一種包含低聚半乳糖的組合物的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)包含低聚半乳糖的組合物的方法并且涉及照此的包含低聚半乳糖的組合物。
【專利說明】一種包含低聚半乳糖的組合物的生產(chǎn)方法發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種包含低聚半乳糖的組合物以及一種生產(chǎn)它的有效方法。
[0002]背景
[0003]已知人類母乳包含多種不同的低聚糖，將其歸因于母乳喂養(yǎng)嬰兒的一些有益的健康效應(yīng)(Kunz ( 孔茲)等人(2000))。例如，一些低聚糖(如F0S、G0S或菊粉)是所謂的益生元，這意指它們促進胃腸系統(tǒng)的有益細菌并且不利于有害細菌。歸因于其健康促進效應(yīng)，低聚糖經(jīng)常被用于功能性食物產(chǎn)品中，如嬰兒配方以及臨床營養(yǎng)。
[0004]存在多種用于生產(chǎn)低聚糖的途徑。一個途徑基于從天然存在的來源分離低聚糖。低聚果糖(FOS)和菊粉例如天然地發(fā)現(xiàn)于洋姜、牛蒡、菊苣、韭菜、洋蔥以及蘆筍中并且可以分離自這些作物。從菊苣根中制備菊粉例如描述于Frank(弗蘭克)(2002)中。這一用于生產(chǎn)低聚糖的途徑受限于適合的作物的可獲得性并且可能對于更加復(fù)雜的低聚糖的實現(xiàn)是不可能的。
[0005]另一種途徑基于酶催化合成，其中酶類催化低聚糖的合成。Yun(尤恩)(1996)描述了使用具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶并且使用蔗糖作為該酶的底物的低聚果糖的酶催化生產(chǎn)。
[0006]酶催化合成的又一個實例描述于WO 01/90, 317A2中，A2披露了一種使用特定的酶半乳糖苷酶和乳糖作為底物生產(chǎn)具有式Gal-Gal-Glc的低聚半乳糖(GOS)的方法。
[0007]EP 2 138 586 Al披露了在一種糖苷酶的存在下，在至少一種二烷基酰胺的存在下，通過碳水化合物供體分子和糖基受體分子的轉(zhuǎn)糖基作用或水解，用于部位-選擇性制造二糖或低聚糖的工藝。然而，EP 2 138 586 Al沒有披露在孵育的過程中，除去從糖基供體釋放的游離的離去基團。
[0008]WO 2009/113，030Α2描述了一種使用微生物全細胞在具有橫流式中空纖維微濾系統(tǒng)的反應(yīng)器中生產(chǎn)基于純?nèi)樘堑牡途郯肴樘堑墓に?。然而，W02009/113，030Α2不包含任何關(guān)于使用一種與供體不相關(guān)的半乳糖基受體生產(chǎn)雜-低聚半乳糖的教導(dǎo)。
[0009]WO 2012/010，597Α1披露了一種生產(chǎn)包含低聚半乳糖的組合物的方法以及照此包含低聚半乳糖的組合物。然而，WO 2012/010，597Α1沒有披露在孵育的過程中，除去從半乳糖基供體釋放的游離的離去基團。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明的一個目的是提供生產(chǎn)低聚半乳糖，并且特別是具有一個與在生產(chǎn)過程中使用的半乳糖基供體不同的還原端的低聚半乳糖的方法。
[0012]諸位發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)在合成低聚半乳糖的過程中從供體釋放的離去基團充當競爭性半乳糖基受體并且減少上述低聚半乳糖的收率。作為由諸位發(fā)明人進行的初始試驗，已經(jīng)特別出人意料地表明離去基團，并且特別是葡萄糖是弱的半乳糖基受體。此外，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過在半乳糖基供體、半乳糖基受體以及酶β-半乳糖苷酶的孵育過程中從反應(yīng)混合物中除去釋放的離去基團增加上述低聚半乳糖(具有一個與半乳糖基供體不同的還原端)的收率。
[0013]圖1、2和3進行了進一步詳細解釋。
[0014]圖1是在轉(zhuǎn)半乳糖基作用過程中發(fā)生的主要反應(yīng)類型的示意圖。反應(yīng)a)是所希望的反應(yīng)并且涉及半乳糖基基團由供體(在這一實例中是乳糖)轉(zhuǎn)移至受體(例如海藻糖)。這一反應(yīng)的產(chǎn)物是一個游離的離去基團(在這一實例中是葡萄糖)以及一個小的具有一個與半乳糖基供體不同的還原端的低聚糖(例如Gal-Fuc)。
[0015]反應(yīng)b)是一個導(dǎo)致供體的所謂的自我半乳糖基化的不希望的副反應(yīng)，例如如果該供體是乳糖則是進一步被半乳糖基化的乳糖。這一副產(chǎn)物難于從低聚糖產(chǎn)物中除去并且是昂貴的。諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過使用一種具有高的轉(zhuǎn)半乳糖基作用效率(較低的T-值)的第一酶與一個相對較低的半乳糖基供體濃度組合顯著地降低自我半乳糖基化的水平。
[0016]圖1的反應(yīng)c)是諸位發(fā)明人近來發(fā)現(xiàn)的另一個不希望的副反應(yīng)。諸位發(fā)明人已經(jīng)出人意料地在低聚半乳糖組合物中觀察到高水平的別位乳糖并且已經(jīng)得出以下結(jié)論:如果其濃度足夠高，游離的離去基團并且特別是葡萄糖也充當受體。
[0017]圖2是當在孵育過程中未除去游離的離去基團時，存在于低聚半乳糖組合物中的一些分子種類的示意性圖解。除了來源于半乳糖基受體的所希望的低聚糖產(chǎn)物以外，該組合物進一步包含來源于游離的離去基團的半乳糖基化作用的不希望的低聚糖，例如別位乳糖以及進一步被半乳糖基化的別位乳糖。
[0018]圖3是當在孵育過程中除去游離的離去基團時，存在于低聚半乳糖組合物中的一些分子種類的示意性圖解。與示例于圖2中的低聚半乳糖組合物相反，該低聚半乳糖組合物缺乏(或具有至少一個顯著較低濃度的)游離的離去基團、別位乳糖以及來源于別位乳糖的低聚糖。
