a-淀粉酶的制作方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及新a-淀粉酶、其制備方法和該淀粉酶的用途。本發(fā)明涉及來(lái)自Alicyclobacilluspohliae的包含編碼新c(-淀粉酶的基因的新鑒定的多核苷酸序列。本發(fā)明的特征在于新基因的全長(zhǎng)編碼序列以及該基因的全長(zhǎng)功能性蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及在工業(yè)過(guò)程例如食品工業(yè)如烘焙業(yè)中使用這些蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明還包括適合生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)和細(xì)胞的用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞?！緦?zhuān)利說(shuō)明】Ct-淀粉酶發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及新a-淀粉酶、其制備方法和該淀粉酶的用途。[0002]本發(fā)明涉及包含編碼新a_淀粉酶的基因的新鑒定的多核苷酸序列。本發(fā)明的特征在于新基因的全長(zhǎng)編碼序列以及該基因的全長(zhǎng)功能性蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及在工業(yè)過(guò)程例如食品工業(yè)如烘焙業(yè)中使用這些蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明還包括適合生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)和細(xì)胞的用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明涉及制造本發(fā)明的多核苷酸的方法。本發(fā)明還涉及制造本發(fā)明的多肽的方法。[0003]發(fā)明背景[0004]關(guān)于面包陳化的研究指出，面包中的淀粉部分在貯存期間發(fā)生再結(jié)晶，從而導(dǎo)致內(nèi)芯（crumb)緊實(shí)度的增加，其可以以面包片硬度的增加來(lái)測(cè)量。[0005]本發(fā)明涉及a-淀粉酶。a-淀粉酶已被用于工業(yè)很長(zhǎng)一段時(shí)間。[0006]a_淀粉酶?jìng)鹘y(tǒng)上通過(guò)添加麥芽小麥或大麥面粉來(lái)提供，并且給烘焙者帶來(lái)一些優(yōu)勢(shì)。使用a-淀粉酶以在面團(tuán)發(fā)酵期間得到滿意的氣體產(chǎn)生和氣體保留以及滿意的表皮顏色。這意味著，如果該酶沒(méi)有以足量使用，面包塊的體積、質(zhì)地和外觀都會(huì)被顯著損害。a-淀粉酶在小麥作物本身中自然產(chǎn)生，由哈格伯格降落數(shù)值（HagbergFallingNumber)常規(guī)測(cè)定（ICC107法），并通過(guò)在磨機(jī)中加入a-淀粉酶以及在烘焙廠使用專(zhuān)門(mén)的配料來(lái)采取措施以使這種變化最小化，因?yàn)榇嗣笜O度重要。[0007]在更現(xiàn)代的時(shí)候，來(lái)自谷物的a_淀粉酶很大程度被來(lái)自微生物來(lái)源包括真菌來(lái)源和細(xì)菌來(lái)源的酶替換。通過(guò)在菌種選擇、發(fā)酵和加工中使用生物技術(shù)，酶可以由所述微生物來(lái)源制備，而這相比麥芽面粉更具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槊妇哂懈鼮槭芸氐馁|(zhì)量，相對(duì)純，使用更經(jīng)濟(jì)。[0008]但是，a-淀粉酶的性質(zhì)及其技術(shù)效果確實(shí)顯示了重要的區(qū)別。除了影響氣體產(chǎn)生、氣體保留和表皮顏色，a-淀粉酶可以與烘焙產(chǎn)品的貨架期有關(guān)。[0009]在小麥面粉中的淀粉含有兩種主要的成分，直鏈淀粉和支鏈淀粉，這些淀粉的組織形式為淀粉顆粒。來(lái)自硬質(zhì)小麥（hard-millingwheat)品種的這些顆粒的一部分"被破壞"，顆粒在碾壓能量的結(jié)果下分裂開(kāi)來(lái)。在烘焙過(guò)程中，淀粉顆粒糊化；該過(guò)程涉及顆粒的吸水膨脹和顆粒結(jié)晶性質(zhì)的失去；特別是已知天然顆粒內(nèi)的支鏈淀粉作為結(jié)晶存在并且這些分子在糊化過(guò)程中解離并失去結(jié)晶性。一旦面包被烘焙，支鏈淀粉經(jīng)數(shù)天慢慢地重新結(jié)晶，該重新結(jié)晶或淀粉的回生（retrogradation)被視為面包陳化的主要原因。[0010]這些不同形式的淀粉以及它們與a-淀粉酶的相互作用表明了酶在烘焙技術(shù)方面的作用。來(lái)自真菌來(lái)源的、最典型地來(lái)自Aspergillus種的a-淀粉酶主要在面團(tuán)混合和整個(gè)發(fā)酵/發(fā)面期間作用于被破壞的淀粉。酶的低熱穩(wěn)定性意味著酶在烘焙期間以及關(guān)鍵地在淀粉糊化發(fā)生之前被滅活，使得很少或沒(méi)有淀粉從未被破壞的部分分解。因此，真菌淀粉酶在為發(fā)酵和顏色提供糖類(lèi)方面是有用的，但在延長(zhǎng)貨架期方面幾乎沒(méi)有價(jià)值。另一方面，細(xì)菌a-淀粉酶最典型地來(lái)自Bacillusamyloliquifaciens的a-淀粉酶的確帶來(lái)了面包烘焙期間以及淀粉糊化期間的擴(kuò)展的溫度穩(wěn)定性和活性。細(xì)菌淀粉酶然后導(dǎo)致淀粉以及由之引起的烘焙面包品質(zhì)的更廣泛改性；特別是烘焙面包的內(nèi)芯可在整個(gè)貨架期顯見(jiàn)地更柔軟并且可使得貨架期增加。然而，盡管細(xì)菌a-淀粉酶可對(duì)于延長(zhǎng)貨架期有用，卻很難實(shí)際使用，因?yàn)楹苄〉倪^(guò)量就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)芯結(jié)構(gòu)有不可接受的大和開(kāi)放的孔洞，而質(zhì)地可變得過(guò)于柔軟并且"粘軟"。[0011]本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了來(lái)自特定細(xì)菌來(lái)源的a-淀粉酶，其具有界于典型的真菌a-淀粉酶和典型的細(xì)菌a-淀粉酶之間的熱穩(wěn)定性。這種酶的熱穩(wěn)定性比真菌a-淀粉酶更高，因此允許糊化期間和糊化之后支鏈淀粉有更大的活性，但它在烘焙過(guò)程中發(fā)揮作用的時(shí)間不像典型的細(xì)菌淀粉酶那么長(zhǎng)，并且不過(guò)度消化（overdigesting)淀粉。[0012]US4,598,048描述了產(chǎn)麥芽糖淀粉酶的制備。US4,604,355描述了產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、其制備及其用途。USRE38,507描述了抗陳化方法和制劑。USRE38,507所描述的產(chǎn)品以商品名_Novamyl_R在產(chǎn)業(yè)中使用。[0013]致力于尋找一種能夠生產(chǎn)改進(jìn)的a-淀粉酶的有機(jī)體。結(jié)果，本發(fā)明人鑒定到了在南極發(fā)現(xiàn)的AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276菌株。這是新菌株，其以前沒(méi)有被用作具有改進(jìn)性能的a-淀粉酶的來(lái)源。發(fā)明概要[0014]本發(fā)明涉及多肽。本發(fā)明提供了可用于延緩烘焙產(chǎn)品如面包和蛋糕的陳化的新a-淀粉酶。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼所述新a-淀粉酶的新多核苷酸。[0015]因此，本發(fā)明涉及：[0016]編碼具有a-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其包含：[0017](a)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或[0018](b)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽與具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5%的同一性；或[0019](c)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列；或[0020](d)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列。[0021]進(jìn)一步，本發(fā)明涉及：[0022]a-淀粉酶多肽，其包含：[0023](a)SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或[0024](b)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少99.5%的同一性的氨基酸序列；或[0025](c)由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸編碼的氨基酸序列；或[0026](d)根據(jù)（c)的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是由AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276生產(chǎn)的；或[0027](e)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)的氨基酸序列，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義；或[0028](f)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)的氨基酸序列，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義，并且所述氨基酸序列的特征在于，當(dāng)被用于制備具有基于面粉的至少5wt%的糖的烘焙產(chǎn)品時(shí)，所述烘焙產(chǎn)品相比不使用所述氨基酸序列制備的烘焙產(chǎn)品具有減小的貯存后硬度。[0029]另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸序列的載體。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明涉及制造本發(fā)明的多核苷酸的方法。本發(fā)明還涉及制造本發(fā)明的多肽的方法。本發(fā)明涉及所述多肽用于食品制造的用途。本發(fā)明還涉及酶組合物。本發(fā)明還涉及制備面團(tuán)的方法以及涉及包含本發(fā)明多肽或本發(fā)明酶組合物的面團(tuán)。[0030]本發(fā)明還涉及制備烘焙產(chǎn)品的方法，其包括烘焙本發(fā)明的面團(tuán)的步驟。[0031]本發(fā)明還涉及烘焙的產(chǎn)品。[0032]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)多肽的方法，其包括使用AlicyclobacilluspohliaeNCIMB14276。[0033]附圖簡(jiǎn)要描沭[0034]圖1示出pGBB09的質(zhì)粒圖譜[0035]圖2示出pGBB09DSM-AMl的質(zhì)粒圖譜[0036]圖3示出SEQIDNO:1.[0037]圖4示出SEQIDNO:2.[0038]圖5示出SEQIDNO:3.[0039]序列表簡(jiǎn)要描沭[0040]SEQIDNO:1示出編碼野生型信號(hào)序列（1-99位核苷酸所示）、本發(fā)明的a-淀粉酶（第100-2157位核苷酸所示）以及3'-末端的終止密碼子（2157-2160位核苷酸所不）的來(lái)自AlicyclobacilluspohliaeNCIMB14276的多核苷酸序列。[0041]SEQIDNO:2示出AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276野生型信號(hào)序列(1-33位氨基酸所示）和本發(fā)明的a-淀粉酶（第34-719位氨基酸所示）的氨基酸序列。本文中也被稱(chēng)為DSM-AM蛋白。[0042]SEQIDNO:3示出編碼野生型信號(hào)序列（第1-99位核苷酸所示）、本發(fā)明的a-淀粉酶（第100-2157位核苷酸所示）以及3'-末端的終止密碼子（第2157-2160位核苷酸所示）的來(lái)自AlicyclobacilluspohliaeNCIMB14276的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0043][0044]在本說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求書(shū)全文中，詞語(yǔ)"包含"和"包括"及其時(shí)態(tài)變化應(yīng)當(dāng)被解釋為開(kāi)放的和包含性的。也就是說(shuō)，當(dāng)上下文允許時(shí)，這些詞語(yǔ)旨在表示可包含沒(méi)有具體列舉的其他要素或整體。[0045]在本說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求書(shū)全文中，措辭"第100-2157位核苷酸"表示第100位直至并包括第2157位核苷酸。[0046]在本說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求書(shū)全文中，措辭"第34-719位氨基酸"是指第34位直至并包括第719位氨基酸。[0047]術(shù)語(yǔ)"具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽"、"SEQIDNO:2所示的成熟多肽"以及"成熟的DSM-AM"在本文中可互換使用。[0048]術(shù)語(yǔ)"與具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5%的同一性的多肽"、"本發(fā)明的成熟多肽"、"本發(fā)明的成熟酶"、"本發(fā)明的淀粉分解酶"、"本發(fā)明的a-淀粉酶（alpha-amylaseenzyme)"、"本發(fā)明的a-淀粉酶(alpha-amylase)"以及"本發(fā)明的多肽"在本文中可互換使用。[0049]術(shù)語(yǔ)"與具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少70%的同一性的多肽"、"本發(fā)明的成熟多肽"、"本發(fā)明的成熟酶"、"本發(fā)明的淀粉分解酶"、"本發(fā)明的ct-淀粉酶（alpha-amylaseenzyme)"、"本發(fā)明的a-淀粉酶（alpha-amylase)"和"本發(fā)明的多肽"在本文中可互換使用。[0050]術(shù)語(yǔ)"根據(jù)本發(fā)明"和"本發(fā)明的"在本文中可互換使用。[0051]術(shù)語(yǔ)"DSM-AM基因"、"本發(fā)明的a-淀粉酶基因"、"AM基因"和"SEQIDNO:1的多核苷酸"在本文可互換使用。[0052]術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的多核苷酸"包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:3。[0053]在本發(fā)明的上下文中，"成熟多肽"在本文中定義為具有a_淀粉酶活性的多肽，其是在翻譯和包括N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等任何翻譯后修飾之后的其最終形式。成熟過(guò)程可取決于所使用的特定的表達(dá)載體、表達(dá)宿主和生產(chǎn)工藝。[0054]為了確認(rèn)來(lái)自AlicyclobacilluspohliaeNCIMB14276的DSM-AM基因的多核昔酸序列，對(duì)A.pohliaeNCMB14276的整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序。其結(jié)果證實(shí)了編碼DSM-AM蛋白的多核苷酸是如SEQIDNO:1所公開(kāi)的。由此，如SEQIDNO:2所示的DSM-AM蛋白的719位氨基酸序列得到確認(rèn)。從DSM-AM蛋白的N'-末端開(kāi)始的前33個(gè)氨基酸屬于信號(hào)序列。[0055]多核苷酸[0056]本發(fā)明涉及編碼具有a_淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其包含：[0057](a)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或[0058](b)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽與具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5%的同一性；或[0059](c)SEQIDNO:1或SEQIDNO:13第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列；或[0060](d)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列。[0061]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多核苷酸是分離的多核苷酸，其包含：[0062](a)SEQIDNO:1或3的多核苷酸序列的第100-2157位核苷酸（為免生疑義，包括第100位和第2157位核苷酸）所示的多核苷酸序列；或[0063](b)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列（為免生疑義，包括第34位和第719位氨基酸）；或[0064](c)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列。[0065]在一個(gè)方面，所述分離的多核苷酸可以通過(guò)合成得到，例如通過(guò)固相合成或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。[0066]SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的序列包括編碼本發(fā)明的成熟多肽和野生型信號(hào)序列的核苷酸。SEQIDNO:2包括本發(fā)明的成熟多肽和野生型信號(hào)序列。[0067]"分離的多核苷酸"或"分離的核酸"是這樣的DNA或RNA，它們與在獲得其的生物的天然基因組中與其緊密相鄰的兩條編碼序列（5'末端一條，3'末端一條）并非緊密相鄰。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的多核苷酸包括與編碼序列緊密相鄰的5'非編碼（例如，啟動(dòng)子）序列的一些或全部。該術(shù)語(yǔ)因此包括，例如，整合入載體的重組DNA，整合入自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《镜闹亟MDNA，或者整合入原核生物或真核生物的基因組DNA的重組DNA，或者其作為單獨(dú)分子獨(dú)立于其他序列而存在（例如通過(guò)PCR或限制性?xún)?nèi)切酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段或cDNA)。該術(shù)語(yǔ)還包括作為編碼額外多肽的雜合基因的一部分的重組DNA，其基本不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基（通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)）或化學(xué)前體或其他化學(xué)品（化學(xué)合成時(shí)）。另外，"分離的多核苷酸片段"是不以片段的形式天然存在并且在天然狀態(tài)下不會(huì)被發(fā)現(xiàn)的多核苷酸片段。[0068]本發(fā)明的多核苷酸還包括這樣的多核苷酸，其包含SEQIDNO:1或3的編碼序列的某些變體序列并且可以編碼功能性a_淀粉酶。所述變體序列因此編碼具有a_淀粉酶活性的多肽。[0069]本發(fā)明的多核苷酸序列一般包含編碼如下多肽的序列，所述多肽與具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有通過(guò)那些序列的全長(zhǎng)計(jì)算的至少約99.5%的同一性。[0070]SEQIDNO:1或3的編碼序列可以通過(guò)核苷酸替換被修飾。SEQIDNO:1或3的多核苷酸可以可替代地或另外地通過(guò)一個(gè)或更多個(gè)插入和/或缺失和/或通過(guò)在任意一端或兩端的延伸來(lái)被修飾。被修飾的多核苷酸編碼具有a-淀粉酶活性的多肽。[0071]在本發(fā)明的多核苷酸的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸是由AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276產(chǎn)生的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"或"核酸分子"及類(lèi)似用語(yǔ)旨在包括DNA分子（例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子（例如，mRNA)以及使用核苷酸類(lèi)似物產(chǎn)生的DNA或RNA類(lèi)似物。多核苷酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選地是雙鏈DNA。多核苷酸可以是合成的，從而其包含合成的或被修飾的核苷酸。本領(lǐng)域已知對(duì)多核苷酸有多種不同類(lèi)型的修飾。這些修飾包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架、吖啶或聚賴(lài)氨酸鏈在分子的3'和/或5'端的添加。所述寡核苷酸可以被用來(lái)例如制備具有改變的堿基配對(duì)能力或提高的核酸酶抗性的多核苷酸。[0072]為了本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所描述的多核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域中可用的任何方法進(jìn)行修飾?？梢赃M(jìn)行所述修飾例如來(lái)增加本發(fā)明的多核苷酸在合適的宿主細(xì)胞中可被表達(dá)的程度。[0073]本發(fā)明的多核苷酸如DNA多核苷酸可以通過(guò)重組、合成或由本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何手段來(lái)制備。它們也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被克隆。本發(fā)明的多核苷酸通常以分離和/或純化的形式被提供。[0074]多核苷酸可以使用重組的手段來(lái)制備，例如使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng)）克隆技術(shù)。這將涉及制備針對(duì)希望擴(kuò)增的多核苷酸區(qū)域的引物對(duì)（例如約15-30個(gè)核苷酸），使引物與從合適的細(xì)胞得到的mRNA或cDNA接觸，在如下條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，所述條件實(shí)現(xiàn)了所期望區(qū)域的擴(kuò)增，分離和回收擴(kuò)增的DNA。引物可被設(shè)計(jì)成含有合適的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以便擴(kuò)增的DNA可以被方便地克隆到合適的克隆載體中。[0075]所述技術(shù)可以用來(lái)獲得本文所描述的SEQIDNO:1或3的多核苷酸的全部或部分，或其變體。