQ ID Ν0· 6 :PCR 引物 IB616
[0082] SEQ ID NO. 7 :PCR 引物 IB589
[0083] SEQ ID NO. 8 :PCR 引物 VDS382
[0084] SEQ ID NO. 9 :PCR 引物 IB588
[0085] SEQ ID NO. 10 :PCR 引物 IB303
[0086] SEQ ID NO. 11 :PCR 引物 IB624 實施例 實施例1 :載體構建
[0087] 使用標準分子生物學技術，產生雙T-DNA載體pCV231 (SEQ ID NO. 1)，該載體在 T-DNA邊界之間包括含有2mEPSPS和Pf-HPTO-W336的修復DNA，并且在另一對T-DNA邊界 之間包括大范圍核酸酶C0T-5/6基因（圖la): ?修復 T-DNA : 〇 RB(nt 189至222):來自根癌農桿菌的T-DNA的右邊界重復序列（Zambryski (賽姆 布拉斯），1988)。 〇 3' histonAt(nt 928至262):包括擬南芥的組蛋白H4基因的3'非翻譯區(qū)的序列 (Chabout6 (查布特）等人，1987)。 〇 hppdPfW336-lPa(nt 2021至945):通過用色氨酸替代氨基酸甘氨酸336而修飾的 熒光假單胞菌菌株A32的4-羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因的編碼序列（Boudec (布達科）等 人，1999)，適于棉花密碼子使用。 〇 TPotpY-lPa(nt 2393至2024):最佳化轉運肽衍生物的編碼序列（位置55變?yōu)?Tyr)，包含玉米（Zea mays，corn)和向日葵（Helianthus annuus，sunflower)的 RuBisCO 小亞基基因的序列（Lebrun (萊布倫）等人，1996)，適于棉花密碼子使用。 〇 PCsVMV XYZ(2914至2402):包括木薯脈花葉病毒的啟動區(qū)的序列（Verdaguer(維達 格爾）等人，1996)。 〇 Ph4a748 (nt 3013-3929):包括擬南芥的組蛋白H4基因的啟動區(qū)的序列 (Chabout6 (查布特）等人，1987)。 〇內含子lh3At(nt 3969至4434):擬南芥的組蛋白H3. III變體的基因 II的第一內含 子（Chaubet (考貝特）等人，1992)。 〇 TPotpC(nt 4448至4819):最佳化轉運肽的編碼序列，包含玉米（Zea mays, corn)和 向日葵（Helianthus annuus，sunflower)的RuBisCO小亞基基因的序列（Lebrun(萊布倫） 等人，1996)。 〇 2mepsps(nt 4820至6157):玉米（Zea mays，corn)的雙突變型5-烯醇式丙酮酸莽 草酸-3-磷酸合酶基因的編碼序列（Lebrun (萊布倫）等人，1997)。 〇 3' histonAt(nt 6178至6844):包括擬南芥的組蛋白H4基因的3'非翻譯區(qū)的序列 (Chabout6 (查布特）等人，1987)。 〇 LB(nt 6929至6952):來自根癌農桿菌的T-DNA的左邊界重復序列（Zambryski (賽 姆布拉斯），1988)。 ? C0T5/6大范圍核酸酶T-DNA : 〇 LB(nt 9211-9188):來自根癌農桿菌的T-DNA的左邊界重復序列（Zambryski (賽姆 布拉斯），1988)。 〇 P35S2c (片段）（9236 至 9594) :P35S2c (片段）比 P35S2c 短 123bp。 〇 P35S2c(nt 9236-10078):包括來自花椰菜花葉病毒35S轉錄物的啟動區(qū)的序列。 〇 C0T-5/6-SC(nt 10085 至 11167):來自 Precision BioScience (精密生物科學）的 識別C0T-5/6識別位點5' TAAAATTATTTACAAGTGTTTA的單鏈的定制的大范圍核酸酶。 〇 S^os (nt 11168 至 11427) ：sequence including the untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al.，1982)包括 來自pTiT37的T-DNA的胭脂堿合酶基因的3'非翻譯區(qū)的序列（D印icker (戴皮克爾）等 人，1982)。 o RB(nt 11517-11493):來自根癌農桿菌的T-DNA的右邊界重復序列（Zambryski (賽 姆布拉斯），1988)。
[0088] 使用這一 pTCV231 載體轉化農桿菌菌株 A5891( = C58ClRif (pTiEHAlOl))。 實施例2 :使用農桿菌轉化棉花
[0089] 將在其核基因組中包含C0T5/6靶標序列5' TAAAATTATTTACAAGTGTTTA(SEQ ID NO. 3)的靶標株系的脆弱棉花胚性愈傷組織（EC)收集在100基質上并且在具有100 μ Μ乙 酰丁香酮（AS)的Μ100基質（pH 5. 2)中的5Χ 108細胞/ml的農桿菌懸液液中浸沒20'。
[0090] 在黑暗中、在24°C下、在具有1/2濃度的MS鹽（pH 5.2)的M100上與100 μ M AS和 100mg/L L-半胱氨酸共培養(yǎng)3天后，將EC作為小堆轉移在M100基質（pH 5. 8)上，250mg/L 羧噻吩青霉素（triacillin)和ImM草甘膦作為選擇劑并且在弱光下、在28°C下進行孵育。 實施例3 :靶向插入事件的鑒定
[0091] 在這一基質（具有125或250mg/L羧噻吩青霉素和ImM草甘膦的M100(pH 5. 8)) 上的若干繼代培養(yǎng)后，選擇草甘膦抗性愈傷組織。在以此方式獲得的575個草甘膦抗性愈 傷組織上，使用Expand High Fidelity PCR System(羅氏（Roche))進行高通量PCR篩選， 以鑒定候選堆疊（stacked)事件（參見圖1)，從而鑒定了 8個假定的祀向插入事件（? 1. 4% )，即修復DNA已經被整合進靶標C0T5/6識別位點的事件（表1)。

【權利要求】