[0019]因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種生產(chǎn)包括一種或多種低聚半乳糖的組合物的方法，該方法包括以下步驟:
[0020]a)提供一種混合物，該混合物包括
[0021]-一種半乳糖基供體，包括結(jié)合至離去基團的半乳糖基基團，該半乳糖基供體具有至多350g/mol的摩爾量，
[0022]-一種與該半乳糖基供體不同的半乳糖基受體，
[0023]所述半乳糖基受體是一種糖或糖醇，并且
[0024]其中該半乳糖基受體與該半乳糖基供體之間的摩爾比是至少1:10，并且其中該混合物包括至少0.05mol/L的半乳糖基受體，
[0025]b)提供一種第一酶，所述第一酶具有β -半乳糖苷酶活性，所述第一酶與該混合物接觸,并且
[0026]c)孵育該混合物和該第一酶，從而允許該第一酶釋放該半乳糖基供體的離去基團并且將該半乳糖基供體的半乳糖基基團轉(zhuǎn)移至該半乳糖基受體，以此方式形成低聚半乳糖，步驟c)進一步包括從該孵育混合物中(即在孵育過程中)除去從該半乳糖基供體釋放的離去基團，由此獲得包括一種或多種低聚半乳糖的組合物。
[0027]術(shù)語“除去從該半乳糖基供體釋放的離去基團”應(yīng)該被理解為從該孵育混合物中物理除去游離的離去基團和/或?qū)⒂坞x的離去基團轉(zhuǎn)化為一種或多種其他的可以仍存在于該孵育混合物中的化學(xué)物質(zhì)種類。優(yōu)選的是此類化學(xué)物質(zhì)種類不充當半乳糖基受體，或至少它們是比游離的離去基團較不有效的半乳糖基受體。
[0028]本發(fā)明開創(chuàng)了高收率地廉價且有效生產(chǎn)復(fù)雜的低聚半乳糖組合物。本發(fā)明此外似乎減少從半乳糖基供體釋放的游離的離去基團的半乳糖基化作用以及半乳糖基供體的自我半乳糖基化作用，這兩者均形成對于從組合物中除去而言是昂貴的不希望的副產(chǎn)物。
[0029]優(yōu)選地，除了 β -半乳糖苷酶活性以外，該第一酶還具有轉(zhuǎn)半乳糖基化活性。還可以優(yōu)選的是該第一酶具有一個至多0.9的T-值。
[0030]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語一種酶β -半乳糖苷酶的“轉(zhuǎn)半乳糖基化活性”涉及該酶將來自供體分子(例如乳糖分子)的半乳糖基基團轉(zhuǎn)移至非水分子(例如另一個乳糖分子)的能力。
[0031]T-值是將乳糖用作半乳糖基供體和半乳糖基受體兩者的一種酶β_半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)半乳糖基化效率的量度。根據(jù)描述于實例3中的測定和公式確定一種酶β-半乳糖苷酶的T-值。使用以下公式計算T-值:
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)包括一種或多種低聚半乳糖的組合物的方法，該方法包括以下步驟: a)提供一種混合物，該混合物包括 -一種半乳糖基供體，包括結(jié)合至離去基團的半乳糖基基團，該半乳糖基供體具有至多350g/mol的摩爾量， -一種與該半乳糖基供體不同的半乳糖基受體， 所述半乳糖基受體是一種糖或糖醇，并且 其中該半乳糖基受體與該半乳糖基供體之間的摩爾比是至少1:10，并且其中該混合物包括至少0.05mol/L的該半乳糖基受體， b)提供一種第一酶，所述第一酶具有β_半乳糖苷酶活性和轉(zhuǎn)半乳糖基化活性，所述第一酶與該混合物接觸，并且 c)孵育該混合物和該第一酶，從而允許該第一酶釋放該半乳糖基供體的該離去基團并且將該半乳糖基供體的半乳糖基基團轉(zhuǎn)移至該半乳糖基受體，由此形成該低聚半乳糖，步驟c)進一步包括從該孵育混合物中除去從該半乳糖基供體釋放的離去基團，由此獲得包括該一種或多種低聚半乳糖的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該半乳糖基供體的該離去基團是一種糖基基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所 述的方法，其中該半乳糖基供體是乳糖或乳糖醇。
4.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該第一酶具有至多0.9的T-值。
5.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該第一酶包括: -一個相對于SEQ ID N0.2的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列，或-一個相對于SEQ ID N0.2的氨基酸序列Met(I)至Ile (1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列，或 -一個相對于SEQ ID N0.2的氨基酸序列Val (33)至Gly (950)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列，或 -一個相對于SEQ ID N0.2的氨基酸序列Val (33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列，或 -一個相對于SEQ ID N0.2的氨基酸序列Val (33)至Glu(917)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
6.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該第一酶包括一個相對于SEQIDN0.2的氨基酸序列Val (33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