[0076]與SEQIDNO:1或3的序列不具有100%的序列同一性但仍然落入本發(fā)明的范圍內(nèi)的多核苷酸可以通過(guò)多種方式獲得。例如，多核苷酸可以通過(guò)合適的誘變技術(shù)如SEQIDNO:1或3的定點(diǎn)誘變獲得。這可用于例如，當(dāng)序列需要沉默密碼子改變以針對(duì)表達(dá)多核苷酸序列的特定宿主細(xì)胞進(jìn)行密碼子偏好性?xún)?yōu)化時(shí)。為了引入限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，或?yàn)榱烁淖冇啥嗪塑账峋幋a的多肽的特性或功能，其他序列的改變也可以是期望的。[0077]為了增加引入的酶在本發(fā)明的細(xì)胞中以活性形式表達(dá)的可能性，可以改變相應(yīng)的編碼核苷酸序列來(lái)針對(duì)所選擇宿主細(xì)胞的密碼子使用優(yōu)化其密碼子使用，例如SEQIDNO:3。幾種用于密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域已知的。一種優(yōu)選的針對(duì)所選擇宿主細(xì)胞的密碼子使用優(yōu)化核苷酸序列的密碼子使用的方法是，W02006/077258和/或W02008/000632所披露的密碼子對(duì)優(yōu)化技術(shù)。W02008/000632涉及密碼子對(duì)優(yōu)化。密碼子對(duì)優(yōu)化是這樣一種方法，其中編碼多肽的核苷酸序列在其密碼子使用方面被改造，特別是所使用的密碼子對(duì)，以獲得編碼多肽的核苷酸序列的改進(jìn)的表達(dá)和/或所編碼多肽的改進(jìn)的生產(chǎn)。密碼子對(duì)被定義為編碼序列中一組兩個(gè)連續(xù)的三聯(lián)體（密碼子）。[0078]作為基因表達(dá)和翻譯效率的一個(gè)簡(jiǎn)單計(jì)量，本文中使用了如XuhuaXia，EvolutionaryBioinformatics2007,3:53-58所描述的密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI)。該指數(shù)使用了來(lái)自物種的高表達(dá)基因的參照組，來(lái)評(píng)估每個(gè)密碼子的相對(duì)優(yōu)劣，并且由基因中所有密碼子的使用頻率為該基因計(jì)算分?jǐn)?shù)。該指數(shù)評(píng)估了選擇在塑造密碼子使用模式中有效的程度。在這方面，其可用于預(yù)測(cè)基因的表達(dá)水平、評(píng)估病毒基因?qū)ζ渌拗鞯倪m應(yīng)性以及比較不同生物體中的密碼子使用。該指數(shù)還可以對(duì)異源基因表達(dá)成功的可能性給出大致的指示。在本發(fā)明的密碼子對(duì)優(yōu)化的基因中，CAI為0.6或更高、0.7或更高、0.8或更高、0.85或更高、〇.87或更高、0.90或更高、0.95或更高或約1.0。[0079]本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的雙鏈多核苷酸。[0080]本發(fā)明的多核苷酸、探針或引物可以攜帶顯示標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括放射性同位素如32P或35s、酶標(biāo)記或其他蛋白質(zhì)標(biāo)記如生物素。所述標(biāo)記可以被添加至本發(fā)明的多核苷酸、探針或引物，并且可以使用本身已知的技術(shù)檢測(cè)。[0081]Ui[0082]本發(fā)明提供了具有淀粉降解活性的（分離的）多肽。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明多肽的方法。[0083]術(shù)語(yǔ)"肽"和"寡肽"被認(rèn)為是同義的（如通常認(rèn)為的那樣）并且每個(gè)術(shù)語(yǔ)可以按照上下文需要互換使用來(lái)指代通過(guò)肽鍵聯(lián)接的至少兩個(gè)氨基酸的鏈。詞語(yǔ)"多肽"（或蛋白質(zhì)）在本文中用于含有多于七個(gè)氨基酸殘基的鏈。本文所有的寡肽和多肽的式或序列為從左至右并且以從氨基末端向羧基末端的方向書(shū)寫(xiě)。本文所使用的氨基酸的三字母代碼是本領(lǐng)域常規(guī)已知的，并且可以在Sambrook，等（MolecularCloning:ALaboratoryManual，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，2001)中找到。[0084]本發(fā)明涉及a_淀粉酶多肽，其包含：[0085](a)SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或[0086](b)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少99.5%的同一性的氨基酸序列；或[0087](c)由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸編碼的氨基酸序列；或[0088](d)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)的氨基酸序列，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義；或[0089](e)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)的氨基酸序列，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義，并且所述氨基酸序列的特征在于，當(dāng)被用于制備具有基于面粉的至少5wt%的糖的烘焙產(chǎn)品時(shí)，所述烘焙產(chǎn)品相比不使用所述氨基酸序列制備的烘焙產(chǎn)品具有減小的貯存后硬度。[0090]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多肽，其包含：[0091](a)SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或[0092](b)由SEQIDNO:1或3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸編碼的氨基酸序列；或[0093](c)根據(jù)（b)的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是由AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276產(chǎn)生的；或[0094](d)由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[0095]本發(fā)明的多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列與具有a-淀粉酶活性的具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5%的同一性、優(yōu)選地至少99.6%的同一性、優(yōu)選地至少99.7%的同一性、優(yōu)選地至少99.8%的同一性、優(yōu)選地至少99.9%的同一性。一般地，SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的天然氨基酸序列是優(yōu)選的。[0096]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性、在一方面至少80%的同一性、在一方面至少85%的同一性、在一方面至少90%的同一性、在一方面至少95%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0097]如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，有可能SEQIDNO:2或根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽（第34-719位氨基酸所示）的N-和/或C-末端由于成熟期間的加工中的變化而可能是異質(zhì)的。特別地，所述加工變化可在多肽過(guò)表達(dá)時(shí)發(fā)生。此外，外切蛋白酶活性可引起異質(zhì)性。異質(zhì)性發(fā)生的程度也取決于所使用的宿主和發(fā)酵方案。這樣的C-末端加工的人為缺陷（artefacts)可導(dǎo)致SEQIDNO:2或根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽所示的更短的多肽或更長(zhǎng)的多肽。由于這樣的加工變化，N-末端也可能是異質(zhì)的。N-末端的加工變體可以是由于信號(hào)肽酶對(duì)信號(hào)序列的可替換性切割。[0098]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼SEQIDNO:2的多肽或者SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽的分離的多核苷酸，其包含額外的殘基并從第-1或-2或_3等位點(diǎn)起始。或者，其可能缺乏某些殘基，因而在第2或3或4等位點(diǎn)起始。額外的殘基還可以存在于C-末端例如在第720位、第721位等?；蛘撸珻-末端可能缺乏某些殘基，因而在第718位或第717位等終止。[0099]本發(fā)明的多肽優(yōu)選地與SEQIDNO:2所示的序列具有99.5%的序列同一性。[0100]SEQIDNO:2的多肽的序列因此可以被修飾來(lái)提供本發(fā)明的多肽?？梢赃M(jìn)行氨基酸替換例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)替換。經(jīng)修飾的多肽保留a淀粉酶的活性。[0101]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽與具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少70%的同一性、在一方面至少80%的同一性、在一方面至少85%的同一性、在一方面至少90%的同一性、在一方面至少95%的同一性、在一方面至少99.5%的同一性。[0102]優(yōu)選地，所述多肽具有這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列當(dāng)與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列比對(duì)時(shí)，包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。優(yōu)選地，所述a-淀粉酶至少包含第297位的Ala，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0103]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽可以包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少兩個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。優(yōu)選地，所述多肽至少包含：第184位的Asp與第297位的Ala;至少第297位的Ala與第368位的Thr;或者至少第297位的Ala與第489位的Asn，所有的所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0104]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽可以包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少三個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。優(yōu)選地，所述多肽至少包含：第297位的Ala、第368位的Thr與第489位的Asn;第184位的Asp、第297位的Ala與第368位的Thr;或第184位的Asp、第297位的Ala與第489位的Asn，所有的所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0105]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽可以包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所有的所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0106]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少80%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0107]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少85%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0108]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少90%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0109]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少95%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0110]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少80%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0111]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少85%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0112]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少90%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0113]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少95%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0114]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少99.5%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義。[0115]在一個(gè)方面，本發(fā)明的多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義，并且所述氨基酸序列的特征在于，當(dāng)被用于制備具有基于面粉的至少5wt%的糖的烘焙產(chǎn)品時(shí)，所述烘焙產(chǎn)品相比不使用所述氨基酸序列制備的烘焙產(chǎn)品具有減少的貯存后硬度。[0116]本發(fā)明多肽的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代來(lái)改進(jìn)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。此夕卜，本發(fā)明蛋白質(zhì)的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被取代來(lái)改變酶的比活性或熱穩(wěn)定性。[0117]保守的氨基酸替換是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸；和一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。[0118]優(yōu)選的保守氨基酸替換基團(tuán)包括：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴(lài)氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公開(kāi)的氨基酸序列的替換變體是其中所公開(kāi)的序列中的至少一個(gè)殘基被去除并且該位置插入了不同的殘基的那些。優(yōu)選地，氨基酸改變是保守的。每個(gè)天然氨基酸的優(yōu)選的保守替換包括:Ala至ser;Arg至Iys;Asn至gin或his;Asp至glu;Cys至ser或ala;GIn至asn;GIu至asp;GIy至pro;His至asn或gin;He至Ieu或val;Leu至ile或val;Lys至arg;gln或glu;Met至leu或ile;Phe至met、leu或tyr;Ser至thr;Thr至ser;Trp至tyr;Tyr至trp或phe;以及Val至ile或leu。[0119]本發(fā)明的多肽可以是基本上分離的形式?？梢岳斫?，所述多肽可以與不會(huì)干擾該多肽的預(yù)期目的的載體或稀釋劑混合，但仍然被認(rèn)為是基本上分離的。本發(fā)明的多肽還可以是基本上純化的形式，在這種情況下，其通常包括制劑中的多肽，其中按重量計(jì)所述制劑中超過(guò)50%，例如超過(guò)80%、超過(guò)90%、超過(guò)95%或超過(guò)99%的多肽是本發(fā)明的多肽。[0120]例如，如同已通過(guò)任何合適的技術(shù)例如Smith與Johnson,Gene67:31-40(1988)披露的單步純化法基本上純化的天然的或重組的多肽，在宿主細(xì)胞中重組制備的多肽和蛋白質(zhì)對(duì)于本發(fā)明目的被認(rèn)為是分離的。[0121]本發(fā)明的多肽可以是化學(xué)修飾的例如翻譯后修飾的。例如它們可以被糖基化或包含被修飾的氨基酸殘基。它們也可以通過(guò)添加組氨酸殘基或17標(biāo)簽被修飾來(lái)協(xié)助其純化或通過(guò)添加信號(hào)序列來(lái)促進(jìn)其從細(xì)胞分泌。這種被修飾的多肽和蛋白質(zhì)落入本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"多肽"的范圍之內(nèi)。[0122]為了將翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、進(jìn)入周質(zhì)空間或進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，可以融合合適的分泌信號(hào)序列至本發(fā)明的多核苷酸。該信號(hào)對(duì)于多肽可以是內(nèi)源的或者它們可以是異源信號(hào)。[0123]本發(fā)明的多肽可以以被修飾的形式例如融合蛋白被生產(chǎn)，并且不僅可以包括分泌信號(hào)，還可以包括另外的異源功能區(qū)域。因此，舉例來(lái)說(shuō)，額外氨基酸的區(qū)域特別是帶電的氨基酸可以被添加到多肽的N-末端來(lái)提高在宿主細(xì)胞中、在純化期間或在隨后的處理和貯存期間的穩(wěn)定性和持久性。而且，肽部分可以被添加至多肽來(lái)促進(jìn)純化。[0124]本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成程序的產(chǎn)物以及通過(guò)重組技術(shù)由原核或真核宿主包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)物。根據(jù)重組生產(chǎn)程序中所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。此外，本發(fā)明的多肽還可以包括初始修飾（initialmodified)的甲硫氨酸殘基，在某些情況下作為宿主介導(dǎo)過(guò)程的結(jié)果。[0125]序列同一件[0126]術(shù)語(yǔ)"同源性"、"百分比同一性"、"百分比同源性"和"同一性的百分比"在本文可互換使用。為了本發(fā)明的目的，本文中定義其為為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)多核苷酸序列（本文也被稱(chēng)為核酸序列）的百分比同一性，序列被以最佳比較為目的而比對(duì)。為了最優(yōu)化兩條序列之間的比對(duì)，可以在所比較的兩個(gè)序列中的任意個(gè)中引入缺口。所述比對(duì)可以在被比較的序列的全長(zhǎng)上進(jìn)行。或者，比對(duì)可以在更短的長(zhǎng)度上進(jìn)行，例如超過(guò)約20個(gè)、約50個(gè)、約100個(gè)或更多個(gè)核酸/堿基或氨基酸上進(jìn)行。百分比同源性或百分比同一性是在報(bào)道的對(duì)比區(qū)域上兩個(gè)序列之間相同匹配的百分比。[0127]序列的比較以及兩個(gè)序列之間的百分比同一性的確定可以使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道若干不同的計(jì)算機(jī)程序能夠用于比對(duì)兩個(gè)序列并確定兩個(gè)序列之間的同源性這一事實(shí)（Kruskal，J.B.(1983)AnoverviewofsequencecomparisonInD.SankoffandJ.B.Kruskal,(ed.),Timewarps,stringeditsandmacromolecules：thetheoryandpracticeofsequencecomparison，pp.1-44AddisonWesley)〇兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的百分比同一性可以使用用于比對(duì)兩個(gè)序列的Needleman和Wunsch算法來(lái)確定。（Needleman，S.B.andWunsch，C.D.(I97O)J.Mol.Biol.48，443-453)。氨基酸序列和多核苷酸序列兩者都可以用算法比對(duì)。Needleman-Wunsch算法已經(jīng)在計(jì)算機(jī)程序NEEDLE中實(shí)施。為了本發(fā)明的目的，使用來(lái)自EMBOSS軟件包的NEEDLE程序（2.8.Q或更高版本，EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000)Rice,P.Longden,I.andBleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)pp276-277,http://emboss.bioinformatics,nl/)。對(duì)于蛋白質(zhì)序列用EBL0SUM62作為替換矩陣。對(duì)于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的可選參數(shù)是缺口開(kāi)放罰分為10和缺口延伸罰分為0.5。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到所有這些不同的參數(shù)會(huì)產(chǎn)生稍微不同的結(jié)果，但是，使用不同算法時(shí)兩條序列的整體百分比同一性不會(huì)顯著改變。[0128]通過(guò)如上所述的NEEDLE程序比對(duì)之后，查詢(xún)序列和本發(fā)明的序列之間的同一性的百分比計(jì)算如下：在比對(duì)中兩個(gè)序列顯示為相同氨基酸或相同核苷酸的相應(yīng)位點(diǎn)的數(shù)量除以扣除比對(duì)中缺口總數(shù)之后的比對(duì)總長(zhǎng)度。本文中所定義的百分比同一性可以通過(guò)使用N0BRIEF選項(xiàng)由NEEDLE獲得并且在程序的輸出中被標(biāo)記為"最長(zhǎng)同一性"。[0129]本發(fā)明的多核苷酸和蛋白質(zhì)序列還可被用作"查詢(xún)序列"來(lái)進(jìn)行對(duì)公眾數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，例如，來(lái)鑒定其他家族成員或相關(guān)序列?？