Hev測(cè)定的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了同時(shí)擴(kuò)增HEV的基因型1,2,3和/或4的方法，其包括用與HEV的5’UTR區(qū)部分重疊的單一的非-簡(jiǎn)并正向引物和至少一種反向引物擴(kuò)增HEV的基因型1,2,3和/或4。
【專利說明】HEV測(cè)定
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測(cè)HEV感染的診斷試驗(yàn)，引物組，寡核苷酸組和試劑盒。
[0002]HEV感染引起戊型肝炎（h印atitis E)，一種急性病。HEV是無包被的、單鏈、正義 RNA病毒，其屬于肝病毒科（Hepeviridae)。引起人類感染的有四種主要的基因型，基因型 1，2, 3和4。HEV診斷試驗(yàn)對(duì)于已經(jīng)排除了引起急性肝炎的其他因素的人們而言至關(guān)重要。
[0003] HEV的不同區(qū)域已在基于核酸的HEV試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)用。通常使用HEV的0RF2和 0RF3,通過核酸擴(kuò)增檢測(cè)HEV。JP04080995和JP04127722中提議將具有多簡(jiǎn)并位點(diǎn)的簡(jiǎn)并 引物用于嵌套引物擴(kuò)增法，所述方法基于部分定位于的5' UTR區(qū)的引物的。
[0004] 發(fā)明概述
[0005] 本發(fā)明涉及同時(shí)擴(kuò)增可能存在于生物樣品中的HEV基因型1，2, 3和/或4的方法， 該方法包括步驟：
[0006] (a)分離生物樣品中的核酸；
[0007] (b)利用一種非-簡(jiǎn)并正向引物和至少一種非-簡(jiǎn)并反向引物擴(kuò)增步驟（a)中分 離的核酸，其中，所述的正向和反向引物能擴(kuò)增JEV的基因型1，2, 3和4，
[0008] 其中，所述正向引物的核酸序列包含SeqIDN0:6,所述的一種或以上反向引物的 核酸序列包含選自SEQIDNO:7-14的序列。
[0009] -方面，本發(fā)明涉及引物組，其包括正向引物和至少一種反向引物，其中，所述正 向引物的核酸序列包含SEQ ID N0:6,其中至少一種反向引物的核酸序列，或所述反向引物 選自 SEQ ID NO:7-14。
[0010] 一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸組，其中，所述組由上述的引物組和一種探針組成， 其中，所述的探針包含SEQ ID NO: 15-19或其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸。
[0011] 一方面，本發(fā)明涉及上述的引物組或寡核苷酸組在同時(shí)檢測(cè)可能存在于生物樣品 中的基因型1，2, 3和/或4中的用途。
[0012] 一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含依賴模板的DNA聚合酶，核苷酸，以及上述的 引物組或寡核苷酸組。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述
[0014] 圖1提供由液體樣品分離核酸的工藝流程。
[0015] 發(fā)明詳述
[0016] 本發(fā)明涉及同時(shí)擴(kuò)增可能存在于生物樣品中的HEV基因型1，2, 3和/或4的方法， 該方法包括步驟：
[0017] (a)分離生物樣品中的核酸；
[0018] (b)利用一種非-簡(jiǎn)并正向引物和至少一種非-簡(jiǎn)并反向引物擴(kuò)增步驟（a)中分 離的核酸，其中，所述的正向和反向引物能擴(kuò)增JEV的基因型1，2, 3和4，
[0019] 其中，所述正向引物的核酸序列包含SeqIDN0:6,一種或以上反向引物的核酸序 列包含選自SEQIDNO:7-14的序列。
[0020] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列包含Seq ID N0:6,所述的至少 一種反向引物的核酸序列選自SEQ ID N0:7-14。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引物 的核酸序列包含SEQ ID N0:6,所述兩種反向引物的混合物的核酸序列包含SEQ ID NO: 13 和SEQ ID NO: 14。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID N0:6組 成，所述反向引物的核酸序列包含SEQ ID N0:7。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引物 的核酸序列由SEQ ID N0:6組成，所述反向引物的核酸序列包含SEQ ID NO: 13。在另一個(gè) 具體實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6組成，所述反向引物的核酸序列 包含 SEQ ID NO: 11。
