減少1->3讀框移位的方法
【專利摘要】本文報(bào)道了一種重組生產(chǎn)包含三肽QKK的多肽的方法，其特征在于所述方法包括從包含編碼所述多肽的核酸的細(xì)胞或包含編碼所述多肽的核酸的細(xì)胞的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基回收多肽從而生產(chǎn)所述多肽的步驟，其中包含在所述多肽中的三肽QKK由寡核苷酸cag?aaa?aaa或寡核苷酸caa?aag?aaa編碼。
【專利說明】減少1->3讀框移位的方法
[0001 ] 本發(fā)明屬于重組多肽生產(chǎn)領(lǐng)域。本文報(bào)道了一種重組生產(chǎn)具有減少的副產(chǎn)物含量的多肽的方法，其中通過修飾在翻譯或轉(zhuǎn)錄過程中減少移碼(frameshift)的編碼核酸實(shí)現(xiàn)副產(chǎn)物含量的減少。
_2] 發(fā)明背景
[0003]蛋白質(zhì)在現(xiàn)今的醫(yī)用組合中發(fā)揮重要作用。對于人的應(yīng)用，每種藥用物質(zhì)必須滿足不同的標(biāo)準(zhǔn)。為了保證生物藥劑對人的安全性，尤其必須將會引起嚴(yán)重危害的核酸，病毒，和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)移除。為了滿足質(zhì)量管理規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)(regulatory specificat1n),—個(gè)或更多個(gè)純化步驟必須按照制造工藝。
[0004]可以例如通過原核細(xì)胞(比如大腸桿菌)生產(chǎn)重組多肽。重組生產(chǎn)的多肽占原核細(xì)胞的多肽含量的大多數(shù)并且經(jīng)常在原核細(xì)胞內(nèi)沉積為不溶的聚集體，即為所謂的包涵體。為了分離重組多肽，必須將細(xì)胞破碎并且必須在從細(xì)胞碎片分離包涵體之后將包含在包涵體中的重組多肽溶解。對于增溶離液劑，使用比如脲或鹽酸胍。為了切開二硫鍵，尤其在堿性條件下加入還原劑，比如二硫赤蘚醇，二硫蘇糖醇，或巰基乙醇。溶解聚集的多肽之后，必須將重組多肽的對于生物活性至關(guān)重要的球狀結(jié)構(gòu)重建。在該所謂的復(fù)性過程中，例如通過針對合適的緩沖液透析(緩慢)降低還原劑的濃度，其允許變性的多肽重折疊為其生物活性結(jié)構(gòu)。復(fù)性后，純化重組多肽到對于預(yù)期用途可接受的純度。例如，對于作為治療性蛋白質(zhì)的使用，必須建立大于90 %的純度。
[0005]重組生產(chǎn)的多肽通常伴有來自生產(chǎn)細(xì)胞的核酸，內(nèi)毒素，和/或多肽。除了宿主細(xì)胞來源的副產(chǎn)物，在粗制多肽制備物中還存在多肽來源的副產(chǎn)物。除了別的以外，可以存在研究的多肽的截短的變體。
[0006]WO 95/25786中報(bào)道了在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)人載脂蛋白Al。Karathanasis，
S.K.，等人，報(bào)道了人載脂蛋白A-1基因的分離和表征(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80(1983)6147-6151)。由 Gurvich, 0.L.，等人在 EMBO Journal (22(2003)5941-5950)中報(bào)道了在大腸桿菌的編碼區(qū)中引導(dǎo)顯著的移碼水平的序列是常見的。Graversen，J.H.，等人，報(bào)道了載脂蛋白A-1的三聚化阻滯血漿清除并保持抗動(dòng)脈粥樣硬化的性質(zhì)(J.Card1vascular Pharmacology 51 (2008) 170-177)。
[0007]發(fā)明概沭
[0008]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，編碼三肽QKK的寡核苷酸可以是在編碼包含三肽QKK的多肽的核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程中1->3移碼的點(diǎn)。由于移碼的出現(xiàn)，產(chǎn)生具有不編碼的氨基酸序列的無義多肽。
[0009]因此，作為一個(gè)方面，本文報(bào)道了重組生產(chǎn)包含三肽QKK(SEQ ID NO:06)的多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟:
[0010]-從包含編碼所述多肽的核酸的細(xì)胞或包含編碼所述多肽的核酸的細(xì)胞的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基回收所述多肽從而生產(chǎn)所述多肽。
[0011]其中包含在所述多肽中的三肽QKK由寡核苷酸cag aag aag (SEQ ID N0:03)，或寡核昔酸 caa aag aaa (SEQ ID NO:04),或寡核昔酸 cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)編碼。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在所述多肽中的三肽QKK由寡核苷酸caa aag aaa(SEQID NO:04)或寡核苷酸 cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)編碼。