梢允褂?1仏心111，的31.(1990)11〇1.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序（2.0版）來(lái)進(jìn)行此類(lèi)搜索?？梢杂肗BLAST程序，以分?jǐn)?shù)=100,字長(zhǎng)=12來(lái)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的多核苷酸同源的核苷酸序列?？梢杂肵BLAST程序，以分?jǐn)?shù)=50,字長(zhǎng)=3來(lái)進(jìn)行BLAST蛋白搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的缺口比對(duì)，可以利用Altschuletal.，（1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的GappedBLAST。當(dāng)利用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序（例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。見(jiàn)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的主頁(yè)http://www.ncbi.nlm.nih.gov。[0130]載體[0131]本發(fā)明的多核苷酸可以被整合到載體，包括克隆和表達(dá)載體。載體可以是重組的可復(fù)制載體。載體可以被用來(lái)在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制本發(fā)明的多核苷酸。載體可方便地進(jìn)行重組DNA程序。[0132]本發(fā)明還涉及在合適的宿主細(xì)胞中培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述載體的方法，例如在本發(fā)明的多肽的表達(dá)發(fā)生的條件下。本發(fā)明提供了通過(guò)將本發(fā)明的多核苷酸引入載體（在一個(gè)實(shí)施方案中為表達(dá)載體）、將載體引入相容的宿主細(xì)胞以及在使得所述載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來(lái)制備本發(fā)明的多肽的方法。所述載體可以從宿主細(xì)胞中回收。[0133]本發(fā)明的載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外的實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。或者，載體可以是當(dāng)引入宿主細(xì)胞時(shí)整合到宿主細(xì)胞基因組并與其被整合進(jìn)入的染色體一同復(fù)制的載體。[0134]-種類(lèi)型的載體是"質(zhì)粒"，它指的是可以插入額外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類(lèi)型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可以被插入到病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制（例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體以及附加體型哺乳動(dòng)物載體）。其他載體（例如，沒(méi)有合適的復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌整合載體或非附加體型哺乳動(dòng)物載體）在引入宿主細(xì)胞后被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并因此與宿主基因組一同被復(fù)制。[0135]此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作性連接的基因的表達(dá)。此類(lèi)載體在本文中被稱(chēng)為"表達(dá)載體"。在本文中術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"、"表達(dá)構(gòu)建體"和"重組表達(dá)載體"可以互換使用，一般而言，在重組DNA技術(shù)中用到的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本文中術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"和"載體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用到的載體形式。然而，本發(fā)明也將包括其他形式的表達(dá)載體，例如提供等同的功能的粘粒、病毒載體（例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒）和噬菌體載體。[0136]本發(fā)明的載體可以在體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞，以及用來(lái)生產(chǎn)由本發(fā)明的多核苷酸所編碼的a-淀粉酶。[0137]本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含以適合多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式存在的本發(fā)明的多核苷酸，這意味著所述重組表達(dá)載體包含一個(gè)或更多個(gè)調(diào)控序列，調(diào)控序列是基于被用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來(lái)選擇的，其被可操作地連接到待表達(dá)的多核苷酸序列上。[0138]在重組表達(dá)載體中，"可操作地連接"用于表示：目的核苷酸序列被以允許核苷酸序列的表達(dá)的方式連接到調(diào)控序列上（例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或在載體被引入宿主細(xì)胞時(shí)的宿主細(xì)胞中），即術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"是指并列（juxtaposition),其中所述組分的關(guān)系允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能。"可操作地連接"到編碼序列的調(diào)控序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其他表達(dá)調(diào)控信號(hào)被定位的方式使得編碼序列在與控制序列相容的條件下得到表達(dá)，或者序列被布置以便它們以其預(yù)期目的一起發(fā)揮功能，例如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子處起始并且在編碼多肽的DNA序列上進(jìn)行。[0139]術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件（例如，聚腺苷酸化信號(hào)）°例如，在Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego,CA(1990)中對(duì)此類(lèi)調(diào)控序列進(jìn)行了描述。[0140]術(shù)語(yǔ)調(diào)控序列包括在很多種類(lèi)型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)的序列以及僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的表達(dá)的序列（例如，組織特異性調(diào)控序列）。[0141]給定宿主細(xì)胞的載體或表達(dá)構(gòu)建體可以因此包含以下元件，所述元件以從5'-末端至3'-末端（相對(duì)于編碼第一發(fā)明多肽的序列的編碼鏈）的連續(xù)順序可操作地彼此連接：（1)能夠指導(dǎo)編碼多肽的核苷酸序列在給定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列；（2)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的RNA的翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（3)任選地，能夠指導(dǎo)多肽從給定宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基的信號(hào)序列；(4)本發(fā)明的多核苷酸序列；優(yōu)選地還有（5)能夠終止編碼多肽的核苷酸序列下游的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域（終止子）。[0142]在本發(fā)明的核苷酸序列的下游，可以有含有一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（例如終止子，本文也被稱(chēng)為終止密碼子）的3'非翻譯區(qū)域。終止子的來(lái)源是不太重要的。終止子可以例如對(duì)編碼多肽的DNA序列是天然的。然而優(yōu)選地，細(xì)菌宿主細(xì)胞用細(xì)菌終止子以及絲狀真菌宿主細(xì)胞用絲狀真菌終止子。更優(yōu)選地，終止子對(duì)于宿主細(xì)胞（其中編碼多肽的核苷酸序列將被表達(dá)）是內(nèi)源的。在被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中，可存在用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分將包括起始密碼子，其通常是AUG(或ATG)，但也有替代的起始密碼子，例如GUG(或GTG)和UUG(或TTG)，它們被用于原核生物。而且停止或翻譯終止密碼子被適當(dāng)?shù)囟ㄎ辉趯⒈环g的多肽的末端。[0143]本發(fā)明多核苷酸的增強(qiáng)表達(dá)也可以通過(guò)同源和異源調(diào)控區(qū)域例如啟動(dòng)子、分泌前導(dǎo)物和/或終止子區(qū)域的選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)，其可用于增加表達(dá)以及如果期望的話，增加目的蛋白從表達(dá)宿主中的分泌水平，和/或提供本發(fā)明的多肽表達(dá)的誘導(dǎo)型控制。[0144]本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，對(duì)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可依賴(lài)于以下因素：對(duì)將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白的表達(dá)水平。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入宿主細(xì)胞，以由此生產(chǎn)本文所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)或肽（例如本發(fā)明的具有a-淀粉酶活性的多肽或如本文所述的其變體）。[0145]本發(fā)明的重組表達(dá)載體（本文中也被稱(chēng)為"本發(fā)明的載體"）可被設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的多肽在原核或真核細(xì)胞中的表達(dá)。例如，本發(fā)明的多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞如E.CoIi和Bacilli、昆蟲(chóng)細(xì)胞（使用桿狀病毒表達(dá)載體）、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)。本文以及進(jìn)一步地Goeddel，GeneExpressionTechnology：MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)對(duì)合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行了討論?；蛘?，重組表達(dá)載體可在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及翻譯，例如，使用17啟動(dòng)子調(diào)控序列和17聚合酶。[0146]對(duì)于大部分細(xì)菌、絲狀真菌和酵母，載體或表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選地被整合到宿主細(xì)胞的基因組中來(lái)獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。在表達(dá)構(gòu)建體被整合到宿主細(xì)胞基因組中的情況下，該構(gòu)建體或被整合在基因組的隨機(jī)位點(diǎn)或使用同源重組被整合在預(yù)定的目標(biāo)位點(diǎn)，在這種情況下目標(biāo)位點(diǎn)優(yōu)選地包含高度表達(dá)的基因。[0147]因此，可用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括源自染色體、附加體和病毒的載體，例如作為質(zhì)粒，噬菌體，酵母游離體，酵母附加體的載體，病毒例如桿狀病毒、乳多泡病毒（papovavirus)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及上述物質(zhì)的組合的載體，例如質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件組成的載體，例如粘粒和噬菌粒（phagemid)。[0148]本發(fā)明的多核苷酸應(yīng)當(dāng)被可操作地連接至合適的啟動(dòng)子。除了對(duì)編碼本發(fā)明多肽的基因天然的啟動(dòng)子，其他的啟動(dòng)子亦可以用于指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的表達(dá)。可以根據(jù)指導(dǎo)本發(fā)明的多肽在期望的表達(dá)宿主中表達(dá)的效率來(lái)選擇啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子可以是"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"，其為導(dǎo)致基因的mRNA合成在特定條件下暫時(shí)啟動(dòng)的啟動(dòng)子?；蛘?，啟動(dòng)子可以是"組成型"啟動(dòng)子，即允許基因在幾乎所有的環(huán)境條件下表達(dá)的啟動(dòng)子，即指導(dǎo)恒定的、非特異性基因表達(dá)的啟動(dòng)子?？梢允褂?強(qiáng)組成型啟動(dòng)子"，即相比天然宿主細(xì)胞導(dǎo)致mRNA以高頻率啟動(dòng)的啟動(dòng)子。[0149]在本發(fā)明中，細(xì)菌可以?xún)?yōu)選地被用作用于本發(fā)明多肽的表達(dá)的宿主細(xì)胞，特別是Bacilli。可用于所述宿主細(xì)胞的合適的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括：（i)可以由輔助因子如阻遏子或激活子來(lái)主要調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。阻遏子是抑制啟動(dòng)子活性的序列特異性DNA結(jié)合蛋白。在防止阻遏子與啟動(dòng)子的操縱子結(jié)合的誘導(dǎo)物的存在下，轉(zhuǎn)錄可以從該啟動(dòng)子啟動(dòng)。來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性微生物的此類(lèi)啟動(dòng)子的例子包括但不限于，gnt(葡糖酸鹽/酯操縱子的啟動(dòng)子）；來(lái)自BacillusIicheniformis的penP;glnA(谷氨酰胺合成酶）；xylAB(木糖操縱子）；araABD(L-阿拉伯糖操縱子）和Pspa。啟動(dòng)子，可以由誘導(dǎo)物例如異丙基-P-D-硫代半乳糖批喃糖苷（IPTG)控制的SPOl/lac雜合啟動(dòng)子（YansuraD.G.,HennerD.J.ProcNatlAcadSciUSA.198481(2):439-443)。激活子也是誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性的序列特異性DNA結(jié)合蛋白。來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性微生物的此類(lèi)啟動(dòng)子的例子包括但不限于，雙組分體系（PhoP-PhoR、DegU-DegS、SpoOA_Phosphorelay)、LevR、Mry和GltC。（ii)次級(jí)sigma因子的產(chǎn)生可以主要負(fù)責(zé)來(lái)自特定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性微生物的例子包括但不限于，由芽孢形成特異性sigma因子〇F、〇E、〇^和〇K以及一般性應(yīng)激sigma因子〇B激活的啟動(dòng)子。〇B介導(dǎo)的應(yīng)答由能量限制和環(huán)境應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)（HeckerM，V6lkerU.MolMicrobiol.1998;29(5):1129-1136)。（iii)衰減作用和抗終止作用也調(diào)控轉(zhuǎn)錄。來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性微生物的例子包括但不限于，trp操縱子和sacB基因。（iv)表達(dá)載體中其他受調(diào)控的啟動(dòng)子基于帶來(lái)鹿糖誘導(dǎo)性的sacR調(diào)控體系（KlierAF，RapoportG.AnnuRevMicrobiol.1988;42:65-95)。[0150]強(qiáng)組成型啟動(dòng)子是公知的，并且可以根據(jù)宿主細(xì)胞中要控制的特定序列來(lái)選擇合適的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。可用于細(xì)菌例如Bacilli的合適的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括：來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性微生物的啟動(dòng)子例如但不限于，SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶啟動(dòng)子）和amyE。來(lái)自革蘭氏陰性微生物的啟動(dòng)子的例子包括但不限于，tac、tet、trp_tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、入_PR和入_PL。[0151]可用于細(xì)菌細(xì)胞如Bacilli的啟動(dòng)子的另外的例子包括a-淀粉酶和SP〇2啟動(dòng)子以及來(lái)自細(xì)胞外蛋白酶基因的啟動(dòng)子。[0152]在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列可以從細(xì)菌來(lái)源獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列可以獲得自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如Bacillus菌株，例如Bacillusalkalophilus、Bacillusamyloliquefaciens、Bacillusbrevis、Bacilluscirculans、Bacillusclausii、Bacilluscoagulans、Bacillusfirmus、Bacilluslautus、Bacilluslentus、Bacilluslicheniformis、Bacillusmegaterium、BaciIIuspumilus、BaciIIusstearothermophilus、Bacillussubtilis或Bacillusthuringiensis;或Streptomyces菌株，如Streptomyceslividans或Streptomycesmurinus;或來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌，如E.coli或假單胞菌屬（Pseudomonassp.)。[0153]用于在本發(fā)明的方法中指導(dǎo)多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例是從E.coliIac操縱子中得到的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是Streptomycescoelicolor瓊脂糖酶基因（dagA)的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是BacillusIentus堿性蛋白酶基因（aprH)的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是BacillusIicheniformis堿性蛋白酶基因（枯草桿菌蛋白酶Carlsberg基因）的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是Bacillussubtilis果聚糖蔗糖酶基因（sacB)的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是Bacillussubtilisa-淀粉酶基因（amyF)的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是Bacilluslicheniformisa-淀粉酶基因（amyL)的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是Bacillusstearothermophilus麥芽糖淀粉酶基因（amyM)的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是Bacillusamyloliquefaciensa-淀粉酶基因（amyQ)的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是"_35"區(qū)域具有序列TTGACA和"-10"區(qū)域具有序列TATAAT的"共有序列（consensus)"啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是Bacilluslicheniformis青霉素酶基因（penP)的啟動(dòng)子。另一個(gè)例子是BacillussubtilisxylA和xylB基因的啟動(dòng)子。[0154]可以使用能夠指導(dǎo)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的多種啟動(dòng)子。優(yōu)選地，啟動(dòng)子序列來(lái)自高度表達(dá)的基因。從中可以選擇啟動(dòng)子和/或被包含在用于整合表達(dá)構(gòu)建體的優(yōu)選預(yù)定目標(biāo)位點(diǎn)中的優(yōu)選的高度表達(dá)的基因的例子包括但不限于，編碼糖酵解酶如丙糖-磷酸異構(gòu)酶（TPI)、甘油醛-磷酸脫氫酶（GAPDH)、磷酸甘油酸激酶（PGK)、丙酮酸激酶(PYK或PKI)、醇脫氫酶（ADH)的基因以及編碼淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維二糖水解酶、￠-半乳糖苷酶、醇（甲醇）氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白的基因。