1. 一種用于在一個預選位點處修飾植物細胞的基因組的方法，該方法包括以下步驟： a. 使一種植物細胞與一種細菌接觸，該細菌能夠指導來自所述細菌的確定的DNA分子 轉移進所述植物細胞的基因組中，所述細菌包括 i. 一種第一確定的DNA分子，該分子包括一種編碼植物功能性DSBI酶的嵌合基因，所 述DSBI酶能夠在位于所述預選位點處或其附近的識別位點處識別并誘導雙鏈DNA斷裂，所 述嵌合基因包括以下可操作連接的元件：
1. 一種植物可表達的啟動子；
2. -個編碼DSBI酶的DNA區(qū)域；
3. -個植物功能性3'終止和多聚腺苷酸化區(qū)域；以及 ii. 一種第二確定的DNA分子，該分子包括一種用作修復所述雙鏈DNA斷裂的模板的修 復DNA分子； b. 選擇一種植物細胞，其中所述修復DNA已經被用作修復該雙鏈DNA斷裂的模板，所述 雙鏈DNA斷裂的所述修復導致在所述預選位點處的所述基因組的修飾，其中所述修飾選自
1. 至少一個核苷酸的替代； ii. 至少一個核苷酸的缺失； iii. 至少一個核苷酸的插入；或 iv. i. -iii.的任何組合。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述兩種確定的DNA分子被包括在同一載體中。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其中所述確定的DNA分子是一種T-DNA分子。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述細菌選自下組，該組由以下各項組 成：農桿菌屬，根瘤菌屬，中華根瘤菌屬，中慢生根瘤菌屬，葉桿菌屬，蒼白桿菌屬，慢生根瘤 菌屬，固氮菌屬，菱形藻屬，克雷伯氏菌屬以及紅螺菌屬。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述細菌是根癌農桿菌。
6. 如權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述植物細胞被包括在一種來自植物 種子、幼苗、下胚軸、子葉、不成熟的合子胚、葉、花藥、花瓣、胚珠、根、分生組織、干細胞、葉 柄、愈傷組織或細胞懸浮液的外植體中，優(yōu)選來自下胚軸或胚性愈傷組織的外植體中，并且 該外植體與所述細菌接觸。
7. 如權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述DSBI酶是非天然發(fā)生的。
8. 如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述修復DNA分子包括一種感興趣的 DNA分子。
9. 如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述感興趣的DNA分子包括一個或多 個感興趣的植物可表達的基因。
10. 如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述感興趣的植物可表達的基因選自 下組：除草劑耐受性基因，昆蟲抗性基因，疾病抗性基因，非生物脅迫抗性基因，涉及油類生 物合成、碳水化合物生物合成的酶，涉及纖維強度或纖維長度的酶，涉及次級代謝產物的生 物合成的酶。
11. 如權利要求1至10中任一項所述的方法,其中所述修復DNA分子包括一個或兩個 側翼于感興趣的DNA分子的側翼核苷酸序列，所述一個或兩個側翼核苷酸序列與所述預選 位點的上游和/或下游基因組DNA具有足夠同源性以允許與所述上游和/或下游DNA區(qū)域 重組。
12. 如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述修復DNA分子由兩個側翼核苷酸 序列組成，所述側翼核苷酸序列之一與所述預定義位點的上游DNA區(qū)域具有足夠同源性， 另一側翼核苷酸序列與所述預定義位點的下游DNA區(qū)域具有足夠同源性，以允許在所述側 翼核苷酸序列與所述上游和下游DNA區(qū)域之間的重組。
13. 如權利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述第一和/或第二確定的DNA分 子進一步包括一種可選擇的或可篩選的標記基因。
14. 如權利要求1至13中任一項所述的方法，包括另外的使所述選擇的植物細胞生長 為植物的步驟。
15. 如權利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述DSBI酶編碼基因和所述修飾遺 傳地在再生自所述選擇的植物細胞的植物的后代中分離。
16. 如權利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述植物細胞或植物是一種棉花植 物細胞或棉花植物。
17. -種DNA載體，包括如在權利要求1至13任一項中所描述的一種第一和一種第二 確定的DNA分子。
18. 如權利要求17所述的DNA載體，其中所述確定的DNA分子能夠被一種細菌轉移進 植物細胞的基因組中。
19. 一種細菌，能夠指導來自所述細菌的確定的DNA分子轉移進植物細胞的基因組中， 所述細菌包括如在權利要求1至13任一項中所描述的第一和第二確定的DNA分子。
20. 如權利要求19所述的細菌，該細菌選自下組，該組由以下各項組成：農桿菌屬，根 瘤菌屬，中華根瘤菌屬，中慢生根瘤菌屬，葉桿菌屬，蒼白桿菌屬，慢生根瘤菌屬，固氮菌屬， 菱形藻屬，克雷伯氏菌屬以及紅螺菌屬。
21. 如權利要求19或20所述的細菌，該細菌是根癌農桿菌。
22. -種根據(jù)權利要求1至16中任一項所述的方法產生的在基因組的預定義位點處包 括一種修飾的植物細胞或植物，或其植物部分、纖維、種子或繁殖材料。
23. 如權利要求18或19所述的DNA載體或如權利要求19至22中任一項所述的細菌 用于在預選位點處修飾植物細胞的基因組的用途。
【文檔編號】C12N15/82GK104245940SQ201380021299
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年4月22日 優(yōu)先權日:2012年4月23日
【發(fā)明者】K·達倫 申請人:拜爾作物科學公司