[0013]如本文報(bào)道的一個(gè)方面是編碼在其氨基酸序列中包含三肽QKK的多肽的核酸，其中所述三肽QKK由寡核苷酸cag aag aag (SEQ ID NO:03),或寡核苷酸caa aag aaa (SEQID NO:04)，或寡核苷酸 cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)編碼。
[0014]如本文報(bào)道的一個(gè)方面是編碼在其氨基酸序列中包含三肽QKK的多肽的核酸，其中所述三妝QKK由寡核苷酸caa aag aaa (SEQ IDNO:04)或寡核苷酸cag aaa aaa (SEQ IDNO:05)編碼。
[0015]如本文報(bào)道的一個(gè)方面是包含如本文報(bào)道的核酸的細(xì)胞。
[0016]如本文報(bào)道的一個(gè)方面是用于編碼包含于將在大腸桿菌中表達(dá)的多肽中的三肽QKK 的寡核苷酸 cag aag aag (SEQ ID NO:03),或寡核苷酸 caa aag aaa (SEQ ID NO:04),或寡核苷酸cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)的用途。
[0017]如本文報(bào)道的一個(gè)方面是用于編碼包含于將在大腸桿菌中表達(dá)的多肽中的三肽QKK 的寡核昔酸 caa aag aaa (SEQ ID NO:04)或寡核昔酸 cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)的用途。
[0018]以下具體說明如本文報(bào)道的所有方面的實(shí)施方案。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述三肽QKK由寡核苷酸caa aag aaa (SEQ ID NO:04)編碼。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述三肽QKK由寡核苷酸eag aaa aaa (SEQ ID NO:05)編碼。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述(全長)多肽包含約50個(gè)氨基酸殘基至約500個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述(全長)多肽包含約100個(gè)氨基酸殘基至約400個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述(全長)多肽包含約250個(gè)氨基酸殘基至約350個(gè)氨基酸殘基。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞，或芽胞桿菌(bacillus)細(xì)胞。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞，或HEK細(xì)胞，或BHK細(xì)胞，或NSO細(xì)胞，或SP2/0細(xì)胞，或酵母細(xì)胞。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是異源多聚多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是抗體或抗體片段。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是同源多聚多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是同源二聚體或同源三聚體。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是人載脂蛋白A-1或其變體或包含其的融合多肽，其中所述變體或所述融合多肽顯示人載脂蛋白A-1的體外和體內(nèi)功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載脂蛋白A-1變體具有選自SEQ ID NO:09至SEQ ID NO:14的組的氨基酸序列。
[0027]發(fā)明詳沭
[0028]定義:
[0029]術(shù)語"氨基酸"指羧基α-氨基酸類，其可以直接或以前體的形式由核酸編碼。個(gè)體氨基酸被由三個(gè)核苷酸組成的核酸(所謂密碼子或堿基三聯(lián)體)編碼。每個(gè)氨基酸由至少一個(gè)密碼子編碼。由不同密碼子編碼相同氨基酸被稱為“遺傳密碼的簡并”。術(shù)語”氨基酸”指天然存在的羧基α -氨基酸并且包括丙氨酸(三字母代碼:ala，單字母代碼:A)，精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp, D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gin,Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，組氨酸(his，H)，異亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，賴氨酸(lys, K)，甲硫氨酸(met, Μ)，苯丙氨酸(phe, F)，脯氨酸(pro, P)，絲氨酸(ser, S)，蘇氨酸(thr, T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr, Y),和纟顏氨酸(val,V)。