合適的高度表達(dá)的基因的具體例子包括例如來(lái)自Kluyveromycessp.的LAC4基因、分別來(lái)自Hansenula與Pichia的甲醇氧化酶基因（A0X和M0X)、來(lái)自A.niger和A.awamori的葡糖淀粉酶（glaA)基因、A.oryzaeTAKA-淀粉酶基因、A.nidulansgpdA基因以及T.reesei纖維二糖水解酶基因。[0155]可以用于真菌表達(dá)宿主細(xì)胞的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括可獲得自木聚糖酶（XlnA)、肌醇六磷酸酶、ATP合成酶、亞基9(oliC)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、醇脫氫酶（AdhA)、a-淀粉酶（amy)、淀粉葡萄糖苷酶（AG-來(lái)自glaA基因）、乙酰胺酶（amdS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gpd)啟動(dòng)子的真菌基因的那些啟動(dòng)子。[0156]所有上述啟動(dòng)子是本領(lǐng)域現(xiàn)有可用的。[0157]載體可以含有反義方向的本發(fā)明的多核苷酸來(lái)提供反義RNA的產(chǎn)生。[0158]載體DNA可以通過(guò)自然感受態(tài)、常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)被引入原核或真核細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"意在指多種用于將外源多核苷酸（例如DNA)引入宿主細(xì)胞的本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染（Iipofection)，陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可以在Sambrook等（同上）和其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到。[0159]為了鑒定和選擇載有載體的細(xì)胞，通常將編碼可選擇標(biāo)記（如抗生素抗性）的基因連同本發(fā)明的多核苷酸一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括但不限于賦予藥物抗性或在宿主細(xì)胞中回補(bǔ)缺陷的那些標(biāo)記。[0160]這樣的標(biāo)記包括ATP合成酶，亞基9(oliC)，乳清苷-5'-磷酸脫羧酶（pvrA)，細(xì)菌G418抗性基因（這也可在酵母中使用，但是不在真菌中使用），氨芐青霉素抗性基因(E.coli)，新霉素、卡那霉素、四環(huán)素、壯觀霉素、紅霉素、氯霉素、腐草霉素（Bacillus)的抗性基因以及E.coliuidA基因，其編碼￠-葡糖醛酸酶（GUS)。載體可以在體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。[0161]它們還包括例如可用于轉(zhuǎn)化大多數(shù)絲狀真菌和酵母的通用標(biāo)記基因，例如乙醜胺酶基因或cDNA(來(lái)自A.nidulans、A.oryzae或A.niger的amdS、niaD、facA基因或cDNA)或提供針對(duì)抗生素如G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤的抗性、腐草霉素orbenomyl的抗性（benA)的基因?；蛘?，可以使用特定的選擇標(biāo)記例如需要相應(yīng)突變宿主菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，例如：D-丙氨酸消旋酶（來(lái)自Bacillus)、URA3(來(lái)自S.cerevisiae或來(lái)自其他酵母的類(lèi)似基因）、pyrG或pyrA(來(lái)自A.nidulans或A.niger)、argB(來(lái)自A.nidulans或A.niger)或trpC。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記在引入表達(dá)構(gòu)建體后從被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中剔除以便獲得能夠生產(chǎn)沒(méi)有選擇標(biāo)記基因的多肽的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。[0162]蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)通常在含有指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白的表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體中進(jìn)行。融合載體將一些氨基酸添加到其中編碼的蛋白質(zhì)上，例如添加到重組蛋白質(zhì)的氨基末端。這些融合載體一般有三個(gè)目的：1)增加重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；2)增加重組蛋白質(zhì)的溶解性；以及3)通過(guò)充當(dāng)親和純化中的配體幫助重組蛋白質(zhì)的純化。通常，在融合表達(dá)載體中，蛋白水解切割位點(diǎn)在融合部分和重組蛋白的交界處引入，以使在純化融合蛋白之后將重組蛋白從融合部分分離。[0163]用于上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。[0164]優(yōu)選地用于細(xì)菌的載體例如在W0-A1-2004/074468中被公開(kāi)，其通過(guò)引用并入本文。其他合適的載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是現(xiàn)成可見(jiàn)的。[0165]如本文所述，本發(fā)明的載體可以被轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞來(lái)提供本發(fā)明多肽的表達(dá)。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明多肽的方法，其包括培養(yǎng)用編碼多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的的宿主細(xì)胞，并回收所表達(dá)的多肽。[0166]宿豐細(xì)朐[0167]本發(fā)明還提供了用用于本發(fā)明多核苷酸的復(fù)制和/或表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的"重組宿主細(xì)胞"，其在本文中也被稱(chēng)為"宿主細(xì)胞"。細(xì)胞將被選擇為與所述載體相容。啟動(dòng)子和其他表達(dá)調(diào)控信號(hào)可以被選擇為與設(shè)計(jì)表達(dá)的宿主細(xì)胞相容。[0168]本發(fā)明的特征包括細(xì)胞，例如包含本發(fā)明的多核苷酸或包含本發(fā)明的載體的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或重組宿主細(xì)胞。[0169]"被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞"或"重組的宿主細(xì)胞"是本發(fā)明的多核苷酸已經(jīng)通過(guò)重組DNA技術(shù)被引入其中（或引入其祖先（ancestor))的細(xì)胞。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞均包括在內(nèi)，例如細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物等。[0170]優(yōu)選的是Bacillus菌株的細(xì)胞，例如Bacillusalkalophilus、Bacillusamyloliquefaciens、Bacillusbrevis、Bacilluscirculans、Bacillusclausii、Bacilluscoagulans、Bacillusfirmus、Bacilluslautus、Bacilluslentus、Bacilluslicheniformis、Bacillusmegaterium、Bacilluspumilus、Bacillusstearothermophilus、Bacillussubtilis或Bacillusthuringiensis;或Streptomyces菌株的細(xì)胞，如Streptomyceslividans或Streptomycesmurinus;或來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌，如E.coli或Pseudomonassp.〇[0171]根據(jù)另一個(gè)方面，宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、真菌或藻類(lèi)的細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞包括例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞、per.C6?細(xì)胞和雜交瘤。許多適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體為公眾可用，構(gòu)建這類(lèi)細(xì)胞系的方法也例如在Ausubel等人（同上）中為公知的。[0172]在一個(gè)實(shí)施方案中，昆蟲(chóng)細(xì)胞包括例如Sf9和Sf2以及它們的衍生物。[0173]在一個(gè)實(shí)施方案中，真核細(xì)胞是真菌細(xì)胞即酵母細(xì)胞，如Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowiastrain。優(yōu)選地來(lái)自Kluyveromyceslactis、S.cerevisiae、Hansenulapolymorpha、Yarrowialipolytica和Pichiapastoris，或絲狀真菌細(xì)胞。[0174]絲狀真菌包括Eumycota和Oomycota亞門(mén)（如Hawksworth等人，在AinsworthandBisby丨sDictionaryofTheFungi,8thedition，1995，CABInternational，UniversityPress，Cambridge，UK所定義）的所有絲狀形式。絲狀真菌的特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、甲殼質(zhì)、甘露聚糖和其他復(fù)合多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過(guò)菌絲延伸并且碳代謝是絕對(duì)好氧的。絲狀真菌菌株包括但不限于Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、MyceIiophthora、NeocalIimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，絲狀真菌細(xì)胞屬于Aspergillus、Chrysosporium、PeniciIlium、Talaromyces、Fusarium或Trichoderma屬的種，并且優(yōu)選地是Aspergillusniger、Aspergillusawamori^Aspergillusfoetidus、Aspergillussojae、Aspergillusfumigatus、Talaromycesemersonii、Aspergillusoryzae、ChrysosporiumIucknowense^Myceliophthorathermophila、Fusariumoxysporum、Trichodermareesei或Penicilliumchrysogenum的種。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是Aspergillusniger。[0175]如果本發(fā)明的宿主細(xì)胞是Aspergillusniger宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地是CBS513.88、CBS124.903或其衍生物。[0176]宿主細(xì)胞可以被選擇為調(diào)節(jié)被插入的序列的表達(dá)，或以特定的、期望的方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的所述修飾（如糖基化）和加工（如切割）可促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)揮最佳功能。[0177]多種宿主細(xì)胞具有用于翻譯后加工和修飾蛋白質(zhì)和基因廣物的特色的和特定的機(jī)制?？梢赃x擇分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)來(lái)確保所產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)的期望的和正確的修飾和加工。為此目的，可以使用具有正確加工初級(jí)轉(zhuǎn)錄本、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。[0178]如果期望，如上文所述的宿主細(xì)胞可以在本發(fā)明多肽的制備中使用。這種方法典型地包括在條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞（例如，如上所述用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的）來(lái)提供編碼多肽的編碼序列的表達(dá)（通過(guò)載體）并且任選地從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收，更優(yōu)選地回收并純化生產(chǎn)的多肽。本發(fā)明的多核苷酸可以被整合入重組的可復(fù)制載體例如表達(dá)載體中。載體可用來(lái)在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制多核苷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的多核苷酸的方法，其通過(guò)將本發(fā)明的多核苷酸引入可復(fù)制的載體、將載體引入相容的宿主細(xì)胞并且在使得載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。載體可以從宿主細(xì)胞中回收。[0179]優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是作為分泌蛋白生產(chǎn)的，在此情況下在表達(dá)構(gòu)建體中編碼成熟形式的多肽的核苷酸序列可操作地連接至編碼信號(hào)序列的核苷酸序列。優(yōu)選地信號(hào)序列對(duì)于編碼多肽的核苷酸序列是天然的（同源的），本文也被稱(chēng)為"野生型"?；蛘?，信號(hào)序列對(duì)于編碼多肽的核苷酸序列是外源的（異源的），在這種情況下信號(hào)序列優(yōu)選地對(duì)于本發(fā)明核苷酸序列在其中被表達(dá)的宿主細(xì)胞是內(nèi)源的。用于Bacilli的合適的信號(hào)序列的例子是來(lái)自Bacillussubtilis的amyE、yurlfliL、vpr、glpQ、phy、lytC、ywsB、ybbD、ybxI、yolA、ylqB、ybbC、pel、yckD、ywaD、ywmD、yweA、yraj、dacF、yfjS、yybN、yrpD、yvcE、wprA、yxaL、ykwD、yncM2、sacB、phrC、SacC、yoqM、ykoj、lip、yfkN、yurl、ybfO、yfkD、yoaj、xynA、penP、ydjM、yddT、yojL、yomL、yqxl、yrvj、yvpA、yjcM、yjfA、ypjP、ggt、yoqH、ywtD、ylaE、yraj、lytB、lytD、nprB、nucB、rplR、yfhK、yjdB、ykvV、ybbE、yuiC、ylbL、yacD、yvpB基因。合適的酵母信號(hào)序列是來(lái)自酵母a-因子基因的信號(hào)序列。類(lèi)似地，用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適的信號(hào)序列例如是來(lái)自絲狀真菌淀粉葡糖苷酶（AG)基因例如A.nigerglaA基因的信號(hào)序列。這可與淀粉葡糖苷酶（也稱(chēng)為（葡糖）淀粉酶）啟動(dòng)子自身組合使用，以及與其他的啟動(dòng)子組合使用。雜合信號(hào)序列也可以用于本發(fā)明的上下文。[0180]優(yōu)選的異源分泌前導(dǎo)序列是源自真菌淀粉葡糖苷酶（AG)基因（glaA-例如來(lái)自Aspergillus的18個(gè)和24個(gè)氨基酸的兩個(gè)版本）、a-因子基因（酵母例如Saccharomyces和Kluyveromyces)或a-淀粉酶（amyE、amyQ和amyL)和堿性蛋白酶aprE和天然蛋白酶基因（Bacillus)的那些。載體可以被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到如上所述的合適的宿主細(xì)胞中來(lái)提供本發(fā)明多肽的表達(dá)。該過(guò)程可以包括在條件下培養(yǎng)用如上所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來(lái)提供編碼多肽的編碼序列的載體的表達(dá)。[0181]本發(fā)明因此提供了用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的或包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，用于多核苷酸的復(fù)制和表達(dá)的載體中攜帶有多核苷酸。細(xì)胞將被選擇為與所述載體相容，并且可以例如是原核生物（例如細(xì)菌）、真菌、酵母或植物的細(xì)胞。[0182]也可以選擇異源宿主細(xì)胞，其中本發(fā)明的多肽以基本上沒(méi)有可干擾應(yīng)用的酶活性的形式被生產(chǎn)，例如沒(méi)有淀粉降解、纖維素降解或半纖維素降解酶。這可以通過(guò)選擇在正常情況下不生產(chǎn)這些酶的宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。[0183]本發(fā)明包括通過(guò)編碼多肽的DNA序列的重組表達(dá)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。為此目的，本發(fā)明的DNA序列可用于基因擴(kuò)增和/或表達(dá)信號(hào)如啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列的交換，以使得在合適的同源或異源宿主細(xì)胞中經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)多肽。同源宿主細(xì)胞是與獲得DNA序列的物種屬于相同種或是相同種內(nèi)的變種的宿主細(xì)胞。[0184]宿主細(xì)胞可過(guò)表達(dá)多肽，并且改造成過(guò)表達(dá)的技術(shù)是公知的。因此宿主可以具有編碼多核苷酸的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝（因此載體也可相應(yīng)地具有兩個(gè)或更多個(gè)拷貝）。[0185]因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞能夠表達(dá)或過(guò)表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸或載體。[0186]本發(fā)明的另一個(gè)方面是生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括（a)在條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞以便生產(chǎn)本發(fā)明的多肽；以及（b)任選地從細(xì)胞培養(yǎng)基中回收本發(fā)明的多肽。[0187]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明多肽的生產(chǎn)可以通過(guò)在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞來(lái)完成，所述宿主細(xì)胞已經(jīng)用本發(fā)明的一個(gè)或更多個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的方法包括在條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞以便生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的步驟。[0188]本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的程序進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于啟動(dòng)子和宿主細(xì)胞的每個(gè)組合，有利于編碼多肽的DNA序列的表達(dá)的培養(yǎng)條件是可獲得的。在達(dá)到期望的細(xì)胞密度或多肽滴度后停止培養(yǎng)，用已知的程序回收多肽。[0189]術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)"包括使本發(fā)明的活重組宿主細(xì)胞特別是本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞維持和/或生長(zhǎng)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在另一個(gè)方面，重組宿主細(xì)胞在固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。[0190]優(yōu)選地，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞在含有對(duì)重組宿主細(xì)胞的維持和/或生長(zhǎng)必需的或有利的營(yíng)養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這樣的營(yíng)養(yǎng)物包括但不限于碳源或碳底物，如復(fù)合碳水化合物如豆類(lèi)或谷物粉、淀粉、糖、糖醇、碳?xì)浠衔?、油、脂肪、脂肪酸、有機(jī)酸和醇；氮源，如從谷類(lèi)、豆類(lèi)和塊莖中獲得的植物蛋白、胨、肽和氨基酸，從動(dòng)物來(lái)源如肉、乳和動(dòng)物副產(chǎn)物如胨、肉提取物和酪蛋白水解物獲得的蛋白質(zhì)、肽和氨基酸；無(wú)機(jī)氮源，如尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和磷酸銨；磷源，如磷酸、其鈉和鉀鹽；微量元素，例如鎂、鐵、錳、鈣、銅、鋅、硼、鑰和/或鈷鹽；以及生長(zhǎng)因子如氨基酸、維生素、生長(zhǎng)促進(jìn)劑，等等。[0191]合適培養(yǎng)基的選擇可以基于表達(dá)宿主的選擇即重組宿主細(xì)胞的選擇和/或基于表達(dá)構(gòu)建體的調(diào)控需求。這樣的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如果期望，培養(yǎng)基可以含有相比其他潛在的污染微生物更有利于被轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主的額外的組分。