[0021] 本發(fā)明的方法的有益之處在于,能夠在單一反應(yīng)中同時(shí)、有效地?cái)U(kuò)增HEV的基因 型 1，2, 3 和 4。
[0022] -個(gè)具體實(shí)施方案中，所述核酸通過結(jié)合于固相被分離。
[0023] -個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法還包括使經(jīng)擴(kuò)增的核酸與探針在足以使得所述的 探針結(jié)合于經(jīng)擴(kuò)增的核酸的條件下接觸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的探針包含SEQ ID NO: 15-19或25的核酸序列或其互補(bǔ)序列的中的至少22-35個(gè)連續(xù)的核苷酸。在一個(gè)具體 實(shí)施方案中，所述探針的核酸序列由選自SEQ ID N0:15-19或25或其互補(bǔ)序列的序列組 成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述探針的核酸序列由選自SEQ ID N0:15-18或25或其互補(bǔ) 序列的序列組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的探針包含與所述探針的5'端偶聯(lián)的熒光 團(tuán)，和猝滅劑，其中，所述的熒光團(tuán)和猝滅劑之間的間隔包含至少9個(gè)核苷酸。
[0024] 本發(fā)明的方法的其他具體實(shí)施方案如下所述。
[0025] 本發(fā)明還涉及同時(shí)擴(kuò)增可能存在于生物樣品中的HEV基因型1，2, 3和/或4的方 法，該方法包括步驟：
[0026] (a)分離所述樣品中的核酸；
[0027] (b)利用一種非-簡(jiǎn)并正向引物和至少一種非-簡(jiǎn)并反向引物擴(kuò)增步驟（a)中分 離的核酸，其中，所述的正向和反向引物能擴(kuò)增JEV的基因型1，2, 3和4，
[0028] 其中，所述正向引物的核酸序列包含SeqIDN0:6,一種或以上反向引物的核酸序 列包含選自SEQIDNO:7-14的序列，和
[0029] (c)檢測(cè)在步驟（b)中獲得的、經(jīng)擴(kuò)增的核酸作為生物樣品中存在HEV的基因型 1，2, 3和4的至少一種的指示。
[0030] 本申請(qǐng)所用的術(shù)語"檢測(cè)"指對(duì)與存在所述經(jīng)擴(kuò)增的核酸相關(guān)聯(lián)的信號(hào)的檢測(cè)。 檢測(cè)可以是定量的或定性的。對(duì)經(jīng)擴(kuò)增的核酸的檢測(cè)指示在生物樣品中存在JlEV基因型 1，2,3和/或4的至少一種。
[0031] 本申請(qǐng)所用的術(shù)語"同時(shí)檢測(cè)"指在單一反應(yīng)混合物中檢測(cè)HEV不同基因型的方 法設(shè)計(jì)。這需要所述方法中所用的引物和探針序列能夠同時(shí)地產(chǎn)生針對(duì)可能存在于所述樣 品中的全部待測(cè)基因型的合理檢測(cè)信號(hào)。當(dāng)然，如果僅有一種基因型存在于所述樣品中，該 方法將僅檢測(cè)這一種基因型，即使其能夠在單一反應(yīng)中檢測(cè)GT1，GT2, GT3和/或GT4中的 一種以上。
[0032] 同時(shí)檢測(cè)幾種基因型（以下簡(jiǎn)稱作GT)常常需要使用簡(jiǎn)并引物和探針，以保證全 部待檢測(cè)的基因型被檢測(cè)出來，除非是有高度保守區(qū)域，其適合于設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增的非-簡(jiǎn) 并引物和探針、允許全部基因型被檢測(cè)出。這種區(qū)域并不是總能被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn) 了非5' UTR的區(qū)域，如適合設(shè)計(jì)用于檢測(cè)HEV的測(cè)定的衣殼區(qū)。以上引述的現(xiàn)有技術(shù)建議 使用來自5' UTR區(qū)的、用于嵌套引物法的簡(jiǎn)并引物，其中一些包含3個(gè)以上簡(jiǎn)并位點(diǎn)，并且 是高度簡(jiǎn)并的。對(duì)高度簡(jiǎn)并引物的要求以及必需實(shí)施嵌套PCR顯示現(xiàn)有技術(shù)中所公開的基 于5' UTR檢測(cè)的方法，不如應(yīng)用來自0RF2或0RF3的保守區(qū)的引物序列的方法靈敏。本申 請(qǐng)所用的術(shù)語"5' UTR"相應(yīng)于靶序列，引物和擴(kuò)增子，其至少部分地與HEV的所述5' UTR 序列重置。