7.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該第一酶包括一個相對于SEQIDN0.2的氨基酸序列Val (33)至Glu (917)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
8.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該第一酶: -相對于示于表1中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性，或 -相對于示于表2中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性，或 -相對于示于表3中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性，或 -相對于示于表4中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性，或 -相對于示于表5中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性，或 -相對于示于表6中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。
9.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法此外包括提供一種微生物，該微生物能夠轉(zhuǎn)化從該半乳糖基供體釋放的游離的離去基團，并且在孵育過程中，允許所述微生物除去從該半乳糖基供體釋放的離去基團。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中 a)該微生物相對于該游離的離去基團的除去速率比該微生物相對于該半乳糖基受體的除去速率至少高10倍， b)該微生物相對于該游離的離去基團的除去速率比該微生物相對于該半乳糖基供體的除去速率至少高10倍，或 c)該微生物相對于該游離的離去基團的除去速率比該微生物相對于單-半乳糖基化的半乳糖基受體的除去速率至少高10倍。
11.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法此外包括提供一種第二酶，該第二酶能夠轉(zhuǎn)化從該半乳糖基供體釋放的游離的離去基團，并且在孵育過程中，允許所述第二酶轉(zhuǎn)化從該半乳糖基供體釋放的離去基團。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該第二酶具有葡萄糖氧化酶活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項所述的方法，其中 a)該第二酶相對于該游離的離去基團的特異性常數(shù)比該第二酶相對于該半乳糖基受體的特異性常數(shù)至少高10倍， b)該第二酶相對于該游離的離去基團的特異性常數(shù)比該第二酶相對于該半乳糖基供體的特異性常數(shù)至少高10倍，或 c)該第二酶相對于該游離的離去基團的特異性常數(shù)比該第二酶相對于該單-半乳糖基化的半乳糖基受體的特異性常數(shù)至少高10倍。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項所述的方法，其中該第二酶具有葡萄糖氧化酶活性并且該半乳糖基供體的該離去基團是葡萄糖。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項所述的方法，其中該方法此外包括提供一種具有過氧化氫酶活性的酶，該酶與該孵育混合物接觸。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中任一項所述的方法，其中該方法此外包括提供一種除去劑，該除去劑能夠除去至少一些通過用該第二酶轉(zhuǎn)化該離去基團而獲得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并且在孵育過程中，允許該除去劑除去至少一些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該除去劑包括一種二價或三價金屬離子的鹽。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該除去劑包括一種陰離子交換材料，或甚至由其組成。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中該陰離子交換材料相對于在孵育過程中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的總量的總結(jié)合力是至少30% (mol/mol)。
20.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中步驟c)包括添加另外的半乳糖基供體。
21.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟c)過程中，將該混合物的半乳糖基供體的濃度維持在一個處于0.01-lmol/L的范圍內(nèi)的濃度。
22.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法此外包括以下步驟:d)富集步驟c)的組合物的低聚半乳糖。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中步驟d)此外涉及從步驟c)的組合物中除去除去劑和/或結(jié)合 至該除去劑的被轉(zhuǎn)化的離去基團。
【文檔編號】C12P19/16GK104136618SQ201380006361
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月25日
【發(fā)明者】漢斯·貝特爾森, 彼得·朗堡·魏謝, 喬恩·韋斯·布希 申請人:阿拉食品公司