[0192]可以在液體培養(yǎng)基中連續(xù)或間歇地通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)方法如靜置培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)或發(fā)酵來(lái)培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，在發(fā)酵器中培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明的發(fā)酵方法包括發(fā)酵的分批法、補(bǔ)料分批法和連續(xù)法。多種這樣的工藝已被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并且在本領(lǐng)域是眾所周知的。[0193]優(yōu)選地在受控的pH下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在4.5和8.5之間、優(yōu)選地6.0和8.5之間、更優(yōu)選地約7的pH下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞。期望的pH值可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)維持。[0194]優(yōu)選地，還在受控的通風(fēng)和受控的溫度下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，受控的溫度包括15°C和70°C之間、優(yōu)選地20°C和55°C之間、更優(yōu)選地30°C和50°C之間的溫度。[0195]通常基于表達(dá)宿主和要生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的選擇來(lái)選擇適當(dāng)?shù)臈l件。[0196]發(fā)酵后，如果必要，可以通過(guò)離心分離或過(guò)濾將細(xì)胞從發(fā)酵液中除去。發(fā)酵停止或除去細(xì)胞之后，然后可以回收本發(fā)明的多肽并且如果期望，通過(guò)常規(guī)手段進(jìn)行純化和分離，所述常規(guī)方法包括但不限于用常規(guī)樹(shù)脂處理、用常規(guī)吸附劑處理、改變pH、溶劑萃取、透析、過(guò)濾、濃縮、結(jié)晶、重結(jié)晶、pH調(diào)節(jié)、凍干等。[0197]例如，本發(fā)明的a-淀粉酶可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化（ProteinPurificationProtocols,MethodsinMolecularBiologyseries,PaulCutler,HumanaPress,2004)〇[0198]通常，當(dāng)所得到的制劑基本上不含其他成分時(shí)，化合物是"分離的"。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑的純度大于所期望化合物的約80%(干重）（例如小于約20%的所有培養(yǎng)基、組分或發(fā)酵副產(chǎn)物），在另一個(gè)實(shí)施方案中大于所期望化合物的約90%，在另一個(gè)實(shí)施方案中大于所期望化合物的約95%，在另一個(gè)實(shí)施方案中大于所期望化合物的約98%至99%。[0199]然而或者，所期望化合物不從重組宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中純化。整個(gè)培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液可作為產(chǎn)品的來(lái)源。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液而無(wú)需改造。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液被濃縮、干燥和/或凍干。[0200]本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞能夠在合適的條件下生產(chǎn)本發(fā)明的多肽化合物。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽的生產(chǎn)意味著每升培養(yǎng)基生產(chǎn)至少約50mg、約100mg、約200mg、約500mg、約lg、約3g、約5g或約IOg的本發(fā)明的多肽。[0201]酶的制各[0202]在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中在有氧條件下培養(yǎng)Bacillus菌株DSM-AMB154-1(見(jiàn)實(shí)施例）。[0203]-種合適的培養(yǎng)基介質(zhì)除無(wú)機(jī)鹽以外可以含有可吸收的碳源和氮源，以及任選的生長(zhǎng)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物如酵母提取物。發(fā)酵通常是在35-40°C以及在6.5-7.5的pH下進(jìn)行并且優(yōu)選地由自動(dòng)裝置保持大致恒定。酶被排入培養(yǎng)基中。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，如果需要，生產(chǎn)宿主可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段殺死。隨后的發(fā)酵液可以通過(guò)例如過(guò)濾或離心從中清除細(xì)菌細(xì)胞、殘?jiān)推渌腆w物。含有酶的濾液或上清液可以通過(guò)例如過(guò)濾或離心進(jìn)一步澄清，然后，通過(guò)例如超濾或在減壓下的蒸發(fā)設(shè)備來(lái)按照需要被濃縮以得到濃縮物，如果期望所述濃縮物可以通過(guò)例如凍干或噴霧干燥進(jìn)行干燥。通常情況下，得到的粗的酶產(chǎn)品具有每g約10,000-500,000MU的范圍的活性。[0204]本發(fā)明的多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列：[0205]本發(fā)明涉及編碼具有a_淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其包含：[0206](a)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或[0207](b)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽與具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5%的同一性；或[0208](c)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列；或[0209](d)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列。[0210]本發(fā)明的多核苷酸編碼a-淀粉酶。[0211]在本發(fā)明的多核苷酸的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸為分離的多核苷酸，其包含：[0212](a)SEQIDNO:1或3所示的多核苷酸序列；或[0213](b)SEQIDNO:1或3的多核苷酸序列的第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列（為免生疑義，包括第100位和第2157位核苷酸）；或[0214](c)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列（為免生疑義，包括第34位和第719位氨基酸）。[0215]在本發(fā)明的多核苷酸的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸是由AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276產(chǎn)生的。[0216]在本發(fā)明的多核苷酸的另一個(gè)方面，分離的多核苷酸是由AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276產(chǎn)生的。[0217]本發(fā)明的載體包含本發(fā)明的多核苷酸序列。[0218]在本發(fā)明的載體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是表達(dá)載體，其中本發(fā)明的多核苷酸序列可操作地與至少一種調(diào)控序列連接，所述調(diào)控序列允許多核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)。[0219]合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌，包括Escherichia、Anabaena、Caulobactert、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces。在本發(fā)明載體的一個(gè)方面，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，其選自B.subtilis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、G.oxydans、CaulobactertcrescentusCB15、Methylobacteriumextorquens、Rhodobactersphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Paracoccusdenitrificans、C.glutamicum、Staphylococcuscarnosus、StreptomycesIividans、Sinorhizobiummelioti和Rhizobiumradiobacter組成的組。[0220]在本發(fā)明載體的另一實(shí)施方案中，合適的宿主細(xì)胞是Aspergillus、Bacillus、Chrysosporium、Escherichia、Kluyveromyces、Penicillium、Pseudomonas、Saccharomyces、Streptomyces或Talaromyces的種，優(yōu)選地宿主細(xì)胞是Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Escherichiacoli、AspergillusNiger或Aspergillusoryzae種。[0221]本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可以包含本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體。[0222]在本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞的一個(gè)實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞能夠表達(dá)或過(guò)表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體。[0223]用于制造本發(fā)明多核苷酸或本發(fā)明載體的本發(fā)明方法包括以下步驟，培養(yǎng)用所述多核苷酸或所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并從所述宿主細(xì)胞中分離所述多核苷酸或所述載體。[0224]本發(fā)明的多肽包含：[0225]a-淀粉酶多肽，其包含：[0226](a)SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或[0227](b)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少99.5%的同一性的氨基酸序列；或[0228](c)由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸編碼的氨基酸序列；或[0229](d)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)的氨基酸序列，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義；或[0230](e)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)的氨基酸序列，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義，并且所述氨基酸序列的特征在于，當(dāng)被用于制備具有基于面粉的至少5wt%的糖的烘焙產(chǎn)品時(shí)，所述烘焙產(chǎn)品相比不使用所述氨基酸序列制備的烘焙產(chǎn)品具有減小的貯存后硬度。[0231]在本發(fā)明的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是分離的多肽，其包含：[0232](a)SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或[0233](b)由SEQIDNO:1或3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸編碼的氨基酸序列；或[0234](c)根據(jù)（b)的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是由AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276產(chǎn)生的。[0235]在本發(fā)明的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸或或本發(fā)明的載體可獲得所述多肽。[0236]制造本發(fā)明多肽的本發(fā)明方法包括，在允許本發(fā)明多核苷酸或本發(fā)明載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞，并且任選地從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所編碼的多肽。[0237]在制造本發(fā)明多肽的本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在允許載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含所述載體的宿主細(xì)胞，并且任選地從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所編碼的多肽，所述載體包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：[0238](a)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列；或[0239](b)SEQIDNO:1或3的多核苷酸序列的第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列（為免生疑義，包括第100位和第2157位核苷酸）；或[0240](c)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列（為免生疑義，包括第34位和第719位氨基酸）。[0241]在制造本發(fā)明多肽的本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在允許多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含所述多核苷酸的宿主細(xì)胞，并且任選地從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所編碼的多肽，所述多核苷酸包含：[0242](a)SEQIDNO:1或3所示的多核苷酸序列；或[0243](b)SEQIDNO:1或3的多核苷酸序列的第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列（為免生疑義，包括第100位和第2157位核苷酸）；或[0244](c)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列（為免生疑義，包括第34位和第719位氨基酸）。[0245]本發(fā)明的多肽可以用于食品制造。[0246]在用于食品制造的一個(gè)實(shí)施方案中，用途是制造烘焙產(chǎn)品，其包括但不限于面包或蛋糕。[0247]本發(fā)明的酶組合物包含本發(fā)明的多肽以及一個(gè)或更多個(gè)選自奶粉，麩質(zhì)，粒狀脂肪，額外的酶，氨基酸，鹽，氧化劑（包括抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺（ADA))，還原劑(包括L-半胱氨酸），乳化劑（包括單/二甘油酯、單甘油酯如單硬脂酸甘油酯（GMS)、硬脂酰乳酸鈉（SSL)、硬脂酰乳酸鈣（CSL)、脂肪酸聚甘油酯（PGE)和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯（DATEM)，膠（包括瓜爾豆膠和黃原膠），調(diào)味劑，酸（包括檸檬酸、丙酸），淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑（包括甘油）以及防腐劑組成的組的組分。[0248]在本發(fā)明酶組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，額外的酶是脂解酶，優(yōu)選地是磷脂酶、半乳糖脂酶或具有磷脂酶活性和半乳糖脂酶兩種活性的酶。[0249]在本發(fā)明的酶組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，額外的酶是磷脂酶。[0250]在本發(fā)明的酶組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，額外的酶是半乳糖脂酶。[0251]在本發(fā)明的酶組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，額外的酶是具有磷脂酶與半乳糖脂酶兩種活性的酶。[0252]本發(fā)明的制備面團(tuán)的方法包括將本發(fā)明多肽或本發(fā)明酶組合物與至少一種面團(tuán)成分相組合的步驟。"組合"包括但不限于將本發(fā)明的多肽或酶組合物加入到至少一種面團(tuán)成分中，將至少一種面團(tuán)成分加入到本發(fā)明的多肽或酶組合物中，將本發(fā)明的多肽和至少一種面團(tuán)成分混合。[0253]面團(tuán)成分包括選自以下的組分：面粉，蛋，水，鹽，糖，調(diào)味劑，脂肪（包括黃油、人造黃油、油和起酥油（shortening))，發(fā)面酵母（baker'syeast),化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)（chemicalleaveningsystems),奶，氧化劑（包括抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺（ADA))，還原劑(包括L-半胱氨酸），乳化劑（包括單/二甘油酯、單甘油酯如單硬脂酸甘油酯（GMS)、硬脂酰乳酸鈉（SSL)、硬脂酰乳酸鈣（CSL)、脂肪酸聚甘油酯（PGE)和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯（DATEM)，膠（包括瓜爾豆膠和黃原膠），酸（包括檸檬酸、丙酸），淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑（包括甘油）和防腐劑。[0254]在本發(fā)明的制備面團(tuán)的方法的一個(gè)方面，所述方法包括將本發(fā)明的多肽與選自以下的至少一種組分相組合的步驟：面粉，蛋，水，鹽，糖，調(diào)味劑，脂肪（包括黃油、人造黃油、油和起酥油），發(fā)面酵母，化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)，奶，氧化劑（包括抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺（ADA))，還原劑（包括L-半胱氨酸），乳化劑（包括單/二甘油酯、單甘油酯如單硬脂酸甘油酯（GMS)、硬脂酰乳酸鈉（SSL)、硬脂酰乳酸鈣（CSL)、脂肪酸聚甘油酯（PGE)和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯（DATEM)，膠（包括瓜爾豆膠和黃原膠），酸（包括檸檬酸、丙酸），淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑（包括甘油）和防腐劑。[0255]在本發(fā)明的制備面團(tuán)的方法的一個(gè)方面，所述方法包括將本發(fā)明的酶組合物與選自以下的至少一種組分相組合的步驟：面粉，蛋，水，鹽，糖，調(diào)味劑，脂肪（包括黃油、人造黃油、油和起酥油），發(fā)面酵母，化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)，奶，氧化劑（包括抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺（ADA))，還原劑（包括L-半胱氨酸），乳化劑（包括單/二甘油酯、單甘油酯如單硬脂酸甘油酯（GMS)、硬脂酰乳酸鈉（SSL)、硬脂酰乳酸鈣（CSL)、脂肪酸聚甘油酯（PGE)和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯（DATEM)，膠（包括瓜爾豆膠和黃原膠），酸（包括檸檬酸、丙酸），淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑（包括甘油）和防腐劑。[0256]以上兩方面的"組合"包括但不限于，將本發(fā)明的多肽或酶組合物添加至上述的至少一種組分中，將上述的至少一種組分添加至本發(fā)明的多肽或酶組合物中，將本發(fā)明的多肽和上述的至少一種組分混合。[0257]本發(fā)明的面團(tuán)可以包含本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的酶組合物。[0258]本發(fā)明的制備烘焙產(chǎn)品的方法包括烘焙本發(fā)明的面團(tuán)的步驟。[0259]在制備烘焙產(chǎn)品的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括烘焙包含本發(fā)明多肽的面團(tuán)。[0260]在制備烘焙產(chǎn)品的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括烘焙包含本發(fā)明酶組合物的面團(tuán)。[0261]在制備烘焙產(chǎn)品的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述烘焙產(chǎn)品是面包或蛋糕。[0262]本發(fā)明的烘焙產(chǎn)品可通過(guò)本發(fā)明的制備烘焙產(chǎn)品的方法獲得。[0263]本發(fā)明的制備多肽的方法包括使用AlicyclobacilluspohliaeNCIMB14276,所述多肽與以下物質(zhì)有至少60%的同一性、在一個(gè)實(shí)施方案中有至少70%的同一性、在一個(gè)實(shí)施方案中有至少80%的同一性、在一個(gè)實(shí)施方案中有至少85%的同一性、在一個(gè)實(shí)施方案中有至少90%的同一性、在一個(gè)實(shí)施方案中具有至少95%的同一性，所述物質(zhì)為[0264](a)具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽；或[0265](b)與具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5%的同一性的多肽；或[0266](c)由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸編碼的氨基酸序列。[0267]本發(fā)明的a-淀粉酶是淀粉降解酶。a-淀粉酶的活性可以合適地使用由美國(guó)谷物化學(xué)家協(xié)會(huì)（AmericanAssociationofCerealChemists，AACC)推薦的Ceralpha_K_程序確定。