[0033] 術(shù)語"生物樣品"指能夠用于診斷測(cè)定靶核酸的材料，其通常衍生自生物源。在一 些具體實(shí)施方案中，所述的生物樣品來自人，是體液。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所 述的生物樣品是人的血液，血漿，血清，尿，唾液，汗液，拭子，移吸的糞便，或脊髓液。所述的 生物樣品也可以是能從中提取核酸的組織。
[0034] 本申請(qǐng)所用的術(shù)語"非-簡(jiǎn)并"指其中的每個(gè)位置由單一的核苷酸，即A，G，T或C 定義的引物或探針核酸。所述的非-簡(jiǎn)并引物或探針是通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法化學(xué)合 成的，并且可以是經(jīng)純化的。
[0035] 本申請(qǐng)所用的術(shù)語"簡(jiǎn)并"指其中的具體位置不是由單一的，特定核苷酸定義的引 物或探針核酸。因此，在這種簡(jiǎn)并位置中，所述的引物或探針序列可以是至少兩個(gè)不同的 核苷酸中的一個(gè)。這種位置通常代表靶核酸基因型中的差異。簡(jiǎn)并序列也可以表示多個(gè) 非-簡(jiǎn)并的單個(gè)序列的混合物，為本發(fā)明的目的，在至少兩個(gè)位置中有差異。
[0036] 使用非_簡(jiǎn)并引物和探針具有若干有益之處。一個(gè)有益之處在于使用非_簡(jiǎn)并引 物檢測(cè)四種基因型，在簡(jiǎn)并引物組合物中不同序列之間競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致的錯(cuò)誤引導(dǎo)（mispriming) 的風(fēng)險(xiǎn)，以及擴(kuò)增的靈敏度均有改善。因此，為了鑒定多個(gè)基因型使用至少單一的非-簡(jiǎn)并 正向或反向引物是可取的。在所述正向引物是非-簡(jiǎn)并的情況下，所述的互補(bǔ)引物--反 向引物可包含一種非-簡(jiǎn)并引物，或者當(dāng)所述反向引物是非_簡(jiǎn)并的情況下，所述的正向引 物可包含一種非-簡(jiǎn)并引物。
[0037] 本申請(qǐng)所用的術(shù)語"引物"和"探針"指寡核苷酸序列。在本發(fā)明的上下文中，術(shù) 語"寡核苷酸"指由大量的核苷酸以它們的單體單元形式形成的組分。術(shù)語"寡核苷酸"還 包括經(jīng)修飾的寡核苷酸，即所述的引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非-核苷酸化合 物。術(shù)語"引物"還指在擴(kuò)增反應(yīng)中所用的、與靶序列退火的寡核苷酸。術(shù)語"探針"還指 與靶核酸雜交的寡核苷酸，或用于定性或定量檢測(cè)目的的擴(kuò)增子。
[0038] 就探針而言，修飾可包括染料，如FAM，HEX, JA270, CY5, CY5. 5, CoiiMarin等，和/ 或猝滅劑分子。染料分子可能與接頭相偶聯(lián)。但是，此類染料也可能存在于引物中。其他 示例性的修飾包括3'端的磷酸基團(tuán)。這種染料分子和/或猝滅劑分子可用于靶定核酸的 檢測(cè)。
[0039] 對(duì)引物通常的修飾包括對(duì)其3'核苷酸的修飾以防止形成非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，如 引物二聚體。此類修飾是本領(lǐng)域所公知的，包括作為非限定性示例的叔丁基芐基-dA或-丁 基芐基-dC。此類修飾也包括在術(shù)語"引物"中。
[0040] 由此，可以理解本申請(qǐng)所用的術(shù)語"正向引物"指引發(fā)核酸正義鏈的引物，其允許 聚合酶沿著靶核酸的一條鏈的方向延伸，可以理解術(shù)語"反向引物"指引發(fā)核酸反義鏈的引 物，其允許聚合酶沿著所述靶核酸的互補(bǔ)鏈的方向延伸，由此獲得一端具有正向引物序列 及其互補(bǔ)序列，在另一端具有反向引物序列及其互補(bǔ)序列的雙鏈擴(kuò)增子。在起始進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄（RT)步驟的反應(yīng)中，所述的反向引物也作為用于反轉(zhuǎn)錄的RT引物。RT-PCR是本領(lǐng)域公 知的技術(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中進(jìn)行了 RT步驟。
[0041] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用了一種非-簡(jiǎn)并正向引物和至少一種非-簡(jiǎn)并反向 引物。作為選擇地，使用了一種非-簡(jiǎn)并反向引物和至少一種非-簡(jiǎn)并正向引物。在另一 具體實(shí)施方案中，使用了一種非-簡(jiǎn)并正向引物和兩種非-簡(jiǎn)并反向引物的混合物。作為 選擇地，使用了兩種非-簡(jiǎn)并正向引物的混合物和一種非-簡(jiǎn)并反向引物。在一個(gè)具體實(shí) 施方案中，所述的兩種非-簡(jiǎn)并引物僅在單一核苷酸位置不同。其有益之處在于，可以在單 一反應(yīng)中彌補(bǔ)（be compensated for)不同基因型核苷酸序列中的差異，并將所述基因型檢 測(cè)出來，同時(shí)避免使用具有一個(gè)以上簡(jiǎn)并位置的引物的不利之處。