[0030]術(shù)語"載脂蛋白A-1"指具有蛋白質(zhì)-脂和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用性質(zhì)的，兩親的，螺旋多肽。載脂蛋白A-1由肝和小腸合成為267個(gè)氨基酸殘基的前載脂蛋白原(prepro-apolipoprotein),其以載脂蛋白原(pro-apolipoprotein)分泌，所述載脂蛋白原被切割為具有243個(gè)氨基酸殘基的成熟多肽。載脂蛋白A-1由6至8個(gè)不同氨基酸重復(fù)(每個(gè)由被接頭部分(常常是脯氨酸)分開的22個(gè)氨基酸殘基組成)組成，并且在一些情況下由通過一些殘基構(gòu)成的區(qū)段組成。在GenPept數(shù)據(jù)庫入口(database entry)NM-000039或數(shù)據(jù)庫入口 X00566 ;GenBank NP-000030.1 (gi 4557321)中報(bào)道了代表性的人載脂蛋白A-1氨基酸序列。存在人載脂蛋白 A-1 (SEQ ID NO:07)的天然存在的變體，比如P27H，P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D，D127N, K131 的缺失，K131M, W132R, E133K,R151C(氨基酸殘基 151 從 Arg 改變?yōu)?Cys，載脂蛋白 A-1-Paris)，E160K, E163G，P167R，L168R，E171V，P189R，R197C (氨基酸殘基 173 從 Arg 改變?yōu)?Cys，載脂蛋白 A-1-Milano)和E222K。還包括的是具有保守氨基酸修飾的變體。
[0031]術(shù)語“密碼子”指由編碼限定的氨基酸的三個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸。由于遺傳密碼的簡并性，一些氨基酸由多于一種密碼子編碼。這些編碼相同氨基酸的不同密碼子在個(gè)體宿主細(xì)胞中具有不同的相對使用頻率。因此，特定氨基酸可以由一組不同的密碼子編碼。同樣地，多肽的氨基酸序列可以由不同核酸編碼。因此，特定氨基酸可以由一組不同的密碼子編碼，其中這些密碼子中的每個(gè)具有給定的宿主細(xì)胞中的使用頻率。
[0032]表:大腸桿菌密碼子使用(密碼子I編碼的氨基酸I使用頻率[% ])
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種在大腸桿菌細(xì)胞中重組生產(chǎn)包含三肽QKK的(全長)多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: -從包含編碼所述多肽的核酸的細(xì)胞或包含編碼所述多肽的核酸的大腸桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基回收所述多肽，從而生產(chǎn)所述多肽， 其中包含在所述多肽中的三肽QKK由寡核苷酸cag aaa aaa,或寡核苷酸caa aag aaa編碼。
2.一種在大腸桿菌中重組生產(chǎn)包含三肽QKK的全長多肽的過程中減少副產(chǎn)物形成的方法，其包括以下步驟: -在編碼多肽的核酸中，取代編碼三肽QKK的寡核苷酸caa aaa aag (SEQ ID N0.01)，或寡核苷酸 caa aag aag (SEQ ID NO:02),或寡核苷酸 cag aag aag (SEQ ID NO:03)中的一到三個(gè)核苷酸以獲得寡核苷酸caa aag aaa (SEQ ID NO:04),或寡核苷酸cag aaa aaa (SEQID NO:05)，從而產(chǎn)生取代的編碼多肽的核酸，和 -從包含編碼所述多肽的取代的核酸的細(xì)胞或包含編碼所述多肽的取代的核酸的細(xì)胞的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基回收所述多肽，從而在重組生產(chǎn)包含所述三肽QKK的多肽的過程中減少副產(chǎn)物形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法包括以下另外步驟中的一個(gè)或更多個(gè): -提供包含三肽QKK的多肽的氨基酸序列或編碼核酸，和/或 -用編碼所述多肽的取代的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，和/或 -培養(yǎng)轉(zhuǎn)染有所述取代的核酸的細(xì)胞(在適于表達(dá)所述多肽的條件下)，和/或 -從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收所述多肽，和/或 -任選地以一個(gè)或更多個(gè)層析步驟純化生產(chǎn)的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求2至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于以一至五個(gè)層析步驟純化生產(chǎn)的多肽。
5.根據(jù)在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述多肽是載脂蛋白A-1，或具有載脂蛋白A-1功能的其變體，或其融合多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述多肽具有選自包含SEQID N0:09至SEQ ID NO: 14的組的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5至6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述多肽具有SEQID ΝΟ:11的氨基酸序列。
【文檔編號】C12N15/67GK104136460SQ201380011165
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】阿德爾伯特·格羅斯曼, F·黑塞, 埃哈德·科佩茨基, 維爾馬·勞, 克里斯蒂安·尚茨 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司