[0268]脂解酶（本文中也稱(chēng)為脂肪酶）是水解甘油三酯和/或半乳糖脂和或磷脂的酶。[0269]脂肪酶的活性可以用分光光度法通過(guò)使用顯色底物棕櫚酸對(duì)硝基苯基酯（pNPP，SigmaN-2752)來(lái)測(cè)定。在該測(cè)試中，pNPP溶解于2-丙醇（每IOml2-丙醇（Merk1.09634)40mgpNPP)，并懸浮于pH=5.0含1.0%的TritonX-100(Merkl.12298)的IOOmM乙酸鹽緩沖液中（45ml緩沖液中5ml底物）。最終的底物濃度為I.ImM。脂肪酶用該底物溶液在37°C下孵育10分鐘。通過(guò)相對(duì)于所述反應(yīng)混合物以I:1的比例加入終止緩沖液2%Tris(Merk1.08387)+1%的TritonX-100將反應(yīng)終止，然后形成的對(duì)硝基苯酚（pNP)在405nm下測(cè)定。該測(cè)定也可以在不同的pH值下進(jìn)行，以確定脂肪酶的pH依賴(lài)性。應(yīng)當(dāng)理解的是，不同的pH值可需要不同的緩沖液，或?yàn)榱巳榛孜锊煌那鍧崉┤ノ劭赡苁潜匾?。一個(gè)脂肪酶單位被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1微摩爾的對(duì)硝基苯酚的酶的量。應(yīng)當(dāng)明白，下述內(nèi)容不是常規(guī)分析中不常見(jiàn)的實(shí)踐：使用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)酶溶液（其具有在不同的測(cè)定中測(cè)定的已知活性）校正給定的測(cè)定的活性（其具有在校準(zhǔn)測(cè)定中將被測(cè)定的單位）。[0270]或者，脂肪酶活性可以通過(guò)使用2,3_巰基-1-丙醇-丁酸（TBDMP)作為底物來(lái)測(cè)定。脂肪酶水解TBDMP的硫酯鍵從而解放丁酸以及2,3-巰基-1-丙醇-二丁酸酯、2,3-巰基-1-丙醇-單丁酸酯或2,3-巰基-1-丙醇。釋放的硫醇基在隨后的反應(yīng)中用4,4,-二硫代二吡啶（DTDP)滴定形成4-硫代吡啶酮。后者與在334nm吸收的4-巰基吡啶處于互變異構(gòu)平衡。反應(yīng)在含有〇?2%的Triton-X100、0.65mM的TBDMP和0?2mM的DTDP的pH5.00.IM醋酸鹽緩沖液中在37°C下進(jìn)行。一個(gè)脂肪酶單位被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1微摩爾的4-硫代吡啶酮的酶的量。[0271]除了分光光度測(cè)量，脂肪酶活性還可以使用滴定測(cè)量來(lái)測(cè)定。例如脂解酶的酯酶活性可以根據(jù)FoodChemicalCodex，F(xiàn)orthEdition，NationalAcademyPress，1996，p803在三丁酸甘油酯作為底物時(shí)測(cè)量。[0272]磷脂酶是催化脂肪?；鶑牧字嗅尫诺拿浮Ｆ淇梢允橇字窤2(PLA2,EC3.I.1.4)或磷脂酶Al(EC3.I.1.32)。其可以或可以不具有其他的活性，如三酰甘油脂肪酶（EC3.I.1.3)和/或半乳糖脂酶（EC3.I.1.26)的活性。[0273]磷脂酶可以是來(lái)自哺乳動(dòng)物或微生物來(lái)源的天然酶。[0274]哺乳動(dòng)物磷脂酶的一個(gè)例子是胰腺PLA2，例如?；蜇iPLA2，例如商業(yè)產(chǎn)品LecitaseIOL(豬PLA2,NovozymesA/S的產(chǎn)品）。[0275]微生物的磷脂酶可以來(lái)自鐮孢菌屬（Fusarium)，如F.oxysporum磷脂酶Al(W01998/026057)、F.venenatum磷脂酶Al(作為磷脂酶A2被描述在WO2004/097012中，稱(chēng)為FvPLA2)，來(lái)自塊菌屬（Tuber)，例如T.borchii磷脂酶A2(稱(chēng)為T(mén)bPLA2，TO2004/097012)。[0276]磷脂酶還可以是具有磷脂酶活性的脂解酶變體，例如如W02000/032758或WO2003/060112所描述的。[0277]磷脂酶也可催化脂肪?；鶑拇嬖谟诿鎴F(tuán)的其他脂質(zhì)特別是小麥脂質(zhì)中釋放。因此，磷脂酶可以具有三酰甘油脂肪酶活性（EC3.1.1.3)和/或半乳糖脂酶活性（EC3.I.1.26)〇[0278]磷脂酶可以是如W02009/106575中所述的脂解酶，如商業(yè)產(chǎn)品panamoreK,DSM的產(chǎn)品。[0279]術(shù)語(yǔ)"烘焙產(chǎn)品"指的是由面團(tuán)制備的烘焙食品。[0280]可以有利地通過(guò)本發(fā)明生產(chǎn)的烘焙產(chǎn)品（不管是白、黑或粗面粉（whole-meal)類(lèi)型）的例子包括，通常為面包塊或面包卷形式的面包（特別是白面包、粗面粉面包或黑麥面包）、法棍型（Frenchbaguette-type)面包、油酥糕點(diǎn)（pastries)、牛角面包、黃油雞蛋面包（brioche)、意大利節(jié)日蛋糕（panettone)、通心粉、面條（煮或（翻）炒）、皮塔餅和其他扁面包、玉米餅、玉米卷、蛋糕、煎餅、餅干尤其是酥餅干（biscuits)、甜甜圈、包括酵母發(fā)酵的甜甜圈、百吉餅、餡餅皮、饅頭、脆面包、布朗尼、單層蛋糕（sheetcakes)、休閑食品（如椒鹽卷餅（pretzel)、玉米片、合成點(diǎn)心、合成薯片）。術(shù)語(yǔ)烘焙產(chǎn)品包括，含有2-30Wt%糖的面包、含有水果的面包、早餐谷物、谷物棒、不含蛋的蛋糕、軟面包卷和無(wú)麩質(zhì)面包。此處及之后的無(wú)麩質(zhì)面包是含有至多20ppm的麩質(zhì)的面包。幾種谷類(lèi)和淀粉來(lái)源被認(rèn)為是對(duì)于無(wú)麩質(zhì)飲食可以接受的。常用的來(lái)源是土豆、大米和木薯淀粉（tapioca)(來(lái)自木薯（cassava))。烘焙產(chǎn)品包括但不限于模制面包、面包塊、絞花面包、小圓面包如漢堡小圓面包或小圓慢頭、印度薄餅（chapati)、面包干、干慢頭片、面包屑、無(wú)酵餅（matzos)、佛卡夏面包（focaccia)、梅爾巴吐司（melbatoast)、特制加蛋烤面包片（zwieback)、烤面包?。╟routons)、軟脆餅干、軟和硬面包、面包條、酵母發(fā)酵和化學(xué)發(fā)酵的面包、疊層面團(tuán)產(chǎn)品如丹麥糕點(diǎn)、牛角面包或泡芙糕點(diǎn)產(chǎn)品、松餅（muffin)、丹麥包、百吉餅、糖果包衣、薄餅干(crackers)、威化餅、比薩餅皮、玉米餅、通心粉產(chǎn)品、油煎薄餅、華夫餅、半烘焙（parbaked)產(chǎn)品及冷藏的和冷凍的面團(tuán)產(chǎn)品。[0281]半烘焙產(chǎn)品的例子包括但不限于在銷(xiāo)售或消費(fèi)時(shí)通過(guò)短暫的第二烘焙過(guò)程完成的部分烘焙的面包。[0282]面包可以是白的盤(pán)式面包（panbread)或棕的盤(pán)式面包；這種面包可以例如使用所謂的美式中種發(fā)酵法（SpongeandDoughMethod)或美式直接方法（Directmethod)來(lái)制造。[0283]本文中的術(shù)語(yǔ)玉米餅包括玉米玉米餅和小麥玉米餅。玉米玉米餅是薄的、扁的面包的類(lèi)型，通常由細(xì)磨的玉米（maize)(在美國(guó)通常稱(chēng)為"玉米（corn)"）未經(jīng)發(fā)酵制成。面粉玉米餅是薄的、扁的面包類(lèi)型，通常由細(xì)磨小麥面粉未經(jīng)發(fā)酵制成。術(shù)語(yǔ)玉米餅還包括來(lái)自南美的被稱(chēng)作阿瑞巴（Ar印a)的類(lèi)似面包，盡管阿瑞巴通常比玉米餅厚得多。術(shù)語(yǔ)玉米餅還包括烙餅（Iaobing)，一種來(lái)自中國(guó)的比薩形狀的厚"煎餅"，以及基本上由小麥面粉制成的印度烤餅（IndianRoti)。玉米餅通常具有圓形或橢圓形的形狀，并且可以有約6至超過(guò)30cm的直徑變化。[0284]術(shù)語(yǔ)"面團(tuán)"在本文定義為面粉和其他成分的混合物。一方面，面團(tuán)足夠緊實(shí)以揉捏或滾動(dòng)。面團(tuán)可以是新鮮的、冷凍的、制備好的或半烘焙的。冷凍面團(tuán)的制備由Kulp與Lorenz在ForzenandRefrigeratedDoughsandBatters中描述。[0285]面團(tuán)用面團(tuán)成分制作，所述面團(tuán)成分包括但不限于（谷物）面粉，卵磷脂來(lái)源包括蛋，水，鹽，糖，調(diào)味劑，脂肪來(lái)源包括黃油、人造黃油、油和起酥油，發(fā)面酵母、化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)如酸（產(chǎn)生化合物）和碳酸氫鹽的組合，蛋白質(zhì)來(lái)源包括奶、大豆粉，氧化劑（包括抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺（ADA))，還原劑（包括L-半胱氨酸），乳化劑（包括單/二甘油酯、單甘油酯如單硬脂酸甘油酯（GMS)、硬脂酰乳酸鈉（SSL)、硬脂酰乳酸鈣（CSL)、脂肪酸聚甘油酯（PGE)和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯（DATEM)，膠（包括瓜爾豆膠和黃原膠），調(diào)味劑，酸（包括檸檬酸、丙酸），淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑（包括甘油）和防腐劑。[0286]谷物包括玉米、水稻、小麥、大麥、高粱、小米、燕麥、黑麥、黑小麥、蕎麥、藜麥、斯佩爾特小麥、單粒小麥、二粒小麥、硬粒小麥和卡姆小麥。[0287]面團(tuán)通常是由基本面團(tuán)成分制作，所述基本面團(tuán)成分包括（谷物）面粉如小麥花或米粉、水和任選地鹽。對(duì)于被發(fā)酵的產(chǎn)品，主要使用發(fā)面酵母，接著是例如酸（產(chǎn)生化合物）和碳酸氫鹽的組合的化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)。[0288]本文的術(shù)語(yǔ)面團(tuán)包括面糊。面糊是一種或更多種面粉與例如水、牛奶或蛋的液體相組合的半液體混合物，其足夠稀薄，能夠從勺中落下或倒出，其用于制備多種食品包括蛋糕。[0289]面團(tuán)可以使用混合料制作，所述混合料包括蛋糕混合料、酥餅干混合料、布朗尼混合料、面包混合料、煎餅混合料和油煎薄餅混合料。[0290]術(shù)語(yǔ)面團(tuán)包括冷凍的面團(tuán)，也被稱(chēng)為冷藏的面團(tuán)。有不同類(lèi)型的冷凍的面團(tuán)；在發(fā)面前冷凍的面團(tuán)和在部分或完全發(fā)面階段之后冷凍的面團(tuán)。冷凍的面團(tuán)通常用于制造烘焙產(chǎn)品，包括但不限于酥餅干、面包、面包條和牛角面包。[0291]本發(fā)明還涉及本發(fā)明a_淀粉酶在一些工業(yè)方法中的使用。盡管對(duì)于這些方法獲得了長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)，但是本發(fā)明的a-淀粉酶可具有優(yōu)于目前使用的酶的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)特定的應(yīng)用，這些優(yōu)勢(shì)可包括以下方面，如更低的生產(chǎn)成本、對(duì)底物的更高的特異性、更少的抗原性（antigenic)，更少的不期望的副活性，在合適的微生物中的更高的產(chǎn)率、更合適的pH和溫度范圍、最終產(chǎn)品的更好的口味以及食品級(jí)和按猶太教可食（kosher)。[0292]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的a-淀粉酶可以用于食品工業(yè)，包括用于食品制造。[0293]本發(fā)明a_淀粉酶在食品的工業(yè)應(yīng)用的一個(gè)例子是其使用在烘焙應(yīng)用中。本發(fā)明的a-淀粉酶可以例如在烘焙產(chǎn)品例如面包或蛋糕中使用。例如以改進(jìn)面團(tuán)和/或烘焙產(chǎn)品的質(zhì)量。[0294]因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了本發(fā)明的a-淀粉酶在制備面團(tuán)中的使用并且提供了包含本發(fā)明a-淀粉酶的面團(tuán)。本發(fā)明還提供了面團(tuán)的制備，其包括將本發(fā)明的a-淀粉酶添加到至少一種面團(tuán)成分中的步驟。[0295]酵母、酶和任選的添加劑一般被單獨(dú)加入到面團(tuán)。[0296]酶可以以例如粒化的干燥形式、液體形式或糊狀形式添加。添加劑在大多數(shù)情況下以粉末形式添加。合適的添加劑包括氧化劑（包括抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺(ADA))，還原劑（包括L-半胱氨酸），乳化劑（包括單/二甘油酯、單甘油酯如單硬脂酸甘油酯（GMS)、硬脂酰乳酸鈉（SSL)、硬脂酰乳酸鈣（CSL)、脂肪酸聚甘油酯（PGE)和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯（DATEM)，膠（包括瓜爾豆膠和黃原膠），調(diào)味劑，酸（包括檸檬酸、丙酸），淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑（包括甘油）和防腐劑。[0297]由面團(tuán)成分制備面團(tuán)是本領(lǐng)域公知的，其包括混合所述成分以及任選的一個(gè)或更多個(gè)模制和發(fā)酵步驟。[0298]由所述面團(tuán)制備烘焙產(chǎn)品也是本領(lǐng)域公知的，并且可以包括模制和成形以及在要求的溫度和烘焙時(shí)間下烘焙之后的進(jìn)一步發(fā)酵。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備烘焙產(chǎn)品的方法，其包括烘焙本發(fā)明的面團(tuán)的步驟。烘焙面團(tuán)來(lái)制備烘焙產(chǎn)品可以使用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。本發(fā)明還提供了根據(jù)該方法可獲得的烘焙產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的烘焙產(chǎn)品是面包或蛋糕。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的a-淀粉酶可以用來(lái)制備具有改進(jìn)的脆性的用于烘焙制品的疊層面團(tuán)。[0299]本發(fā)明還涉及制備面團(tuán)或烘焙產(chǎn)品的方法，其包括將有效量的本發(fā)明a-淀粉酶摻入面團(tuán)，相比其中沒(méi)有摻入所述多肽的面團(tuán)或烘焙產(chǎn)品，其改進(jìn)了面團(tuán)或由所述面團(tuán)獲得的烘焙產(chǎn)品的一個(gè)或更多個(gè)特性。[0300]短語(yǔ)"摻入面團(tuán)"在本文被定義為將本發(fā)明的a-淀粉酶添加到面團(tuán)、將由其制得面團(tuán)的任何成分和/或?qū)⒂善渲频妹鎴F(tuán)的面團(tuán)成分的任何混合物。換句話說(shuō)，本發(fā)明的a_淀粉酶可以在面團(tuán)制備的任何步驟中加入，并且可以在一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)步驟中加入。將本發(fā)明的a-淀粉酶加入到面團(tuán)的成分中，用本領(lǐng)域公知的方法揉捏和烘焙所述面團(tuán)。見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利No.4567046、EP-A-426,211、JP-A-60-78529、JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。[0301]術(shù)語(yǔ)"有效量"在本文被定義為足夠?qū)γ鎴F(tuán)和/或烘焙產(chǎn)品的至少一個(gè)目的特性提供可測(cè)量效果的本發(fā)明a-淀粉酶的量。合適的量是10-20000MU單位/kg面粉的范圍，在一個(gè)實(shí)施方案中是100-2000MU/kg面粉，在另一個(gè)實(shí)施方案中是200-1000MU/kg面粉。合適的量包括活性范圍約10.〇〇〇至12.000的lppm-2000ppm的酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，有效量的范圍是活性范圍約10.〇〇〇至12.000的10-200ppm的酶，在另一個(gè)實(shí)施方案中是活性范圍約10.〇〇〇至12.000的20-80ppm的酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，有效量的范圍是活性約10.000MU/g的10-200ppm的酶。此處以及之后的MU表示如實(shí)施例中標(biāo)題"麥芽三糖測(cè)試(MU測(cè)試）"下定義的麥芽三糖單位（MaltotrioseUnit)。[0302]術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的特性"在本文被定義為面團(tuán)和/或由面團(tuán)獲得的產(chǎn)品特別是烘焙產(chǎn)品的任何特性，相對(duì)于沒(méi)有摻入本發(fā)明a-淀粉酶的面團(tuán)或產(chǎn)品，所述特性在本發(fā)明a-淀粉酶的作用下被改進(jìn)。改進(jìn)的特性可以包括但不限于增加的面團(tuán)強(qiáng)度、增加的面團(tuán)彈性(elasticity)、增加的面團(tuán)穩(wěn)定性、減小的面團(tuán)粘性、改進(jìn)的面團(tuán)延展性、改進(jìn)的面團(tuán)可加工性、增加的烘焙產(chǎn)品體積、改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品風(fēng)味、改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品內(nèi)芯結(jié)構(gòu)、改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品的內(nèi)芯柔軟性，減少的烘焙產(chǎn)品起泡、改進(jìn)的脆性、改進(jìn)的初始回彈性（resilience)以及特別地貯存后回彈性?xún)烧?、減小的貯存后硬度和/或改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品的抗陳化性。[0303]改進(jìn)的特性可以包括更快的面團(tuán)的面團(tuán)形成時(shí)間和/或減小的面團(tuán)的面團(tuán)粘性。[0304]改進(jìn)的特性可以包括改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品可折疊性，如玉米餅、煎餅、扁面包、比薩餅皮、烤餅和/或面包片的改進(jìn)的可折疊性。[0305]改進(jìn)的特性可以包括改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品柔韌性，包括玉米餅、煎餅、扁面包、比薩餅皮、烤餅和/或面包片的改進(jìn)的柔韌性。[0306]改進(jìn)的特性可以包括改進(jìn)的扁烘焙產(chǎn)品的可堆疊性，所述扁烘焙產(chǎn)品包括玉米餅、如餅、扁面包、比薩餅皮、烤餅。[0307]改進(jìn)的特性可以包括減小的面條粘性和/或增強(qiáng)的面條柔韌性。[0308]改進(jìn)的特性可以包括減小的經(jīng)烹飪面條的結(jié)塊性和/或改進(jìn)的面條風(fēng)味甚至貯存一段時(shí)間后的面條風(fēng)味。[0309]改進(jìn)的特性可以包括減少的薄餅干（cracker)產(chǎn)品中的發(fā)絲裂縫的形成，以及產(chǎn)生發(fā)酵效果和改進(jìn)的風(fēng)味形成。[0310]改進(jìn)的特性可以包括改進(jìn)的口感和/或改進(jìn)的擠壓時(shí)的柔軟性。[0311]改進(jìn)的特性可以包括減少的運(yùn)輸過(guò)程中的損壞，包括減少的運(yùn)輸過(guò)程中的破裂。[0312]改進(jìn)的特性可以包括減小的無(wú)麩質(zhì)面包貯存后的硬度。[0313]改進(jìn)的特性可以包括改進(jìn)的無(wú)麩質(zhì)面包的回彈性。改進(jìn)的特性可以包括改進(jìn)的無(wú)麩質(zhì)面包的初始回彈性以及特別地貯存后回彈性?xún)烧摺0314]改進(jìn)的特性可以包括減小的黑麥面包貯存后硬度。[0315]改進(jìn)的特性可以包括減小的黑麥面包貯存期間的回彈性損失。[0316]改進(jìn)的特性可以包括減小的烘焙產(chǎn)品貯存期間的回彈性損失，所述烘焙產(chǎn)品基于面粉包含至少5wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少8wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少12wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少15wt%的糖?；诿娣墼谝粋€(gè)方面包含至少18wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少20wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少25wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少30wt%的糖。因此，例如5%意味著配方中使用的每IOOOg面粉有50g糖。[0317]改進(jìn)的特性可以包括減小的烘焙產(chǎn)品的貯存后硬度，所述烘焙產(chǎn)品基于面粉包含至少5wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少8wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少12wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少15wt%的糖?；诿娣墼谝粋€(gè)方面包含至少18wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少20wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少25wt%的糖，在一個(gè)方面包含至少30wt%的糖。因此，例如5%意味著配方中使用的每IOOOg面粉有50g糖。[0318]改進(jìn)的口感包括初咬時(shí)或咀嚼之后柔軟的感覺(jué)，優(yōu)選地沒(méi)有口中的發(fā)粘的感覺(jué)和/或沒(méi)有烘焙產(chǎn)品粘在牙上。改進(jìn)的口感包括烘焙產(chǎn)品在初咬時(shí)或咀嚼之后在口中感覺(jué)的干澀更少。改進(jìn)的口感包括烘焙產(chǎn)品在其被放置于包裝或容器外之后在初咬時(shí)或咀嚼之后在口中感覺(jué)的干澀更少。改進(jìn)的特性可以包括在面包片從其包裝或容器中取出并暴露于環(huán)境條件下5分鐘、在一個(gè)方面10分鐘、在一個(gè)方面20分鐘后，其具有改進(jìn)的口感。[0319]改進(jìn)的特性可以包括在餅干從其包裝或容器中取出并暴露于環(huán)境條件下10分鐘、在一個(gè)方面20分鐘、在一個(gè)方面30分鐘、在一個(gè)方面1小時(shí)之后，其具有改進(jìn)的口感。[0320]在一個(gè)方面，此處以及之后的環(huán)境條件包括20攝氏度的溫度和40%濕度的潮濕水平。[0321]減少的運(yùn)輸過(guò)程中的破裂包括烘焙產(chǎn)品（包括但不限于餅干、面包如無(wú)麩質(zhì)面包）不因?yàn)檫\(yùn)輸而破裂成額外的部分。[0322]改進(jìn)的擠壓時(shí)的柔軟性包括這樣的觸覺(jué)體驗(yàn)，S卩如果小圓面包被拿在手的手指和拇指之間時(shí)，拇指和手指向?qū)Ψ揭苿?dòng)時(shí)需要較少的力量。