[0042] 由此，可以理解，如果使用一種正向的和至少一種反向引物，則使用了單一的正向 引物序列，同時(shí)可以使用一種或以上的反向引物序列。如果使用兩種反向引物，則使用兩種 反向引物的混合物。作為選擇地，如果使用一種反向引物和至少一種正向引物，則使用了單 一的反向引物，同時(shí)可以使用一種或以上的正向引物。如果使用兩種反向引物，則使用兩種 反向引物的混合物。
[0043] 術(shù)語"擴(kuò)增"指由靶核酸產(chǎn)生大量的核酸分子，其中，引物與靶核酸分子上的特定 位點(diǎn)雜交，以提供聚合酶延伸的起始位點(diǎn)。擴(kuò)增可通過本領(lǐng)域中任何公知的方法進(jìn)行，例如 但不限于：標(biāo)準(zhǔn)的PCR，長(zhǎng)PCR(long PCR)，熱起動(dòng)PCR，qPCR，RT-PCR和等溫?cái)U(kuò)增。一個(gè)PCR 的實(shí)施方案是實(shí)時(shí)PCR，其是本領(lǐng)域公知的，將擴(kuò)增和檢測(cè)相結(jié)合。
[0044] 在所述方法的一個(gè)方面中，正向引物的核酸序列選自SEQ ID N0:l_6,至少一種 反向引物的核酸序列選自SEQ ID N0:7-14。這些正向和反向引物的不同組合所得的命中 率（hit rates)如表3中所示。表5和表8示出本申請(qǐng)中所描述的、用于檢測(cè)HEV基因型 GT1，GT2, GT3和GT4的引物和探針序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列 是SEQ ID NO: 1，2, 3, 4或6。在更具體的實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列是SEQ ID N0:2, 3, 4或6。在更具體的實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列是SEQ ID N0:3, 4或6。 在更具體的實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列是SEQ ID N0:6。
[0045] 在具體的實(shí)施方案中，所述反向引物的核酸序列由SEQ ID N0:7, 8, 9, 10, 11，13或 14組成。在更具體的實(shí)施方案中，所述反向引物的核酸序列是SEQ ID N0:8, 9, 10, 11，13或 14。在更具體的實(shí)施方案中，所述反向引物的核酸序列是SEQ ID N0:9, 10, 11，13或14。在 更具體的實(shí)施方案中，所述兩種反向引物的核酸序列由SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14組 成，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引 物的核酸序列由SEQ ID N0:6組成，所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO: 11組成。在另 一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6組成，所述反向引物的核酸 序列由SEQ ID NO: 13組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID N0:6組成,所述反向引物的核酸序列由SEQ ID N0:7組成。
[0046] -方面，可能存在的GT1，GT2，GT3和/或GT4中的至少兩個(gè)可在單一反應(yīng)中被同 時(shí)檢測(cè)出來。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，至少可能存在的GT1，GT2, GT3和GT4可在單一反應(yīng) 中被同時(shí)檢測(cè)出來。在另外的具體實(shí)施方案中，可能存在的GT1，GT2, GT3和GT4可在單一 反應(yīng)中被同時(shí)檢測(cè)出來。
[0047] -方面，所述的方法還包含分離所述的核酸，其中，在步驟（b)之前分離所述核 酸，其中，經(jīng)分離的核酸在步驟（b)中進(jìn)行擴(kuò)增。
[0048] 術(shù)語"分離核酸"指從細(xì)胞或病毒顆粒釋放核酸，已知稱為裂解，然后富集所述的 核酸。這種分離使得靶核酸與用于擴(kuò)增的引物的接觸幾率提高，還可去除可能存在于樣品 中的后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的潛在抑制劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過與固相結(jié)合分離所述核酸。 一種有用的結(jié)合核酸的過程需要選擇性地使核酸結(jié)合于離液鹽溶液中的結(jié)合顆粒（如磁 性顆粒）的玻璃表面，并將所述的核酸與污染物，例如瓊脂糖，蛋白質(zhì)或細(xì)胞碎片分離。在 一些具體實(shí)施方案中，所述顆粒的玻璃使利用WO 96/41811中所述的凝膠溶液（gel sol) 加工，然后干燥并壓縮。