[0323]改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品的可折疊性可以進(jìn)行如下測(cè)定。[0324]將烘焙產(chǎn)品放置在平表面上。通過(guò)提起產(chǎn)品的一邊并把它放在產(chǎn)品的相對(duì)邊來(lái)折疊烘焙產(chǎn)品。通過(guò)這種方式得到的折疊的烘焙產(chǎn)品，其在位于或靠近中心的區(qū)域具有彎曲的曲線。肉眼檢查折疊的烘焙產(chǎn)品的彎曲的外側(cè)表面。如果在彎曲處或其附近觀察到較少的裂縫，則可折疊性被提高。如果烘焙產(chǎn)品是玉米餅和/或面包片，這可以是特別有用的特性。[0325]改進(jìn)的可堆疊性可以如下測(cè)定。[0326]將10個(gè)烘焙產(chǎn)品堆疊在彼此的頂部并密封在聚合物包裝如聚乙烯箔中。這樣得到一包烘焙產(chǎn)品。將10包烘焙產(chǎn)品堆疊在彼此的頂部并且在環(huán)境條件下保持3天、在一個(gè)方面為5天、在一個(gè)方面為1周、在一個(gè)方面為2周。環(huán)境條件是如本文所定義的條件。在此期限之后烘焙產(chǎn)品的底部包被打開(kāi)，將烘焙產(chǎn)品彼此分離并且肉眼檢查產(chǎn)品的表面。如果觀察到更少的表面損傷，則可堆疊性得到改進(jìn)。表面損傷可例如由被堆疊在彼此的頂部上的兩個(gè)烘焙產(chǎn)品在分離過(guò)程中的表面破裂引起。如果烘焙產(chǎn)品是玉米餅，則這可以是特別有用的特性。[0327]更快的面團(tuán)形成時(shí)間可以如下測(cè)定。[0328]面團(tuán)形成時(shí)間是在麩質(zhì)鏈開(kāi)始分解之前，面團(tuán)達(dá)到最大稠度、最大粘度需要的時(shí)間。其可以用來(lái)自Brabendef?，德國(guó)的Farinograph?通過(guò)測(cè)量峰值時(shí)間來(lái)確定。如果用faronigraph確定面團(tuán)形成時(shí)間，則面團(tuán)形成時(shí)間是加入水的時(shí)刻與曲線達(dá)到其最高點(diǎn)的時(shí)刻之間的時(shí)間。峰時(shí)間優(yōu)選地以分鐘表示。[0329]減小的面團(tuán)粘性可以如下測(cè)定。[0330]面團(tuán)粘性?xún)?yōu)選地以至少8個(gè)面團(tuán)塊的兩個(gè)單獨(dú)批次，用配備壓縮模式下測(cè)量力的5kg測(cè)力盒并帶有圓柱形探頭（25mm直徑）的質(zhì)構(gòu)儀TAXT2i(StableMicroSystemsLtd.，Surrey，英國(guó)）測(cè)定。使用2.Omm/s的測(cè)定前及測(cè)定后速度，而測(cè)定速度為I.Omm/s。集中面團(tuán)塊并將其壓縮50%，探頭在最大壓縮下保持10秒。負(fù)峰值表示面團(tuán)粘性。更小的負(fù)峰值表示減少的面團(tuán)粘性。[0331]增強(qiáng)的柔韌性可如下測(cè)定。[0332]將烘焙產(chǎn)品放置在平表面上。烘焙產(chǎn)品被卷制成類(lèi)似于管的形狀，通過(guò)這種方式獲得卷制的烘焙產(chǎn)品。如果卷制的烘焙產(chǎn)品仍然保持卷起的形狀并且不松開(kāi)則柔韌性得到改進(jìn)。如果烘焙產(chǎn)品是玉米餅或煎餅，這可以是特別有用的特性。[0333]改進(jìn)的特性可以通過(guò)比較根據(jù)以下實(shí)施例中所描述的本發(fā)明方法添加了和不添加本發(fā)明（分離的）多肽所制備的面團(tuán)和/或烘焙產(chǎn)品來(lái)測(cè)定。感官品質(zhì)可以使用烘焙工業(yè)中已良好確立的程序進(jìn)行評(píng)估，并且可以包括例如使用受訓(xùn)的味道測(cè)試者的小組。[0334]術(shù)語(yǔ)"增加的面團(tuán)強(qiáng)度"在本文被定義為這樣的面團(tuán)特性，即具有一般地更彈性的特性和/或需要更多的輸入功（workinput)來(lái)模制和成型。[0335]術(shù)語(yǔ)"增加的面團(tuán)彈性"在本文被定義為面團(tuán)在經(jīng)受一定的物理應(yīng)變之后具有更高的傾向來(lái)恢復(fù)其原始形狀的特性。[0336]術(shù)語(yǔ)"增加的面團(tuán)穩(wěn)定性"在本文被定義為面團(tuán)比較不易因機(jī)械損害而形成斷層(faults)，從而更好地保持其形狀和體積的特性，并且其以正常和/或延長(zhǎng)的發(fā)面之后面包塊橫截面的高度：寬度的比例來(lái)評(píng)估。[0337]術(shù)語(yǔ)"減小的面團(tuán)粘性"在本文中被定義為面團(tuán)在例如面團(tuán)生產(chǎn)機(jī)械中粘附到表面的傾向更小的特性，并且其或者由具備本領(lǐng)域技能的測(cè)試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)評(píng)估或者使用本領(lǐng)域已知的質(zhì)構(gòu)儀（例如TAXTPlus)來(lái)測(cè)量。[0338]術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的面團(tuán)延展性"在本文中被定義為面團(tuán)可以經(jīng)受增加的應(yīng)變或拉伸而不破裂的面團(tuán)的特性。[0339]術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的面團(tuán)可加工性"在本文被定義為面團(tuán)一般地粘性更小和/或更緊實(shí)和/或更有彈性的特性。因此，廠房設(shè)備污垢較少并且清潔需求減少。[0340]術(shù)語(yǔ)"增加的烘焙產(chǎn)品體積"優(yōu)選地通過(guò)自動(dòng)面包體積分析儀（例如BVM-3，TexVolInstrumentsAB，Viken，瑞典）使用本領(lǐng)域已知的超聲或激光檢測(cè)法測(cè)量為面包的給定的面包塊的體積。在體積增加的情況下，特性得到改進(jìn)。或者，在同一尺寸的罐（tin)中烘焙后的烘焙產(chǎn)品的高度指征烘焙產(chǎn)品的體積。在烘焙產(chǎn)品的高度增加的情況下，烘焙產(chǎn)品的體積增加。[0341]術(shù)語(yǔ)"減少的烘焙產(chǎn)品起泡"在本文被定義為烘焙面包外皮上的氣泡在視覺(jué)上測(cè)定的減少。[0342]術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品內(nèi)芯結(jié)構(gòu)"在本文被定義為烘焙產(chǎn)品的內(nèi)芯中具有更細(xì)小的氣囊（cell)和/或更薄的氣囊壁和/或在內(nèi)芯中具有更均一/均勻的氣囊分布的特性，并且其通常由烘焙者來(lái)視覺(jué)評(píng)價(jià)或通過(guò)本領(lǐng)域中已知的數(shù)字成像分析（例如C-cell，CalibreControlInternationalLtd,Appleton,Warrington,UK)來(lái)評(píng)價(jià)。[0343]術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品柔軟性"與"硬度"相對(duì)，在本文被定義為烘焙產(chǎn)品更容易被壓縮的特性，并且其或者由具備本領(lǐng)域技能的測(cè)試烘焙者憑借經(jīng)驗(yàn)評(píng)估或者通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的質(zhì)構(gòu)儀（例如TAXTPlus)來(lái)測(cè)量。[0344]術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品風(fēng)味"由受訓(xùn)的測(cè)試小組評(píng)估。[0345]術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的烘焙產(chǎn)品的抗陳化性"在本文被定義為烘焙產(chǎn)品的質(zhì)量參數(shù)（例如減小的貯存后硬度和/或減小的貯存后回彈性損失）衰退速率減小的特性，。[0346]抗陳化特性可以通過(guò)烘焙產(chǎn)品減小的貯存后硬度來(lái)證明。本發(fā)明的a-淀粉酶可以導(dǎo)致減小的硬度，例如在更容易被壓縮的烘焙產(chǎn)品中。烘焙產(chǎn)品的硬度可以或者由具備本領(lǐng)域技能的測(cè)試烘焙者憑借經(jīng)驗(yàn)評(píng)估或者通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的質(zhì)構(gòu)儀（例如TAXTPlus)來(lái)測(cè)量。烘焙后24小時(shí)內(nèi)測(cè)量的硬度被稱(chēng)為初始硬度。烘焙后24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量的硬度被稱(chēng)為貯存后硬度，并且也是確定貨架期的度量。在初始硬度減小的情況下，抗陳化特性得到了改進(jìn)。在貯存后硬度減小的情況下，抗陳化特性得到了改進(jìn)。優(yōu)選地如本文實(shí)施例9所述測(cè)量硬度。[0347]烘焙產(chǎn)品的回彈性?xún)?yōu)選地通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的質(zhì)構(gòu)儀（例如TAXTPlus)測(cè)量。[0348]烘焙后24小時(shí)內(nèi)測(cè)量的回彈性被稱(chēng)為初始回彈性。烘焙后24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量的回彈性被稱(chēng)為貯存后回彈性，并且也是確定貨架期的度量。新鮮烘焙的產(chǎn)品的內(nèi)芯一般有高的初始回彈性但回彈性會(huì)在貨架期期間損失。改進(jìn)的抗陳化特性可以通過(guò)貯存期間回彈性損失的減少來(lái)證明。優(yōu)選地如本文實(shí)施例9所述測(cè)量回彈性。[0349]術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的脆性"在本文被定義為烘焙產(chǎn)品相比本領(lǐng)域已知的參考商品有更脆的感覺(jué)以及比參考商品保持更長(zhǎng)時(shí)間的脆感的特性。該特性可以使用例如質(zhì)構(gòu)儀TA-XTPlus(StableMicroSystemsLtd,Surrey,英國(guó)）在壓縮實(shí)驗(yàn)中測(cè)量固定速度下的力對(duì)距離的曲線并從該壓縮曲線中獲得物理參數(shù)來(lái)量化，即（i)第一個(gè)峰的力，（ii)第一個(gè)峰的距離，（iii)初始斜率，（iv)最高峰的力，（V)曲線下面積和（vi)斷裂事件（力降大于某一預(yù)定值）的數(shù)量。改進(jìn)的脆性的指征是更高的第一個(gè)峰的力、更短的第一個(gè)峰的距離、更高的初始斜率、更高的最高峰的力、更大的曲線下面積和更多數(shù)目的斷裂事件。較之參考商品，更脆的產(chǎn)品應(yīng)在這些參數(shù)的至少兩個(gè)中有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更好的得分。在本領(lǐng)域中，"脆性"還指脆、松脆（crunchiness)或硬皮性（crustiness),表示具有脆的、松脆的或硬皮性的斷裂行為的物質(zhì)。[0350]本發(fā)明可以提供具有至少一種改進(jìn)的特性的面團(tuán)，所述特性選自增加的強(qiáng)度、增加的彈性、增加的穩(wěn)定性、減小的粘性和/或改進(jìn)的延展性組成的組中的。[0351]本發(fā)明還可以提供具有增加的面包塊體積的烘焙產(chǎn)品。本發(fā)明還可以提供具有至少一種改進(jìn)的特性的烘焙產(chǎn)品，所述特性選自增加的體積、改進(jìn)的風(fēng)味、改進(jìn)的內(nèi)芯結(jié)構(gòu)、改進(jìn)的內(nèi)芯柔軟性、改進(jìn)的脆性、減少的起泡和/或改進(jìn)的抗陳化性組成的組。[0352]本發(fā)明的a_淀粉酶可用于延緩烘焙產(chǎn)品如面包和蛋糕的陳化。陳化的延緩可以通過(guò)相比沒(méi)有根據(jù)本發(fā)明用本發(fā)明a-淀粉酶制備的包括面包和蛋糕的烘焙產(chǎn)品而言減小的硬度、特別是減小的貯存后硬度來(lái)表示。[0353]相比工業(yè)中使用的其他a_淀粉酶，本發(fā)明的a_淀粉酶具有中等的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明的a-淀粉酶比真菌a-淀粉酶或者來(lái)自谷物面粉的a-淀粉酶具有更高的溫度穩(wěn)定性。在另一方面，相比工業(yè)中使用的其他淀粉酶如細(xì)菌a-淀粉酶，其在高溫下具有較低的熱穩(wěn)定性，特別是烘焙期間a-淀粉酶的失活溫度下具有較低的熱穩(wěn)定性。[0354]如使用本文實(shí)施例8所述的方法測(cè)量的，在高溫下、在一個(gè)實(shí)施方案中在高于70°C的溫度下、優(yōu)選地在高于75°C的溫度下、優(yōu)選地在高于78°C的溫度下、優(yōu)選地在溫度高于80°C的溫度下、優(yōu)選地在高于82°C的溫度下、優(yōu)選地在高于85°C的溫度下，本發(fā)明的a-淀粉酶相比已知a-淀粉酶具有較低的熱穩(wěn)定性。優(yōu)選地，熱穩(wěn)定性如下評(píng)估：25MU/ml純化的酶溶液在含有pH5.050mM乙酸鈉、ImM的CaCl2和lg/L的BSA的緩沖液中在Eppendorf管中在不同溫度下（40°C至86°C)預(yù)孵育30分鐘。殘留的酶活性用本文實(shí)施例"酶活性的測(cè)定"和"2)麥芽三糖測(cè)試（MU測(cè)試）"中所述的MU測(cè)試來(lái)測(cè)定。[0355]本發(fā)明的a_淀粉酶優(yōu)選地在烘焙期間具有活性并且優(yōu)選地在烘焙結(jié)束之前失活。[0356]在高溫下具有中等熱穩(wěn)定性和/或較低的熱穩(wěn)定性的本發(fā)明a_淀粉酶的益處可以包括但不限于以下的一種或多種。[0357]在高溫下具有較低的熱穩(wěn)定性的酶可導(dǎo)致酶在烘焙過(guò)程中的變性水平增加。這可導(dǎo)致酶活性的更完全失活，從而賦予對(duì)烘焙過(guò)程中酶功能的更大控制。[0358]已經(jīng)觀察到小型和大型烘焙產(chǎn)品具有不同的熱傳輸速率、不同的烘焙時(shí)間以及因此不同的熱處理。本發(fā)明a-淀粉酶對(duì)于因?yàn)楹姹簳r(shí)間和/或溫度減少而經(jīng)歷更少熱處理的烘焙產(chǎn)品可以是有益的。[0359]已經(jīng)觀察到，在更高海拔如超過(guò)2000m的地點(diǎn)（例如墨西哥城海拔2240米）烘焙的面包可面臨以下困難，即難以獲得足夠滅活熱穩(wěn)定酶的內(nèi)芯溫度。不束縛于理論，認(rèn)為這是因?yàn)樗谳^低的大氣壓力下在更低的溫度沸騰，并且這決定了烘焙產(chǎn)品的中心達(dá)到的最高溫度。更低的烘焙產(chǎn)品中心的最高溫度可使得（完全）滅活酶更加困難。高溫下熱穩(wěn)定性更低的a-淀粉酶可以在例如墨西哥城這樣的地方帶來(lái)優(yōu)勢(shì)。[0360]出于成本效益和可持續(xù)性的原因，工業(yè)面包坊在減少烘焙時(shí)間和烤箱溫度-通常在20分鐘以下-方面面臨著越來(lái)越大的壓力。更不耐熱的酶可更適合較短的烘焙時(shí)間，因?yàn)檫@種酶在烘焙過(guò)程結(jié)束時(shí)更有效地變性。相比全烘焙的等同物，半烘焙的面包的烘焙時(shí)間較短-例如通常烘焙過(guò)程少20%和/或烤箱溫度低KTC，并且因此也可預(yù)料到獲益于高溫下具有更低的熱穩(wěn)定性的酶。[0361]本發(fā)明的a_淀粉酶和/或本發(fā)明的方法中所使用的額外的酶可以是適合于所討論用途的任何形式，例如干燥粉末、凝聚粉末或顆粒尤其是無(wú)粉塵顆粒、液體特別是穩(wěn)定化的液體或W001/11974和W002/26044中描述的受保護(hù)的酶的形式。液體形式包括但不限于乳液、懸浮液和溶液。顆粒和凝聚粉末可通過(guò)常規(guī)方法制備，例如將本發(fā)明的a-淀粉酶噴灑到流化床制粒機(jī)的載體（carrier)上。該載體可以由具有合適粒徑的顆粒核心組成。載體可以是可溶的或不溶的，合適的載體包括鹽（如NaCl或硫酸鈉）、糖醇（如山梨糖醇）、淀粉、米粉、小麥粉、玉米粗磨粉（corngrit)、麥芽糖糊精或大豆。[0362]包含本發(fā)明多肽的這樣的顆?；蚰鄯勰┛梢员环Q(chēng)為烘焙添加劑。所述烘焙添加劑優(yōu)選地具有超過(guò)95%(以重量計(jì)）的顆粒為25-500iim的窄粒徑分布。[0363]本發(fā)明的淀粉分解酶和/或額外的酶可以被包含在緩釋制劑中。用于制備緩釋制劑的方法是本領(lǐng)域公知的。根據(jù)已確定的方法，添加營(yíng)養(yǎng)學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機(jī)酸可以例如穩(wěn)定液體酶制劑。[0364]優(yōu)選地，本發(fā)明的酶以干燥形式提供以便容易處理產(chǎn)物。不論酶的制劑為何，該制劑可以包含一種或更多種添加劑。合適的添加劑的例子包括氧化劑（包括抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺（ADA))，還原劑（包括L-半胱氨酸），乳化劑（包括單/二甘油酯、單甘油酯如單硬脂酸甘油酯（GMS)、硬脂酰乳酸鈉（SSL)、硬脂酰乳酸鈣（CSL)、脂肪酸聚甘油酯（PGE)和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯（DATEM)，膠（包括瓜爾豆膠和黃原膠），調(diào)味劑，酸(包括檸檬酸、丙酸），淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑（包括甘油）和防腐劑。[0365]本發(fā)明的a-淀粉酶也可摻入到包含酵母的組合物中，例如EP-A-0619947、EP-A-0659344和W002/49441中公開(kāi)的。[0366]為了包含在面粉的預(yù)混合料中，本發(fā)明的（分離的）多肽是干燥產(chǎn)物例如無(wú)粉塵顆粒的形式是有利的，而為了與液體一起加入，液體形式是有利的。[0367]一種或更多種額外的酶也可以摻入到面團(tuán)中。因此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明a_淀粉酶以及一種或更多種額外的酶的酶組合物。所述酶組合物可以是烘焙酶組合物。這種酶組合物可用于面團(tuán)產(chǎn)品以及由所述面團(tuán)得到的烘焙產(chǎn)品。例如其可以用在進(jìn)一步含有蛋的面團(tuán)產(chǎn)品和用在烘焙產(chǎn)品如黃油雞蛋面包和意大利節(jié)日蛋糕中，兩個(gè)都是常規(guī)的并且具有減少的蛋量。額外的酶可以來(lái)自任何來(lái)源，包括哺乳動(dòng)物和植物，以及優(yōu)選地微生物(細(xì)菌、酵母或真菌）來(lái)源，并可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)使用的技術(shù)獲得。[0368]在一個(gè)實(shí)施方案中，額外的酶可以是淀粉酶，包括額外的a-淀粉酶，如真菌a_淀粉酶（其對(duì)提供酵母可發(fā)酵的糖類(lèi)以及延緩陳化可以是有用的）、P_淀粉酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶、肽酶特別是外肽酶（其對(duì)于風(fēng)味增強(qiáng)可以是有用的）、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、三?；视椭久福ㄆ淇梢杂糜谛揎椕鎴F(tuán)或面團(tuán)成分中存在的脂質(zhì)從而軟化面團(tuán)）、半乳糖脂酶、磷脂酶、纖維素酶、半纖維素酶尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶（其對(duì)戊聚糖更特別地阿拉伯木聚糖的部分水解可以是有用，其增加了面團(tuán)的延展性）、蛋白酶（其對(duì)麩質(zhì)弱化尤其使用硬小麥面粉時(shí)可以是有用的）、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶例如WO95/00636公開(kāi)的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、過(guò)氧化物酶（其對(duì)于改進(jìn)面團(tuán)稠度可以是有用的）、漆酶、或氧化酶、己糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶或L-氨基酸氧化酶（其對(duì)于改進(jìn)面團(tuán)稠度可以是有用的）或蛋白酶。[0369]纖維素酶可以來(lái)自A.niger或來(lái)自Trichodermareesei。[0370]淀粉葡糖苷酶可以是來(lái)自Aspergillus例如來(lái)自A.oryzae或A.niger,優(yōu)選地來(lái)自A.niger的淀粉葡萄糖苷酶。[0371]在一個(gè)實(shí)施方案中，額外的酶是脂解酶，包括三?；视椭久浮⒘字?、半乳糖脂酶和具有半乳糖脂酶和磷脂酶兩種活性的酶。[0372]三?；视椭久缚梢允钦婢久福瑑?yōu)選地來(lái)自Rhizopus、Aspergillus、Candida、Penicillum、Thermomyces或Rhizomucor。在一個(gè)實(shí)施方案中，三醜基甘油脂肪酶來(lái)自Rhyzopus,在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用來(lái)自Rhyzopusoryzae的三酰基甘油脂肪酶。任選地，可以使用兩種或更多種三?；视椭久傅慕M合。[0373]在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂解酶是磷脂酶或具有半乳糖脂酶和磷脂酶兩種活性的酶。已知這樣的脂肪酶作用于小麥的內(nèi)源性脂質(zhì)和如通過(guò)加入起酥油脂肪提供的或來(lái)自卵磷脂的外來(lái)脂肪源。優(yōu)先地，脂肪酶切割極性脂質(zhì)并且具有磷脂酶活性、半乳糖脂酶活性或磷脂酶和半乳糖脂酶活性的組合來(lái)產(chǎn)生溶血磷脂如溶血磷脂酰膽堿和溶血半乳糖脂(Iysogalactolipids)如雙半乳糖單甘油酯。脂肪酶的特異性可以通過(guò)使用合適底物例如三酰基甘油脂、磷脂酰膽堿和雙半乳糖甘油二酯的體外測(cè)試來(lái)顯示，或優(yōu)選地通過(guò)分析混合與發(fā)酵期間在面團(tuán)中產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)顯示。[0374]Panamore彳、Lipopan1卞、Lipopank5〇和LipopanS被商業(yè)化用于標(biāo)準(zhǔn)化脂解活性，對(duì)于來(lái)自DSM的Panamore?使用DLU測(cè)量，對(duì)于來(lái)自Novozymes的Lipopan?使用LU測(cè)量。DLU被定義為在pH8.5在37°C下從對(duì)硝基苯基棕櫚酸酯生產(chǎn)1微摩爾/分鐘的對(duì)硝基苯酚需要的酶的量，而LU被定義為在pH7在30°C下從三丁酸甘油酯生產(chǎn)1微摩爾/分鐘丁酸需要的酶的量。脂肪酶最佳地與本發(fā)明的a-淀粉酶在2-850DLU/kg面粉或50-23500LU/kg面粉下使用。[0375]在本發(fā)明的酶組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，額外的酶是如W02009/106575所述的Panamore?。[0376]在本發(fā)明的酶組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，額外的酶是如W09826057所述的酶。[0377]在本發(fā)明的酶組合物的一個(gè)方面，額外的酶是如USRE38,507所述的酶。[0378]在本發(fā)明的酶組合物的一個(gè)方面，額外的酶是如WO9943794尤其是EP1058724B1所述的酶。[0379]如果根據(jù)本發(fā)明的方法添加一個(gè)或更多個(gè)額外的酶活性物，這些活性物可以單獨(dú)添加或與本發(fā)明的多肽一同加入，例如作為本發(fā)明的酶組合物，其包括面包改良組合物和/或面團(tuán)改良組合物。其他酶活性物可以是上述任何的酶，并可以根據(jù)確定的烘焙實(shí)踐來(lái)確定劑量。[0380]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物以干燥的形式被提供，使得其更容易被添加到面團(tuán)、面團(tuán)成分中，但是液體的形式也可以。液體形式包括但不限于乳液、懸浮液和溶液。不論酶組合物是何種制劑，可以使用本領(lǐng)域已知的對(duì)改進(jìn)和/或維持酶活性、面團(tuán)和/或烘焙產(chǎn)品的質(zhì)量有用的任何一種或更多種添加劑。合適的添加劑的例子包括氧化劑（包括抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺（ADA))，還原劑（包括L-半胱氨酸），乳化劑（包括單/二甘油酯、單甘油酯如單硬脂酸甘油酯（GMS)、硬脂酰乳酸鈉（SSL)、硬脂酰乳酸鈣（CSL)、脂肪酸聚甘油酯（PGE)和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯（DATEM)，膠（包括瓜爾豆膠和黃原膠），調(diào)味劑，酸（包括檸檬酸、丙酸），淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑（包括甘油）和防腐劑。[0381]本發(fā)明的a_淀粉酶可以摻入到用于面團(tuán)和/或由面團(tuán)制備的烘焙產(chǎn)品的預(yù)混合料中，例如以面粉組合物的形式，其中所述預(yù)混合料包含本發(fā)明的多肽。術(shù)語(yǔ)"預(yù)混合料"在本文被定義為以其常規(guī)含義來(lái)理解，即作為烘焙劑的混合料，一般包含面粉，其不僅可用于工業(yè)面包烘焙工廠/設(shè)施，而且也可以用于零售烘焙品店。預(yù)混合料可以通過(guò)將本發(fā)明的a-淀粉酶或本發(fā)明的酶組合物與合適的載體如面粉、淀粉或鹽混合來(lái)制備。預(yù)混合料可以含有上述的添加劑。[0382]在另一個(gè)方面，本發(fā)明的a-淀粉酶可以用于生產(chǎn)蛋糕以及生產(chǎn)可以制備蛋糕的面糊。[0383]在另一個(gè)方面，本發(fā)明的a_淀粉酶可用來(lái)減少基于面粉含有至少10wt%的糖的烘焙產(chǎn)品的貯存后的硬度。因此，例如5%意味著在配方中每使用IOOOg的面粉有50g。[0384]本發(fā)明的a-淀粉酶可以用于制備許多蛋糕，包括油脂蛋糕（shortenedcakes),例如鎊蛋糕（poundcake)和黃油蛋糕（buttercake),以及包括乳沫蛋糕（foamcake),諸如例如蛋白糖霜蛋糕（meringues)、海綿蛋糕、酥餅干蛋糕（biscuitcake)、蛋糕卷(roulade)、杰諾瓦士蛋糕（genoise)和戚風(fēng)蛋糕（chiffoncake)。海綿蛋糕是一種基于小麥面粉、糖、焙粉（bakingpowder)和蛋（以及任選地焙粉）的軟蛋糕。存在的僅有的脂肪來(lái)自蛋黃，其有時(shí)獨(dú)立于蛋清添加。其經(jīng)常被用作其他類(lèi)型的蛋糕和甜點(diǎn)的基料（base)。磅蛋糕一般用各一磅的面粉、黃油、蛋和糖來(lái)制備，以及任選地補(bǔ)充有焙粉。戚風(fēng)蛋糕中黃油/人造黃油已被油取代。相比磅蛋糕或海綿蛋糕，糖和蛋黃的含量已減少，蛋清含量已增加。[0385]制備面糊的方法優(yōu)選地包括以下步驟：[0386]a.通過(guò)至少加入下述物質(zhì)來(lái)制備蛋糕的面糊：[0387]i?糖；[0388]ii.面粉；[0389]iii.本發(fā)明的a-淀粉酶；[0390]iv.至少一個(gè)蛋；以及[0391]V.任選的磷脂酶。[0392]制備本發(fā)明的蛋糕的方法還包括以下步驟[0393]b.烘焙面糊來(lái)產(chǎn)生蛋糕。[0394]本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何由面團(tuán)成分制備面糊或蛋糕。任選地，一種或更多種其他的成分可以存在于組合物中例如來(lái)使得蛋糕中的蛋和/或脂肪減少，例如水膠體、酵母提取物、鈣。[0395]本發(fā)明的a-淀粉酶的上述工業(yè)應(yīng)用僅包括了幾個(gè)例子，該列表并不意味著是限制性的。[0396]本發(fā)明的a_淀粉酶的其他用途可以包括：[0397]_生產(chǎn)葡萄糖、果糖和麥芽糖糖漿；[0398]-生產(chǎn)淀粉水解物如麥芽糖糊精；[0399]-生產(chǎn)改性淀粉；[0400]-動(dòng)物飼料中淀粉組分的改性；[0401]-釀造中替換麥芽；[0402]_在膠水包括墻紙涂楽（wallpaperpaste)中使用；[0403]_在使用淀粉制作的塑料物品中使用，所述塑料物品包括由聚合淀粉膜制成的塑料袋；和/或[0404]-在廢棄面包（waistbread)的再加工中使用。實(shí)施例[0405]酶活件的測(cè)定[0406]1)AACC方法22-02.01[0407]使用Ceralpha?法測(cè)量植物和微生物材料中的a-淀粉酶[0408]a-淀粉酶活性通過(guò)用MegazymeCERALPHAa-淀粉酶測(cè)試試劑盒（MegazymeInternationalIrelandLtd.,Co.Wicklow,愛(ài)爾蘭）根據(jù)制造商的說(shuō)明測(cè)量活性來(lái)定量。[0409]2)麥芽三糖測(cè)試（MU測(cè)試）[0410]一個(gè)麥芽三糖單元（MU)被定義為在下列測(cè)試條件下使用麥芽三糖底物每分鐘釋放1微摩爾葡萄糖的酶的量。酶活性在37°C和pH5.0下使用麥芽三糖作為底物來(lái)測(cè)定。酶法水解麥芽三糖導(dǎo)致定量釋放葡萄糖，這是酶活性的度量。最終測(cè)試濃度：8mg/ml的麥芽三糖，0.007至0.02MU/ml的成熟DSM-AM，20mM檸檬酸緩沖液，0.2mg/mlBSA，2mMNaCl。反應(yīng)在30分鐘之后停止（以I:10的比例添加0.33M的NaOH)，使用葡萄糖己糖激酶FS試劑盒（Diagn.SYST)，釋放的葡萄糖在其間形成NADH的兩個(gè)步驟中被轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-P。得到的吸光度在340nm波長(zhǎng)處的增加是30分鐘的孵育過(guò)程中釋放的葡萄糖的量的度量。活性使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。[0411]實(shí)施例1[0412]本發(fā)明的的a-淀粉酶的牛產(chǎn)[0413]克降和酶的制各[0414]如以下進(jìn)一步詳細(xì)描述，a-淀粉酶基因以下述方式在B.subtilis中克隆和表達(dá)[0415]菌株和質(zhì)粒[0416]Bacillussubtilis菌株BS154(CBS363.94)(AaprE、AnprE、amyE-、spo_)被描述在Quax與Broekhuizen1994ApplMicrobiolBiotechnol.41:425-431中。[0417]E.coli/B.subtilis穿梭載體pBHA12被描述在（W02008/000632)中。[0418]AlicyclobacilluspohliaeNCIMB14276被Imperio等人描述（Int.J.Syst.Evol.Microbiol58:221-225,2008)。[0419]BacillusStearothermophilusC599(NCMBIl873)被描述在WO9IAM669中。[0420]分子生物學(xué)技術(shù)[0421]進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)技術(shù)（見(jiàn)：Sambrook&Russell，MolecularCloning：ALaboratoryManual,3rdEd.,CSHLPress,ColdSpringHarbor,NY,2001)〇聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)用熱循環(huán)儀用Phusion高保真DNA聚合酶（Finnzymes0Y，Aspoo,芬蘭）根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行。[0422]淀粉酶活性[0423]如上所述根據(jù)AACC方法22-02.01對(duì)B.subtilis培養(yǎng)物的培養(yǎng)液中的a-淀粉酶活性進(jìn)行定量。[0424]Alicyclobacilluspohliae基因組測(cè)序[0425]通過(guò)BaseClear(Leiden，荷蘭）來(lái)對(duì)AlicyclobacilluspohliaeNCIMB14276的基因組進(jìn)行測(cè)序。將DNA片段化（剪切）并將DNA適配體連接到DNA片段的兩端。得到兩套IlluminaGAIIx序列讀出。一套由雙末端（paired-end)讀出組成，橫跨大約250(+-125)個(gè)核苷酸的距離。第二套由配對(duì)（matepair)讀出組成，橫跨大約4200(+-2100)個(gè)核苷酸的距離。在全I(xiàn)lluminaGAIIx序列讀出上施用基于Phred質(zhì)量分?jǐn)?shù)的質(zhì)量過(guò)濾。此外，低質(zhì)量的和不明核苷酸從剩余的讀出中修剪掉。過(guò)濾后的雙末端讀出和配對(duì)讀出用于CLCGenomicsWorkbench4.6.1或4.7版本（CLCbio,Aarhus,丹麥）的'從頭'拼裝（'Denovo'assembly)。通過(guò)這種方式，獲得一組預(yù)拼裝的重疊群（contigs)(連續(xù)序列）。使用Boetzer等人描述的SSPACE(Bioinformatics27:578-579,2011)來(lái)進(jìn)一步布置重疊群。序列分析顯示AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276基因組含有編碼a-淀粉酶的基因(在本文被稱(chēng)為DSM-AM)，其具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，見(jiàn)圖3。[0426]由SEQIDNO.1編碼的相應(yīng)的DSM-AM蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，見(jiàn)圖4。[0427]SEQIDNO:3示出密碼子優(yōu)化的DSM-AM基因的核苷酸序列，見(jiàn)圖5。[0428]實(shí)施例2[0429]A.pohliaeDSM-AM基因在Bacillussubtilis中的表汰[0430]通過(guò)用SphI和HindIII消化pBHA12在載體pBHA12中引入amyQ終止子和PmeI限制性位點(diǎn)并且克隆下列DNA序列[0431]5'_[0432]GCATGCGTTTAAACAAAAACACCTCCAAGCTGAGTGCGGGTATCAGCTTGGAGGTGCGTTTATTTTTTCAGCCGTATGACAAGGTCGGCATCAGAAGCTT-3'(5'SphI和3'HindIII限制性位點(diǎn)有下劃線）。[0433]該片段被克隆到pBHA12中產(chǎn)生載體pGBB09(圖1)。[0434]DSM-AM基因由GeneAart(德國(guó)）合成，并且在5'末端添加PacI限制性位點(diǎn)并且在3'末端添加PmeI限制性位點(diǎn)。將DSM-AM基因克隆到PacI和PmeI消化的pGBB09載體中從而產(chǎn)生載體PGBB09DSM-AM1(圖2)。該載體被轉(zhuǎn)化至B.subtilis菌株BS154。質(zhì)粒的序列通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)。含有pGBB09DSM-AMl的B.subtilis菌株BS154被命名為DSM-AMB154-1。[0435]實(shí)施例3[0436]用B.subtilis在搖瓶中表汰DSM-AM[0437]在搖瓶中培養(yǎng)B.subtilis菌株DSM-AMB154-1和BS154。這些搖瓶中含有20ml2XTY培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有1.6%(w/v)細(xì)菌用胰蛋白胨、1%(w/v)的酵母提取物和0.5%(w/v)的NaCl。將培養(yǎng)物在37°C和250rpm下劇烈振蕩16小時(shí)并使用0.2ml培養(yǎng)基接種20mlSMM培養(yǎng)基。SMM預(yù)培養(yǎng)基含有1.25%(w/w)的酵母提取物、0.05%(w/w)的CaCl2、0.075%(w/w)的MgC12.6H20、15iig/1的MnS04.4H20、10iig/1的CoC12.6H20、0.05%(w/w)的朽1樣酸、0.025%(w/w)的消泡劑86/013(BasildonChemicals，Abingdon,英國(guó)）。為了完成SMM培養(yǎng)基，將均為單獨(dú)制備與滅菌的20ml的5%(w/v)的麥芽糖和20ml的200mM的磷酸鈉緩沖貯備液（pH為6.8)加入到60ml的SMM預(yù)培養(yǎng)基中。將這些培養(yǎng)物在37°C和250rpm下孵育48小時(shí)。收集上清液并分析酶的產(chǎn)率。根據(jù)如上所述的AACC方法22-02.01測(cè)定在DSM-AMB154-1菌株的a-淀粉酶活性。DSM-AMB154-1的上清液含有a-淀粉酶活性而親本菌株BS154沒(méi)有。[0438]實(shí)施例4[0439]酶的制各[0440]在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中在有氧條件下培養(yǎng)Bacillus菌株DSM-AMB154-1。[0441]酶被分泌到培養(yǎng)基中。隨后的發(fā)酵液被過(guò)濾來(lái)除去細(xì)菌細(xì)胞、來(lái)自這些細(xì)胞碎片和其他固體。由此獲得的含有酶的濾液然后通過(guò)超濾濃縮得到含有成熟的DSM-AM的濃縮物。[0442]實(shí)施例5[0443]酶的鈍化[0444]使用以下步驟進(jìn)行純化。實(shí)施例4中得到的含有成熟DSM-AM的濃縮發(fā)酵液與pH7.5、含有40011^/1111(順4)2504(1:1比例）的501111冊(cè)?￡3緩沖液混合。將溶液在41：下攪拌過(guò)夜，隨后在3220ref、4°C下離心10分鐘。沉淀物重新懸浮在pH7.5的25mMTris緩沖液中，并通過(guò)0.45iim的過(guò)濾器過(guò)濾。溶液的電導(dǎo)率通過(guò)加入MilliQ水調(diào)整至2ms/cm，然后調(diào)節(jié)pH至pH=7.5。將溶液通過(guò)Vivaspin20ml濃縮器（SartoriusStedim)10.000MWC0在3220rcf、4°C下濃縮15分鐘。將溶液施加到用pH7.5、25mM的HEPES緩沖液平衡的Q-Sepharose柱。在流通液（flow-through)中收集蛋白質(zhì)。流通液被重新施加到用pH9.5、25mM的HEPES緩沖液平衡的Q-S印harose柱。蛋白質(zhì)用O-IMNaCl梯度洗脫。純化的成熟DSM-AM酶通過(guò)PD-10脫鹽柱（GEHealthcare)使用pH7.5、25mM的Tris緩沖液脫鹽。[0445]蛋白質(zhì)測(cè)丨定[0446]實(shí)施例5中獲得的純化的成熟DSM-AM酶的蛋白質(zhì)濃度通過(guò)BCAtm蛋白質(zhì)測(cè)試試劑盒（Pierce)根據(jù)制造商的說(shuō)明在以下條件下測(cè)定：樣品與WR試劑的比例為1:12,并且混合物的吸光度在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定。[0447]實(shí)施例6[0448]酶的特件[0449]實(shí)施例5中得到的成熟DSM-AM酶的活性對(duì)pH值的依賴(lài)性通過(guò)如上所述的MU測(cè)試用其中pH調(diào)整為不同值（pH4.0、4.3、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的反應(yīng)混合物來(lái)測(cè)定。用兩個(gè)最終的酶濃度0.01和〇.〇18MU/ml進(jìn)行兩次測(cè)量。結(jié)果用相對(duì)活性描述。發(fā)現(xiàn)成熟DSM-AM的最適pH是pH5.0。在其他指定的pH下測(cè)量的活性示于下表。所述值對(duì)應(yīng)于不同的酶濃度下的兩次測(cè)量的平均值?！緳?quán)利要求】L編碼具有a-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其包含：(a)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或(b)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽與具有SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5%的同一性；或(c)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列；或(d)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是由AlicyclobacilluspohliaeNCMB14276產(chǎn)生的。3.載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求3的載體，其為表達(dá)載體，其中根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸序列與允許所述多核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)的至少一種調(diào)控序列可操作地連接。5.根據(jù)權(quán)利要求4的載體，其中所述合適的宿主細(xì)胞是Aspergillus、Bacillus、Chrysosporium、Escherichia、Kluyveromyces、Penicillium、Pseudomonas、Saccharomyces、Streptomyces或Talaromyces的種、優(yōu)選地是Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquefaciens>BacillusIicheniformis>Escherichiacoli>AspergiIIusNiger或Aspergillusoryzae種。6.重組宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求I或2的多核苷酸，或包含根據(jù)權(quán)利要求3至5中任意一項(xiàng)的載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組宿主細(xì)胞，其能夠表達(dá)或過(guò)表達(dá)所述多核苷酸或所述載體。8.-種制造根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求3至5中任意一項(xiàng)的載體的方法，其包括以下步驟：培養(yǎng)用所述多核苷酸或所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并且將所述多核苷酸或所述載體從所述宿主細(xì)胞中分離。9.a-淀粉酶多肽，其包含：(a)SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或(b)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少99.5%的同一性的氨基酸序列；或(c)由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸編碼的氨基酸序列；或(d)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)的氨基酸序列，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義；或(e)與SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70%的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一個(gè)的氨基酸序列，所述位置參照SEQIDNO:2來(lái)定義，并且所述氨基酸序列的特征在于，當(dāng)被用于制備具有基于面粉的至少5wt%的糖的烘焙產(chǎn)品時(shí)，所述烘焙產(chǎn)品相比不使用所述氨基酸序列制備的烘焙產(chǎn)品具有減小的貯存后硬度。10.通過(guò)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求3至5中任意一項(xiàng)的載體能夠得到的根據(jù)權(quán)利要求9的多肽。11.制造根據(jù)權(quán)利要求9或10的多肽的方法，其包括在允許根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求3至5的載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求6或7的重組宿主細(xì)胞，以及任選地，從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所編碼的多肽。12.根據(jù)權(quán)利要求9或10的多肽用于食品制造的用途。13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其用于制造烘焙產(chǎn)品，優(yōu)選面包或蛋糕。14.酶組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求9或10的多肽以及選自以下的一種或更多種組分：奶粉，麩質(zhì)，粒狀脂肪，額外的酶，氨基酸，鹽，氧化劑如抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮二甲酰胺，還原劑如L-半胱氨酸，乳化劑如單甘油酯、二甘油酯、單硬脂酸甘油酯、硬脂酰乳酸鈉、硬脂酰乳酸鈣、脂肪酸聚甘油酯和二乙酰酒石酸單和雙甘油酯，膠如瓜爾豆膠和黃原膠，調(diào)味齊U，酸如檸檬酸和丙酸，淀粉，改性淀粉，麩質(zhì)，濕潤(rùn)劑如甘油和防腐劑組成的組。15.根據(jù)權(quán)利要求14的酶組合物，其中所述額外的酶是脂解酶，優(yōu)選地為磷脂酶。16.制備面團(tuán)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求9或10的多肽或根據(jù)權(quán)利要求14或15的組合物與至少一種面團(tuán)成分相組合的步驟。17.面團(tuán)，其包含根據(jù)權(quán)利要求9或10的多肽或根據(jù)權(quán)利要求14或15的組合物。18.制備烘焙產(chǎn)品的方法，其包括烘焙根據(jù)權(quán)利要求17的面團(tuán)的步驟。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法能夠得到的烘焙產(chǎn)品。20.-種生產(chǎn)與下述氨基酸序列具有至少60%的同一性的多肽的方法，其包括使用AlicyclobacilluspohliaeNCIMB14276,所述氛基酸序列為(a)SEQIDNO:2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列，或與SEQIDNO:2的氨基酸序列的第34-719位氨基酸有至少99.5%的同一性的氨基酸序列；或(b)由根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸編碼的氨基酸序列。21.根據(jù)權(quán)利要求9或10的多肽用于減小烘焙產(chǎn)品的貯存后硬度的用途，所述烘焙產(chǎn)品含有基于面粉的至少5wt%的糖?！疚臋n編號(hào)】C12N15/00GK104220593SQ201380007360【公開(kāi)日】2014年12月17日申請(qǐng)日期:2013年1月29日優(yōu)先權(quán)日:2012年1月30日【發(fā)明者】魯斯·帕拉尼克瓦申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司