[0049] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法在步驟（b)和（C)之間，還包括（bl)使經(jīng)擴(kuò)增 的核酸與探針，在足以使得所述探針與經(jīng)擴(kuò)增的核酸相結(jié)合的條件下，接觸，
[0050] 并且在步驟（c)中的檢測(cè)包含
[0051] 檢測(cè)經(jīng)擴(kuò)增的靶核酸與所述探針的結(jié)合產(chǎn)物，作為所述生物樣品中存在HEV基因 型1，2, 3和/或4中的至少一種的指示。
[0052] 在具體的實(shí)施方案中，所述探針具有非-簡(jiǎn)并核酸序列。這也具有避免雜交過程 中的錯(cuò)誤引發(fā)或簡(jiǎn)并探針的探針分子之間的干擾的有益效果，并使得檢測(cè)的靈敏度得以提 高。所述的探針必需能夠與利用正向和反向引物擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增子的序列雜交。在具體的 實(shí)施方案中，所述的探針可以同不與引物序列重疊的擴(kuò)增子的序列雜交?？梢岳斫馑龅?擴(kuò)增子指利用正向和反向引物擴(kuò)增的至少一個(gè)步驟的產(chǎn)物。
[0053] -方面，所述的探針包含核酸序列SEQIDN0:15_19或25或其互補(bǔ)序列的至少22 到35個(gè)連續(xù)的核苷酸。
[0054] -個(gè)具體方面中，所述探針具有選自SEQ ID N0:15_19或25或其互補(bǔ)序列的核酸 序列。這些探針在檢測(cè)HEV基因型中的表現(xiàn)示于表4中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的 探針具有選自SEQ ID N0:15-18的核酸序列。在另外的具體實(shí)施方案中，所述的探針具有 選自SEQ ID NO: 15和18的核酸序列。
[0055] 在本申請(qǐng)所描述的方法，引物組，寡核苷酸組的具體實(shí)施方案中包含下述的引物 核酸序列的組合：SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 8, 10, 11，13或是混合有SEQ ID NO: 14的SEQ ID NO: 13 的組合；SEQ ID NO: 2 與 SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11，13 或是混合有 SEQ ID NO : 14 的 SEQ ID NO: 13 的組合；SEQ ID NO:3 與 SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11，12, 13 或是混合有 SEQ ID N0:14 的 SEQ ID N0:13 的組合；SEQ ID N0:4與SEQ ID 勵(lì):7,8,9，10，11，12，13或是混合有 SEQ ID NO: 14 的 SEQ ID NO: 13 的組合；SEQ ID NO: 5 與 SEQ ID NO: 10, 11 或 13 或是混合有 SEQ ID NO: 14 的 SEQ ID NO: 13 的組合；SEQ ID N0:6 與 SEQ ID N0:7, 8, 9, 10, 11，12, 13 或 混合有 SEQ ID NO : 14 的 SEQ ID NO: 13 的組合。SEQ ID N0:7 與 SEQ ID N0:3 或 4 或 6 的 組合；SEQ ID N0:8 與 SEQ ID NO: 2, 3 或4 或6 的組合；SEQ ID N0:9 與 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 或 6 的組合；SEQ ID NO: 10 與 SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 5 或 6 的組合；SEQ ID NO: 11 與 SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 5或6的組合；SEQ ID NO: 12與SEQ ID N0:3或4的組合。正向和反向引物的 核酸序列組合的另外的具體實(shí)施方案是SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 7的組合，SEQ ID NO: 6 與 SEQ ID NO: 13 的組合，SEQ ID NO:6 與 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 的組合，和 SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 11的組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID N0:6組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，其核酸序列由SEQ ID N0:6組成的正向引物與下述 反向引物組合，其中所述反向引物的核酸序列由SEQ ID N0:7組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案 中，其核酸序列由SEQ ID N0:6組成的正向引物與下述反向引物組合，其中所述反向引物的 核酸序列由SEQ ID NO: 13組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其核酸序列由SEQ ID NO:6組 成的正向引物與下述反向引物組合，其中所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO: 11組成。 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其核酸序列由SEQ ID N0:6組成的正向引物與下述兩種反向引 物的混合物組合，其中所述反向引物的核酸序列由SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14組成。
[0056] 這些引物組，使用這些引物組的方法以及包含這些引物組的試劑盒的有益效果 是，在沒有不相關(guān)的微生物的交叉反應(yīng)的單一反應(yīng)中，有效地?cái)U(kuò)增并檢測(cè)的四種基因 型1，2, 3和4。另外的有益之處在于，所述的試驗(yàn)是簡(jiǎn)化的，這是因?yàn)槿康墓押塑账峥捎?特異的、非-簡(jiǎn)并序列合成。這樣顯著地提高了寡核苷酸的質(zhì)量，以及所述方法的靈敏度和 特異性。而且，由于除了內(nèi)部對(duì)照寡核苷酸之外，僅有三到四種特異性的寡核苷酸（包 括探針）用于同時(shí)檢測(cè)四種基因型，不同寡核苷酸之間的交叉反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)被最小化。由 于無需分別鑒定不同的基因型，僅運(yùn)行單一試驗(yàn)即可確定樣品中是否存在四種HEV基 因型中的任意基因型，本發(fā)明的引物組，寡核苷酸和試劑盒是有成本效益的。
[0057] 上述引物組合的具體實(shí)施方案還可以與具有選自SEQ ID NO: 15-19和21的核酸 序列的探針相組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述探針的核酸序列選自SEQ ID NO: 15-18。 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述探針的核酸序列選自SEQ ID N0:15或18。在一個(gè)具體實(shí)施 方案中，所述探針的核酸序列由SEQ ID NO: 15組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述探針的 核酸序列由SEQ ID NO: 18組成。
[0058] 表IA到C顯示利用500cp/ml靶檢測(cè)GT3或GT1，GT3和GT4時(shí)，與衣殼（0RF2)區(qū) 域中的非-簡(jiǎn)并引物和探針相比，利用本發(fā)明的方法，引物，探針，用途和試劑盒在5'UTR中 獲得了更好的命中率。（GT表示基因型）
[0059]冊(cè)￥61'15'^'1?的代表性序列是5￡〇10勵(lì):38，對(duì)于冊(cè)￥6125'^'1?是5￡〇10勵(lì):39， 對(duì)于 HEVGT35'UTR 是 SEQ ID N0:40,對(duì)于 HEVGT45'UTR 是 SEQ ID N0:41。HEVGTl 衣殼的 代表性序列是SEQ ID NO:42,對(duì)于HEVGT2衣殼是SEQ ID NO:43,對(duì)于HEVGT3衣殼是SEQ ID NO:44,對(duì)于 HEVGT4 衣殼是 SEQ ID NO:45。
[0060] 在一個(gè)具體的方面，所述的探針包含與所述探針的5'端相偶聯(lián)的熒光團(tuán)，和猝滅 齊U，其中，所述熒光團(tuán)和猝滅劑之間的間隔包含至少9個(gè)核苷酸。術(shù)語"間隔"指熒光團(tuán)和 猝滅劑之間的核苷酸數(shù)量。在另一具體方面中，所述的探針在所述熒光團(tuán)和猝滅劑之間包 含至少10個(gè)或至少11個(gè)或至少12個(gè)核苷酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的探針在所述 熒光團(tuán)和猝滅劑之間包含12個(gè)核苷酸。
[0061] 利用熒光團(tuán)和猝滅劑偶聯(lián)的探針進(jìn)行檢測(cè)是本領(lǐng)域所公知的實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增檢測(cè) 方法。探針未結(jié)合狀態(tài)下的熒光團(tuán)和猝滅劑之間的能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致激發(fā)的熒光團(tuán)發(fā)射的熒光 消失。在雜交的狀態(tài)下，所述熒光團(tuán)和猝滅劑相分隔，能量轉(zhuǎn)移被阻止，造成從激發(fā)的熒光 團(tuán)發(fā)光。熒光團(tuán)是染料，其在激發(fā)后發(fā)射特定波長(zhǎng)的熒光。這些染料用于檢測(cè)。熒光團(tuán)的 示例包括FAM，HEX，JA270, Cy5, Cy5. 5, Co i! Marin等。熒光團(tuán)可通過接頭分子與5'核酸偶 聯(lián)。這種接頭分子是本領(lǐng)域公知的。非限定性的示例是蘇糖型-HEX，蘇糖型-FAM，蘇糖 型-JA270等。粹滅劑可屬于Dark粹滅劑組。此種粹滅劑的非限定性示例是Dabcyl, Eclip se，BHQ1，BHQ2, BBQ650, TAMRA。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)是FAM或蘇糖型-FAM并 且所述的猝滅劑是BHQ2。
[0062] 表4和6顯示通過增大熒光團(tuán)和猝滅劑之間的間隔，獲得了利用非-簡(jiǎn)并探針序 列對(duì)GT4檢測(cè)的更好的命中率。因此，在一個(gè)具體方面，所述探針包含由選自Seq ID NO. 15 到Seq ID NO. 18和SEQ ID NO:25的核酸序列組成的核酸序列。
[0063] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的探針包含在第86位的T。表4-6顯示在所述探針 這一位置上的C妨礙全部三種基因型的檢測(cè)。因此，在一個(gè)具體方面中，所述探針包含由選 自Seq ID NO. 15到Seq ID NO. 18和SEQ ID NO:25的核酸序列組成的核酸序列。
[0064] 在一個(gè)特定的方面中，在第75位的核苷酸是A。表4, 6和7顯不在該位置上是A 的探針比在該位置上是G的探針具有更好的命中率。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述探 針包含由SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 18的核酸序列組成的核酸序列。
[0065] 上述的方法的一個(gè)方面中，所述方法還包括，平行地，在被懷疑含有第二靶核酸的 樣品中檢測(cè)第二靶核酸，其中所述的第二核酸在容器中被擴(kuò)增和檢測(cè)，其中JEV不被擴(kuò)增 和檢測(cè)，HEV在所述第二核酸不被擴(kuò)增和檢測(cè)的容器中被擴(kuò)增和檢測(cè)，其中擴(kuò)增和檢測(cè)HEV 的容器以及擴(kuò)增和檢測(cè)第二靶核酸的容器處于相同的熱阻（thermal block)中并且在相同 的條件下循環(huán)。由于可以在相同的批次中同時(shí)運(yùn)行不同的試驗(yàn)，使得核酸試驗(yàn)系統(tǒng)的通量 得到優(yōu)化。
[0066] 一方面中，本發(fā)明涉及引物組，其包含正向和至少一種反向引物，或至少一種 正向和一種反向引物，其中所述正向引物的核酸序列或至少一種正向引物選自SEQ ID NO: 1-6,其中所述反向引物的核酸序列或至少一種反向引物選自SEQ ID NO:7-14。本申請(qǐng) 中公開了所述引物的具體實(shí)施方案以及它們的有益效果。
[0067] 本發(fā)明的一方面涉及寡核苷酸組，其中，所述的組由本申請(qǐng)所述的引物組和一種 探針組成，其中，所述的探針包含核酸序列SEQ ID NO: 15-19或其互補(bǔ)序列的至少連續(xù)的 20個(gè)核苷酸。本申請(qǐng)中公開了所述引物和探針的具體實(shí)施方案以及它們的有益效果。 [0068] 一方面，本發(fā)明涉及所述的引物組或寡核苷酸組在同時(shí)檢測(cè)生物樣品中HEV基因 型1，2, 3和/或4中的用途。本申請(qǐng)中公開了引物組或寡核苷酸組用途的具體實(shí)施方案。[0069] 一方面，本發(fā)明涉及包含依賴模板的DNA聚合酶，核苷酸和本申請(qǐng)所述的引物組 或寡核苷酸組的試劑盒。本申請(qǐng)中描述了所述引物或寡核苷酸的具體實(shí)施方案。
[0070] 還公開了確定樣品中是否包含一種或以上HEV基因型1，2, 3和/或4的方法，其包 括根據(jù)本申請(qǐng)所描述的方法擴(kuò)增基因型1，2, 3和/或4的步驟。還公開了確定樣品中 是否包含一種或以上HEV基因型1，2, 3和/或4的方法，其包括同時(shí)檢測(cè)HEV基因型1，2, 3 和/或4是否存在于樣品中的步驟。 實(shí)施例
[0071] 樣品的制各
[0072] 通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法制備用于HEVGT1，GT2, GT3和GT4的被殼（Armored) RNA，用作模板。
[0073] 預(yù)先制備50cp/ml或500cp/ml的HEV基因型并儲(chǔ)存過夜（血漿稀釋物于-60 至Ij -90°C ):
[0074] 每個(gè)樣品（850iU)分別移至深孔板中，用于三次分析。向每個(gè)包含樣品的孔添加 50 的內(nèi)部對(duì)照核酸。加入作為定性對(duì)照的對(duì)照RNA (IC/QS) (300被殼顆粒/樣品）。
[0075] 對(duì)照核酸的序列在全部試驗(yàn)中都是一致的，其選自SEQ ID NOs 46-49。
[0076] 各對(duì)照核酸儲(chǔ)存于下述緩沖液中：
[0077]
【權(quán)利要求】
1. 同時(shí)擴(kuò)增可能存在于生物樣品中的HEV基因型1，2, 3和/或4的方法，該方法包括 步驟： (a) 分離生物樣品中的核酸； (b) 利用一種非-簡(jiǎn)并正向引物和至少一種非-簡(jiǎn)并反向引物擴(kuò)增步驟（a)中分離的 核酸，其中，所述的正向和反向引物能擴(kuò)增HEV的基因型1，2, 3和4， 其中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ ID N0:6,所述一種或以上反向引物的核酸序 列包含選自SEQ ID NO:7-14的序列。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID N0:6組成，兩種反向 引物的混合物的核酸序列由SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14組成。
3. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法，其中，所述核酸通過結(jié)合于固相被分離。
4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其還包括使經(jīng)擴(kuò)增的核酸與探針在足以使得所述的探 針結(jié)合于經(jīng)擴(kuò)增的核酸的條件下接觸。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中，所述的探針包含核酸序列SEQ ID NO: 15-19或25或其互 補(bǔ)序列的至少22-35個(gè)連續(xù)的核苷酸。
6. 權(quán)利要求4或5任一項(xiàng)的方法，其中，所述探針的核酸序列由選自SEQ ID N0:15-19 或25或其互補(bǔ)序列的序列組成。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中，所述探針的核酸序列由選自SEQ ID NO: 15-18或25的序 列組成。
8. 權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中，所述的探針包含與所述探針的5'端偶聯(lián)的熒 光團(tuán)，和猝滅劑，其中，所述的熒光團(tuán)和猝滅劑之間的間隔包含至少9個(gè)核苷酸。
9. 包含正向引物和至少一種反向引物的引物組，其中，所述正向引物的核酸序列包 含SEQ ID N0:6,并且其中至少一種反向引物的核酸序列，或所述的反向引物選自SEQ ID N0:7-14。
10. 權(quán)利要求9的引物組，其中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ ID N0:6,兩種反向 引物的混合物的核酸序列包含SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14。
11. 寡核苷酸組，其中，所述組由權(quán)利要求9或10的引物組和一種探針組成，其中，所述 的探針包含SEQ ID NO: 15-19或25或其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸。
12. 權(quán)利要求11的寡核苷酸組，其中，所述的探針包含與所述探針的5'端偶聯(lián)的熒光 團(tuán)，和猝滅劑，其中，所述的熒光團(tuán)和猝滅劑之間的間隔包含至少9個(gè)核苷酸。
13. 權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)的引物組或寡核苷酸組在同時(shí)檢測(cè)可能存在于生物樣品 中的基因型1，2, 3和/或4中的用途。
14. 試劑盒，其包含依賴模板的DNA聚合酶，核苷酸，權(quán)利要求9-12的引物組或寡核苷 酸組。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104321443SQ201380020435
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月18日
【發(fā)明者】H.萊英, T.W.邁爾斯, N.紐頓, E.拉斯曼, J.桑菲利珀, N.舍恩布朗納, H.維爾茨, X.吳, K.K.Y.揚(yáng), D.齊默曼 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司